CC BY
178
НАПРАВЛЕННАЯ ДОСТАВКА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ
ПРЕПАРАТОВ
С.А. Антипов1, Г.Ц. Дамбаев1, А.Е. Ермаков2,
Т.А. Федущак3, М.А. Уймин2 Экспериментальное обоснование применения магнитоуправляемых липосомальных композитов в противоопухолевом лечении
1ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, Томск 2Институт физики металлов УрО РАН, Томск 3Институт химии нефти СО РАН, Томск
Введение. Использование противоопухолевого препарата в составе магниточувствительных липосом позволяет увеличить цитотоксический эффект и ослабить побочные действия химиотерапии, при этом обеспечив адресное удерживание препарата под воздействием внешнего магнитного поля. Представляется целесообразным использовать наноферромагнетики с неактивной химической поверхностью, в частности, нанопорошки металлов, покрытых защитной пироуг-леродной оболочкой.
Задачи исследования. Получение малотоксичных магниточувствительных инкапсулированных композитов на основе липидных концентратов растительного и животного происхождения, цитостатика и наноферромагнетиков, защищенных углеродной оболочкой, изучение их токсичности, биологической и фармакологической активности.
Материалы и методы. Для создания композита использовали 0,05%-ный раствор цисплатина, липидные концентраты из животного сырья, фосфатидилхо-лин растительного происхождения, нанопорошки Fe, Ni, Co в углеродной оболочке, наноразмерный магниевый феррит MgFe2O4, оксид железа Fe3O4, полученные методом газофазного синтеза.
Для определения токсического воздействия липо-сомальных композитов на клеточную активность биологических тканей были проведены эксперименты in vitro с культурами паренхиматозных клеток селезенки, фибробластов и культуры клеток аденокарциномы Эрлиха, а также исследования in vivo на половозрелых мышах линии C57BL/6.
Результаты. Установлено, что синтезированный композит вызывает сокращение размера аденокарциномы Эрлиха и уменьшение ее относительной массы. Токсическое воздействие липосомального композита на здоровые ткани и органы существенно ниже, чем его компонентов в отдельности.
Выводы. Использование нанопорошка железа с защитной углеродной оболочкой в составе фосфоли-пидного комплекса позволяет повысить противоопухолевый эффект цисплатина и получить малотоксичные органотропные инкапсулированные цитостатиком композиты с регулируемой подвижностью во внешнем магнитном поле. Синтезированный липосомаль-ный композит может быть рекомендован к клиническим испытаниям в процессе комбинированного лечения онкологических больных.
Ю.А. Белый1, А.В. Терещенко1, А.П. Каплун2,
Д.О. Шкворченко3, С.В. Новиков3 Липосомы как средства направленной
доставки лекарственных средств в задний отрезок глаза
1Калужский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова»
2Государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва 3ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва
Цель исследования. Экспериментально изучить возможность применения липосом как средства направленной доставки лекарственных средств в задний отрезок глаза.
Материалы и методы. Проведены 2 серии опытов. В 1-й серии 3 кроликам (6 глаз) породы шиншилла проводили субтотальную витрэктомию и интравитре-ально вводили липосомальную эмульсию коллоидного серебра (1 мл), концентрация липосом: Ag — 5 мг/мл, фосфатидилхолин —7,6 мг/мл. Через 1; 4 и 7 сут после операции глаза энуклеировали, фиксировали в глутаровом альдегиде и исследовали.
Во 2-й серии 2 кроликам (4 глаза) после витрэкто-мии в правый глаз вводили липосомы, содержащие во внутреннем объеме карбоксифлюоресцеин (1 мл), а в левый — водный раствор карбоксифлюоресцеина (1 мл). Кроликов фотографировали сразу и через 36 ч после операции.
Результаты. В 1-й серии опытов наблюдали липо-сомы, сохранившие целостность мембран, внутри они содержали коллоидное серебро и находились преимущественно во внеклеточном пространстве. На 4-е сут субъективно отмечалось уменьшение общего количества липосом, видны стадии пиноцитоза, некоторое количество липосом разрушено. В срок 7 дней наблюдались единичные частично разрушенные липо-сомы, находящиеся преимущественно во внутриклеточном пространстве. Отмечены не потерявшие целостности конгломераты коллоидного серебра, лишенные внешней мембраны. Токсического воздействия на клетки и окружающие ткани не отмечено во все сроки наблюдения.
Во 2-й серии на фотографиях, сделанных сразу после операции, видно свечение флюоресцеина как в водном растворе, так и в липосомах. На 2-е сут флюо-ресцеин в липосомах четко определялся в полости стекловидного тела, а свечение флюоресцеина в водном растворе отсутствовало.
Выводы. Полученные результаты позволяют планировать исследование липосом, содержащих во внутреннем объеме химиотерапевтические, противоопухолевые, противовирусные, нестероидные противовоспалительные, стероидные противовоспалительные препараты для лечения различной патологии заднего отрезка, в том числе внутриглазных новообразований.
Е.Л. Водовозова, Е.В. Моисеева, Н.Р. Кузнецова,
Н.В. Бовин
Противоопухолевое действие липосом, несущих липофильные конъюгаты метотрексата и сиалил-Льюис X,
на мышиной модели Т-лимфолейкоза
Институт биоорганической химии
им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Введение. Доставка лекарств в опухолевые ткани в виде липофильных пролекарств в мембране липосом дает ряд преимуществ по сравнению с инкапсулированием во внутренний водный объем носителя: уменьшается утечка препарата в процессе циркуляции липосом в кровотоке и при взаимодействии с клеткой-мишенью; изменяется механизм проникновения лекарства в клетку и его внутриклеточный трафик, что повышает потенциал преодоления множественной лекарственной устойчивости; упрощается технология приготовления лекарственных липосом. Нами разработаны синтезы пролекарств широко применяемых в клинике препаратов; для увеличения селективности действия (направленная доставка) получены липосо-мы, несущие молекулярные адреса углеводной природы; показано, что липосомы, нагруженные липофиль-ным конъюгатом сарколизина и оснащенные лигандом селектинов тетрасахаридом сиалил-Льюис X (SiaLeX), резко усиливают противоопухолевые свойства сарколизина на мышиной модели рака молочных желез. Селектины - углеводсвязывающие адгезионные белки — опосредуют первоначальные взаимодействия между циркулирующими лейкоцитами и клетками эндотелия; они задействованы в развитии воспалительного ответа, метастазирования и других (пато)физиологических процессах.
Задачи исследования. Изучить противоопухолевое действие липосом, несущих диглицеридный конъюгат метотрексата (MTX-DG) и SiaLe , на модели Т-лимфолейкоза мышей. Экспрессия селектинов на поверхности клеток лимфомы подтверждена с помощью цитофлуориметрии.
Материалы и методы. Экструзионные (100 нм) липосомы состава фосфатидилхолин - фосфатидили-нозит - MTX-DG - конъюгат SiaLeX, 8:1:1:0.2 (мольн.), а также MTX-DG-липосомы без гликоконъюгата, метотрексат (МТХ) или буферный физраствор вводили внутривенно (v. caudalis) мышам A/Sn на 3-и, 5-е, 10-е и 12-е сути после перевивки лимфомы.
Результаты. Во всех леченых группах наблюдалось торможение роста опухоли. По сравнению с контролем (n=3) лечение МТХ (n=5) дало увеличение продолжительности жизни (УПЖ) на 23 %, липосо-мами с MTX-DG (n=6) — на 29 %, SiaLeX-липосомами (n=6) — на 43 % (различия достоверны). Лечение мышей возраста 6 - 7 мес (группы n=6) MTX-DG-липосомами дало лучший результат (УПЖ 25 %), МТХ проявил токсичность (7 %), а SiaLeX-адрес понизил эффективность липосом (УПЖ 2 %) из-за ранней смерти 2 животных.
Выводы. SiaLeX-липосомы с МТХ-DG действуют как на подкожную лимфому, так и на лейкемическую компоненту, фактически приводящую к смерти реципиентов. При лечении старых животных может происходить перенацеливание SiaLeX-липосом на очаги воспаления.
М.Б. Гонгалъский1 , Л.А. Осминкина1,
В. Ю. Тимошенко ,А.А. Кудрявцев ,
В.П. Лавровская2, П. К. Кашкаров 3
Кремниевые нанокристаллы для биомедицинских применений
1МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факулътет, Москва 2Институт теоретической и эксперименталъной биофизики РАН, Пущино 3РНЦ «Курчатовский Институт», Москва
Благодаря своим уникальным свойствам наноматериалы все шире находят применение в различных сфе-
рах деятельности человека. Особое место при этом занимают нанонакристаллические кремниевые материалы. Как известно, кремний — базовый элемент для современной микроэлектроники. Кремниевые нанокристаллы могут быть получены методами химического, электрохимического или плазменного травления, а также термического или лазерного распыления. Кремниевые нанокристаллы, нити и кластеры проявляют весь спектр новых свойств нанообъектов. Так, будучи в возбужденном состоянии, они способны эффективно испускать свет в видимом и ближнем ИК-диапазонах с длиной волны, зависящей от их характерных размеров и состава окружения. Важное свойство наноматериалов на основе кремниевых нанокристаллов с открытой поверхностью (порошков, суспензий, аэрогелей) — весьма развитая (до 1000 м /г) и доступная для молекул окружающей среды внутренняя поверхность, что обусловливает их высокую адсорбционную активность и открывает перспективу для различных практических применений.
Было установлено, что при освещении кремниевые нанокристаллы способны возбуждать находящийся рядом молекулярный кислород, что приводит к генерации так называемого синглетного кислорода. Последний имеет целый ряд перспективных биомедицинских применений, в частности, для фотодинамиче-ской терапии онкологических заболеваний. Действительно, в наших in vitro экспериментах наблюдалось значительное подавление процесса пролиферации раковых клеток. Важно отметить, что после окончания процесса фотодинамической терапии опухолей кремниевые нанокристаллы превращаются в химически инертные наночастицы диоксида кремния, которые являются биодеградируемыми и самовыво-дятся из организма. Важным дополнительным фактором, усиливающим фотодинамическое действие, может стать гипертермический эффект, вызванный локальным разогревом нанокристаллов при фотовозбуждении. Кроме того, кремниевые нанокристаллы размерами 1 - 5 нм, функциализированные соответствующими биомолекулярными поверхностными группами, могут быть использованы как люминесцентные метки, а также как основа наноконтейнеров для направленной доставки лекарств. Все это открывает возможности использования кремниевых нанокристаллов для диагностики и комбинированной терапии опухолей.
Е.Ю. Григоръева, Ю.В. Стукалов, Е.Ю. Колдаева,
А.Ю. Барышников
Конструкции на основе дендримеров нового класса для таргетной радиотерапии онкологических заболеваний
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Для создания препаратов таргетной радиотерапии мы предлагаем использовать конструкции на основе синтезированных нами дендримеров нового класса. В качестве опухолеспецифичных агентов в конструкциях использовались моноклональные антитела и эстрадиол, а терапевтического агента — радионуклид рений-188 (188Re).
Материалы и методы. Токсикологические исследования проводили на мышах линии Balb/c; испытывали дозы в интервале от 150 до 1 500 мг/кг массы тела. Параметры токсикометрии определяли по методу Кер-бера. Для экспериментов на культуре клеток моделями были выбраны линии SKOV-3 (рак яичника) и Jurkat (Т-лимфобластная лимфома). Количество МАТ на лунку — 20 мкл (ICO-25 — 4 мкг/мл, IC0-80 — 10 мкг/мл). Активность 188Re — 0,05 МБк.
Сравнительную терапевтическую эффективность конструкций изучали на мышах nude с подкожно трансплантированной опухолью яичника человека skov-3 и на мышах-самках линии С57В1/6 с подкожно трансплантированной аденокарциномой молочной железы мышей Са 755 при различных количествах терапевтического агента 188Re (0,3 МБк; 1,85 МБк;3,7 МБк;7,4 МБк) на животное.
Результаты. Параметры токсикометрии для денд-римеров нового класса разного химического строения составляют: порог острого действия (Limac) — 250 ^ 550 мг/кг массы тела; максимально переносимой дозы (МПД) - 250 550 мг/кг массы тела; абсолютно смертельной дозы (LD100) - 822 1500 мг/кг массы тела;
среднесмертельную дозу (LD50) - 420 961 мг/кг мас-
сы тела. Таким образом, зона острого токсического действия позволяет использовать данные соединения для создания препаратов-носителей для таргетной терапии онкологических заболеваний.
Проведены испытания билогической активности полученных конструкций на основе дендримеров нового класса разного химического строения. Проведенные исследования на моделях in vitro показали: связывание конструкций (с ICO-25) и 188Re с поверхностными рецепторами клеток линии SKOV-3 приводит к 90 % гибели опухолевых клеток через 1 ч; аналогично, при культивировании клеток линии Jurkat (с IC0-80) и 188Re
— количество погибших клеток через 1 ч достигает 98 %. При изучении конструкций на моделях in vivo наблюдается гибель 94 - 96 % опухолевых клеток. В итоге была подтверждена эффективность таргетной доставки поражающего агента 88Re при помощи созданных нами конструкций как в экспериментах in vitro, так и в экспериментах in vivo и определены оптимальные соотношения компонентов конструкций.
Результатом данных исследований явилось экспериментальное подтверждение высокой противоопухолевой активности созданных конструкций, показаны биологическая безопасность отдельных компонентов системы, высокая степень накопления в опухолях. Полученные результаты подтвердили возможность замены в конструкциях моноклональных антител соединениями, аффинными к рецепторам на поверхности опухолевых клеток, при такой же эффективности конструкций.
О.В. Гунар, А. С. Колбикова Разработка методики испытания препарата «Фотосенс липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 12мг» по показателю «Стерильность»
ФГУНЦ ЭСМП Росздравнадзора, Москва
Введение. Препарат «Фотосенс липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 12 мг» является лекарственным средством (ЛС) нового поколения, включающим в себя липосомы — фосфо-липидные наносистемы для доставки лекарственной формы.
Задачи исследования. Разработка методов контроля препарата «Фотосенс липосомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 12 мг» по основному показателю безопасности — «Стерильность».
Материалы и методы. Препарат «Фотосенс липо-сомальный лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 12 мг» представляет собой окрашенный раствор после приготовления готовой формы. В работе были использованы тест-микроорганизмы: В^иЪйШ ATCC 6633, S.aureus ATCC 6638, E.coli ATCC 25922, P.aeruginosa ATCC 9027, C.albicans NCTC 885-653 и питательные среды, предназначенные для контроля ЛС
по показателю «Стерильность» согласно ГФ XI изд., вып.2., с.187.
Результаты. Для выбора метода посева на питательные среды определяли антимикробное действие препарата в условиях испытания на стерильность в соответствии с методом ГФ XI изд., вып.2., с.187. Для этого в пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и с 10 мл среды Сабуро вносили исследуемый образец препарата в количестве 1мл, 0,5мл, 0,2мл, 0,1мл, что соответствовало разведениям препарата в среде 1:10, 1:20, 1:50, 1:100. Тест-микроорганизмы стандартизовали по стандарту мутности (10 ЕД), разводили до концентрации 10 КОЕ/мл и вносили по 0,1 мл в каждую пробирку с разведенным в питательной среде образцом препарата. Контролем служили пробирки с питательными средами, в которые вместо препарата вносили в соответствующих количествах раствор натрия хлорида 0,9%. Посевы в тиогликолевой среде инкубировали при температуре 33 °С в течение 48 ч, а на среде Сабуро при температуре 22 °С в течение 72 ч. Через 48 ч отмечался типичный рост тест-штаммов во всех пробирках с тиогликолевой средой и через 72 ч со средой Сабуро, что указывает на отсутствие антимикробного действия препарата в условиях испытания его на стерильность. Выполненное исследование доказывает возможность использования метода прямого посева при анализе качества по показателю «Стерильность». Так как препарат окрашен и учет результатов затруднен, через 14 суток инкубации делали пересевы на аналогичные питательные среды, которые инкубировали 4 сут в стандартных условиях.
Выводы Разработанная методика с учетом антимикробного действия ЛС позволяет оценить качество исследуемого препарата по показателю «Стерильность».
Г.Ц. Дамбаев1, С.А. Антипов1, А.Е. Ермаков3,
Т.А. Федущак2, М.А.Уймин3 Перспективы использования магнитоуправляемых липосомальных композитов, инкапсулированных цитостатиком и наноразмерными ферромагнетиками
1ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, Томск 2Институт химии нефти СО РАН, Томск 3Институт физики металлов УрО РАН, Томск
Введение. Использование магнитоуправляемых ли-посом для адресной доставки противоопухолевых препаратов позволит уменьшить побочные действия химиотерапевтических препаратов и управлять их подвижностью посредством внешнего магнитного поля. Представляется целесообразным использование наноферромагнетиков с неактивной химической поверхностью, в частности, нанопорошков металлов, покрытых защитной пироуглеродной оболочкой.
Задачи исследования. Получение малотоксичных магниточувствительных инкапсулированных композитов на основе липидных концентратов растительного и животного происхождения, цитостатика и наноферромагнетиков, защищенных углеродной оболочкой, изучение их токсичности, биологической и фармакологической активности.
Материалы и методы. Для создания композита использовали 0,05%-ный раствор цисплатина, липидные концентраты из животного сырья, фосфатидилхолин растительного происхождения, нанопорошки Fe, Ni, Co в углеродной оболочке, наноразмерный магниевый феррит MgFe2O4, оксид железа Fe3O4, полученные методом газофазного синтеза.
Для определения токсического воздействия липосо-мальных композитов на клеточную активность биологических тканей были проведены эксперименты in vitro
с культурами паренхиматозных клеток селезенки, фиб-робластов и клеток аденокарциномы Эрлиха, а также исследования in vivo на половозрелых мышах линии C57BL/6.
Результаты. Установлено, что синтезированный композит вызывает сокращение размера аденокарциномы Эрлиха и уменьшение ее относительной массы. Токсическое воздействие липосомального композита на здоровые ткани и органы существенно ниже, чем его компонентов в отдельности.
Выводы. Использование нанопорошка железа с защитной углеродной оболочкой в составе фосфолипид-ного комплекса позволяет повысить противоопухолевый эффект цисплатина и получить малотоксичные ор-ганотропные инкапсулированные цитостатиком композиты с регулируемой подвижностью во внешнем магнитном поле. Синтезированный липосомальный композит может быть рекомендован к клиническим испытаниям в процессе комбинированного лечения онкологических больных.
К.Ю. Жижин1, Е.Ю. Матвеев1, Е.Ю. Колдаева2,
Е.Ю. Григоръева2, А.С. Белов3, Я.З. Волошин3,
Ю.Н. Бубнов3, Н.Т. Кузнецов1 Создание новых типов наноразмерных соединений на основе клеточных комплексов металлов и клозо-боратов для адресной доставки бора в клетки опухолей
1Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН, Москва 2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 3Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва
Эффективность 10В-НЗТ определяется локализацией и степенью накопления борсодержащего препарата в злокачественных тканях. Предложенный нами подход адресной доставки бора в опухоли основан на использовании клатрохелатных систем в качестве молекулярной платформы для химического дизайна наноразмер-ных борсодержащих соединений для 10В-НЗТ. Одним из предложенных нами соединений стал полностью модифицированный клозо-боратными фрагментами клатрохелат железа(П).
Соединения этого типа имеют компактную сферическую геометрию и содержат от 62 до 74 атомов. По своим токсикологическим характеристикам эти соединения могут быть использованы для 10В-НЗТ с учетом существующей токсичности: для комплекса (I) МПД — 55 мкг В/г опухолевой ткани; LD100 — 120 мкг В/г; LD50 — 85 мкг В/г. Гидрофильные, транспортные и адсорбционные свойства этих комплексов в широких пределах варьируются путем выбора апикальных заместителей, противоионов и образованием соединений включения с органическими катионами, в частности, гуанидинами, аргенинсодержащими пептидами и бетаинами. Это позволяет реализовать адресную доставку и концентрирование препарата в цитоплазме или клеточных мембранах, включение в состав липосом и связывание с антителами. Наличие интенсивного хромофорного центра (клатрохелатного остова) упрощает изучение распределения, миграции, био- и радиодеградации этих препаратов.
Работы проводилисъ при поддержке РФФИ (№0703-12144).
К.В. Костин, А.В. Ланцова, О.Л. Орлова, Е.В. Игнатъ-ева, Н.А. Оборотова, А. Ю. Барышников
Влияние температуры
на включение лизомустина в липосомы
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Лизомустин — 2-хлорэтилнитрозоуреидо-производное аминокислоты лизин относится к группе нитрозоалкилмочевин (НАМ) и представляет собой смесь 2 изомеров (активного и малоактивного). Препарат синтезирован в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН, в лаборатории разработки лекарственных форм в НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН была предложена липосомаль-ная лекарственная форма лизомустина.
Цель исследования. Добиться максимального включения субстанции лизомустина в липосомы.
Материалы и методы. Лизомустин — смесь изомеров положения нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил)-7-
нитрозо^-гомоцитруллин (I) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо^-гомоцитруллин (II) (ФСП 42-0494003, ООО «АКАДЕМФАРМА»). Липосомальная дисперсия получена в лаборатории разработки лекарственных форм.
Субстанцию лизомустина растворяют в холодном водном растворе криопротектора (+4 °С). Липидную пленку смывают этим раствором до образования липо-сомальной дисперсии. Экструдируют через мини-эструдер с мебранными фильтрами с диаметром пор 200 нм и замораживают при минусовой температуре на 24 ч. Затем очищают липосомальную дисперсию от не включившегося в липосомы лизомустина с помощью метода гель-фильтрации.
Результаты. В результате очистки липосомальной дисперсии методом гель-фильтрации были получены 2 фракции: липосомы с лизомустином и чистый не включившийся в липосомы препарат. На данном этапе исследования с помощью спектрофотометрии было ус-тановленно, что включение препарата в липосомы при использовнии замораживания липосомальной дисперсии составляет 50 %. Это на 20 % превосходит результат без применения заморозки.
Д.М. Лавникевич, Р.Б. Самсонов, Е.И. Якубович,
В.И. Евтушенко
Направленная доставка нуклеиновых кислот в ткани на основе суперпарамагнитных наночастиц
ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий», Санкт-Петербург
Интенсивно развивающимся направлением экспериментальной медицины является разработка невирусных технологий направленной доставки терапевтических нуклеиновых кислот, в частности, противоопухолевых ДНК-вакцин в ткани-мишени. Однако широкое использование невирусных конструктов существенно ограничено низким уровнем их проникновения в ткани-мишени, поэтому существует настоятельная потребность в создании комплекса новых систем высокоэффективной адресной доставки ДНК-вакцин. На сегодняшний день основными направлениями развития систем упаковки и адресной доставки являются фосфо-липидные частицы, липосомы и фуллерены, которые имеют как свои достоинства, так и существенные ограничения для использования в качестве носителей для ДНК-вакцин. Разрабатываемый в ФГУ «РНЦРХТ» подход адресной доставки потенциально терапевтических нуклеиновых кислот основан на использовании в качестве носителей суперпарамагнитных наночастиц, которые несут на своей поверхности обратимо (нековалентно) иммобилизованные нуклеиновые кислоты, что позволяет с помощью внешнего магнитного поля концентрировать их в тканях-мишенях, где они легко проникают в клетки.
Целью работы было создание дешевого биодегради-руемого носителя и разработка эффективного способа адресной доставки различных типов нуклеиновых кислот, включая ДНК-вакцины в ткани-мишени экспери-
ментальных животных. В качестве подхода к решению поставленной задачи использовали суперпарамагнит-ные наночастицы, обладающие уникальным спектром свойств, делающих их перспективными для иммобилизации и адресной доставки всех типов терапевтических нуклеиновых кислот в органы и ткани-мишени. Такими свойствами, позволяющими превратить суперпарамаг-нитные наночастицы в универсальный инструмент доставки нуклеиновых кислот, являются: (1) высокая им-мобилизационная способность суперпарамагнитных частиц в отношении нуклеиновых кислот; (2) возможность иммобилации на частицах всех типов и форм нуклеиновых кислот, используемых для геннотерапевтических целей; (3) компоненты частиц нетоксичны для животных и человека и утилизируются в организме.
Были отработаны условия синтеза суперпарамагнит-ных наночастиц Fe3O4 и оптимизированы условия иммобилизации на них различных типов нуклеиновых кислот. Показано, что иммобилизация нуклеиновых кислот на наночастицах носит нековалентный характер и происходит в течение нескольких секунд в диапазоне рН 6 - 8, при ионной силе 0,05 - 0,5 М. Были подобраны условия для иммобилизации всех основных типов нуклеиновых кислот: плазмидной ДНК (включая экс-прессионные вектора с генами PSA и DUSP9 человека), одно- и двуцепочечной линейной ДНК, РНК и олигонуклеотидов. Важным свойством суперпарамагнитных частиц является то, что они сорбируют нуклеиновые кислоты в широком диапазоне от 12 нуклеотидов до 100 тысяч пар оснований (т.е. от siRNA до сложных плазмидных конструктов).
Таким образом, полученные нами суперпарамагнит-ные наночастицы являются универсальным носителем для всех типов нуклеиновых кислот.
Показана эффективность направленной доставки наночастиц с помощью внешнего магнитного поля в ткани-мишени и динамика экспрессии иммобилизованных на наночастицах экспрессионных векторов с генами человека в тканях мыши.
В.Н. Никифоров1, Н. Чеканова1, Е. Гудилин1,
И.В. Перминова1, Т.А. Соркина1, А.Л Дубов1,
А.Ю. Поляков , И.А. Пресняков , Г.А. Давыдова ,
И.И. Селезнева2, И.П. Суздалев3, Ю.В. Максимов3
Метрологические аспекты и оценка токсичности синтезированных магнитных наночастиц оксида железа
1МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
2Институт теоретической и эксперименталъной биофизики РАН, Пущино
3Институт химической физики РАН им. Н.Н. Семенова, Москва
Наночастицы могут быть совместимы с биологическими объектами и участвовать в решении медицинских задач. Сравнение размеров дает идею использования наночастиц в качестве маленьких зондов, которые позволили бы нам регистрировать ход клеточных процессов, не влияя на их протекание. Для «неразрушающего» контроля они должны быть очень малыми, а именно, наноразмеров и быть покрыты биологическими молекулами для того, чтобы они могли взаимодействовать или связываться с биологическими объектами специфическим образом и обеспечить адресность и управляемость доставки лекарств и «маркировки». Таким образом, размер наночастицы является критическим параметром, определяющим в значительной мере ее свойства. В зависимости от размера могут изменяться свойства наночастиц, такие, как магнитные, токсичность, адсорбционные и многие другие. Следует отметить, что размер наночастицы не является единствен-
ным параметром, определяющим свойства магнитной наночастицы. Необходима полная паспортизация свойств и параметров наночастиц, однако на сегодня есть только 7 российских стандартов по наночастицам, и вопросы метрологического обеспечения наноматериалов остаются крайне актуальными.
Конкурентное преимущество магнитных наночастиц
— магнетизм, позволяющий осуществлять неинвазивное воздействие, неразрушающий контроль при дальнодействии. Магнетизм также может быть полезен в оценке количественных параметров и характеристик магнитных наночастиц.
Синтезированные нами магнитные наночастицы оксидов железа контролировались различными методиками и на различном оборудовании. Для определения параметров наночастиц в наших экспериментах использовались электронная микроскопия, атомносиловая микроскопия, мессбауэровская спектроскопия и рентген. Дополнительно использовались и магнитные методики: ЭПР, ЯМР, SQUID, магнитная атомносиловая микроскопия.
Была показана возможность использования магнитных методов для паспортизации магнитных наночастиц. Полученные различными методами параметры наночастиц находятся в хорошем соответствии друг с другом.
Важнейшее для биомедицинских приложений наночастиц свойство — их токсичность. Оценивалась in vitro токсичность синтезированных наночастиц при использовании их различных покрытий. Обнаружено, что при покрытии магнитных наночастиц оксидов железа рядом химических соединений на основе гумидных кислот получаемые нами наночастицы оксидов железа нетоксичны. На наборе перевиваемых клеточных линий было проведено исследование цитотоксичности препаратов солей гуминовой кислоты. Для анализа были отобраны следующие культуры: МТ-2 и МТ-4 — лимфоциты человека; U-937 — макрофаги человека;BW5147 — лимфоциты мыши; IC-21 — макрофаги крысы; К562 — эритролейке-мические клетки (эритробласты) человека; PLC/PRF/5 — гепатокарцинома (гепатоциты) человека; BHK-21 — почка сирийского хомячка. Показано, что Fe2O3-наночастицы, покрытые гуматами, имеют низкую токсичность (до 20 %) и способны к адсорбции к клеточной мембране и проникновению внутрь клетки, что делает их перспективными для дальнейшего использования.
Н.А. Оборотова
Фармацевтические аспекты создания наноструктурированных лекарственных форм противоопухолевых препаратов
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Благодаря успехам, достигнутым в последние десятилетия, лекарственная терапия опухолей стала актуальным разделом современной медицины. При этом основным направлением в развитии фармацевтической науки является совершенствование избирательности действия биологически активных веществ, в том числе противоопухолевых соединений. Учитывая сложный механизм взаимоотношений в системе «лекарство — организм — опухоль», очевидно, что не может быть универсального средства, дающего лечебный эффект при всех злокачественных новообразованиях. Поэтому продолжается поиск оригинальных лекарственных средств, который базируется на химических, биологических, фармацевтических и клинических исследованиях.
Создание противоопухолевого препарата — сложная многофакторная задача, требующая знания и учета особенностей фармакологического действия исходного лекарственного вещества (ЛВ), его взаимодействия с
физиологическими субстратами организма, тропности к отдельным тканям и органам. Отсутствие достаточной избирательности действия цитостатических препаратов приводит к серьезным осложнениям. При этом высокая неспецифическая биологическая активность ЛВ часто лимитирует его применение в клинике из-за необратимости побочных эффектов. Проявления токсичности способны стать критерием отбора перспективных лекарственных соединений, если не удается подобрать безопасных композиций, способ и режимы введения готовых лекарственных форм (ЛФ).
Одно из направлений повышения эффективности лекарственной терапии опухолей — увеличение избирательности действия на опухолевые клетки новых препаратов и использование современных фармацевтических технологий для разработки систем регулируемого транспорта хорошо известных противоопухолевых соединений. С этой целью широко изучаются коллоидные системы, такие, как микрокапсулы, микросферы, наночастицы, жировые эмульсии, мицеллы, макромолекулярные комплексы и липосомы. Подобные наносистемы способны увеличить растворимость и стабильность лекарственного вещества, повысить избирательность противоопухолевого действия за счет доставки препарата в пораженный орган. Безопасность таких «транспортных» лекарственных систем должна обеспечиваться безопасностью новой композиции ЛФ за счет изменения распределения, фармакокинетики и метаболизма ЛВ.
В процессе создания нано-ЛФ на службу фармацевтической технологии привлекается ряд дисциплин: химия, биофизика, микробиология и т.п. Сложность проблемы обусловлена высокими требованиями, предъявляемыми на всех этапах создания лекарства, к стандартизации технологических процессов и качеству готовой продукции с целью производства безопасных лекарственных препаратов.
Контроль качества разрабатываемых ЛФ — один из основных составляющих компонентов системы их создания. В соответствии с рекомендациями ВОЗ под термином «качество» следует понимать «пригодность лекарственных средств к их рекомендуемому использованию, что определяется: а) их эффективностью и безопасностью для здоровья соответственно указаниям на этикетке или данным, содержащимся в информационных или рекламных материалах; б) соответствием лекарственных средств спецификациям, касающимся идентичности, содержания, чистоты и других характеристик». Совокупность фармакопейных показателей в сочетании с объективными методами контроля — в настоящее время единственное средство, гарантирующее возможность медицинского применения разрабатываемых нанолекарств.
Вопросы разработки, стандартизации и контроля качества нано-ЛФ остаются актуальными как на международном, так и национальном уровне. Это обусловлено рядом причин, в том числе вовлечением в сферу производства лекарственных средств исследователей, не занимавшихся ранее фармацевтическими разработками. В настоящее время сложилась ситуация, при которой все более углубляется разрыв между отдельными исследованиями в области получения нанопрепаратов и созданием новых высокоэффективных методов фармацевтического и биологического анализа для их оценки. В настоящее время в действующих фармакопеях не отражена мировая тенденция развития технологий и фармацевтического анализа наноструктурированных препаратов, нет унификации испытаний и гармонизации норм для наноструктур как для лекарственных препаратов.
В современных условиях доверие к исследованиям по созданию нанопрепаратов может быть достигнуто
повышением уровня их стандартизации. Роль вспомогательных веществ, используемых в качестве «носителя» препарата, в обеспечении безопасности и эффективности ЛФ не уступает значимости основного действующего вещества. Их применение позволяет существенно расширить ассортимент ЛФ с различной заданной степенью доступности. Известно, что международные фармацевтические организации (ICH, EC, FDA) предложили отнести вспомогательные вещества наряду с фармацевтическими субстанциями к особой градации веществ «для фармацевтического применения» и контролировать их качество по соответствующим фармакопейным статьям. Одно из требований к составу ЛФ — функциональная обоснованность применения тех или иных химических и биологических материалов.
В наших исследованиях наноструктурированные «носители» использованы в следующих направлениях: солюбилизация гидрофобных соединений путем включения их в мицеллы или липидную мембрану липосо-мы при разработке парентеральной лекарственной формы; изменение фармакокинетики водорастворимых лекарственных веществ путем включения их во внутреннее пространство липосомы.
Получены коллоидные лекарственные системы, пригодные для всех способов введения, в том числе внутривенного, что значительно расширят терапевтические возможности испытуемых ЛВ.
Проведенные нами технологические и химикофармацевтические исследования позволяют производить стандартные и воспроизводимые серии наноструктури-рованных ЛФ (липосомальных и мицеллярных противоопухолевых препаратов) для углубленного доклинического изучения. В процессе создания нано-ЛФ нами сформулированы методические подходы к разработке, а также выбору критериев и методов оценки качества инъекционных ЛФ растворимых и нерастворимых в воде противоопухолевых субстанций. Получены фармацевтические, биологические и химико-аналитические данные для оценки стандартности созданных нано-ЛФ и последовательной передачи их на доклинические, клинические исследования, а также для внедрения готовых препаратов в производство
А.В. Рябова1’2, С.Ю. Василъченко1,2, П. Грачев1’2,
Д.И. Косарев ’2, В.Б. Лощенов1,2, В.И. Конов1,
А.Е. Ермаков3
Динамика спектров диффузного рассеяния металл-углеродных нанокомпозитов (Ni, Fe2O3, Al@C) в эксперименте
ЦЕНИ ИОФ РАН, Москва 2ЗАО «Биоспек», Москва 3ИФМ УрО РАН, Екатеринбург
Проведены исследования по накоплению и выведению наночастиц Ni, Fe2O3 и Al, покрытых углеродом (распределение по органам в зависимости от концентрации и размеров наночастиц), а также оценено общее токсическое действие наночастиц в виде суспензий на организм (лабораторные мыши BALB). Данные наночастицы благодаря углеродной оболочке имеют высокий коэффициент поглощения в видимом и, что особенно важно, красном и ближнем инфракрасном диапазонах спектра, где биологические ткани наиболее прозрачны. Вследствие этого концентрация нанокомпозитов в биотканях оценивалась при измерении и анализе спектров диффузного рассеяния. Исследуемые ме-талл-углеродные системы показали низкую общую токсичность при внутривенном введении. Наиболее токсичны наночастицы алюминия, затем по токсичности следуют наночастицы никеля. Наночастицы железа
приводят к гибели животных лишь при сверхвысоких дозах, видимо, вследствие изменения реологических свойств крови при однократном системном введении. Также обнаружена высокая селективность накопления наночастиц в опухоли (через сутки после внутривенного введения накопление препарата в опухоли в 6 - 7 раз превышало его содержание в окружающих нормальных тканях) при функционализации биополимерами. Показано, что наиболее перспективным образцом с точки зрения фармакокинетических свойств являются наночастицы железа, покрытые углеродом. В исследованиях на клеточной культуре опухоли молочной железы (линия SkBr3) наибольшая цитотоксическая активность наблюдалась у наночастиц железа. Однако имеются нелинейные зависимости от концентрации, которые должны быть учтены в дальнейших исследованиях. Для более детальной оценки необходимы дополнительные исследования на различных линиях опухолевых и нормальных клеток. Также показано, что для наночастиц алюминия концентрационная зависимость подавления роста была самой низкой, а для наночастиц железа — самой ярко выраженной.
Работа проведена при поддержке Правителъства Свердловской области.
Д.В. Соколова, М.А. Рубцова, М.А. Кортава, К.В. Костин, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников Иммунолипосомы — средство направленной доставки противоопухолевых препаратов
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Несмотря на значительные достижения современной онкологии, проблема повышения эффективности методов воздействия на злокачественные новообразования остается крайне важной. Применение цитостатиков для лечения злокачественных новообразований ограничено их высокой общей токсичностью, метаболической неустойчивостью в организме и плохим проникновением в раковую клетку.
Один из способов, позволяющих уменьшить побочное действие на нормальные клетки и увеличить терапевтический эффект лекарственных средств, — доставка препаратов с помощью иммунолипосом.
Доставка лекарственного препарата с помощью им-мунолипосом представляет собой технологию, которая может быть использована для направленного воздействия на органы и ткани. Иммунолипосомы представляют собой липосомы, модифицированные моноклональными антителами (МКА). МКА обеспечивают специфическое связывание липосом с антигенпозитивными клетками, а липосомы несут соответствующий гидрофобный или гидрофильный химиотерапевтический препарат.
В РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН разработана методика получения анти-CD5 иммунолипосом с противоопухолевыми препаратами доксорубицин, тиосенс и лизомустин.
Показана способность иммунолипосом специфически связываться c антигеном CD5, экспрессированным на клетках линии Jurkat (T-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека) in vitro. Эффективность связывания ан-ra-CD5 иммунолипосом с МКА IC0-80, нагруженных доксорубицином, с клетками Jurkat составляла 100 %.
Проведен цитостатический анализ (МТТ-тест) полученных иммунолипосомальных форм противоопухолевых препаратов. Согласно полученным результатам цитотоксический эффект иммунолипосомального док-сорубицина коррелирует с таковым для традиционной формы препарата в проверенных терапевтических дозах. LD50 (концентрация препарата, при которой гибнет 50 % клеток) лизомустина составляет 7,8 х 10-6
моль или 2,11 мг. Липосомы с лизомустином оказывают цитотоксическое действие, но уровень LD50 при исследуемых концентрациях не достигается. Иммуно-липосомы, нагруженные лизомустином, оказывают ци-тотоксическое действие, соизмеримое с действием традиционной формы препарата. Иммунолипосомальный анти-CD5 тиосенс оказывает больший цитотоксиче-ский эффект по сравнению с липосомальной формой препарата в отношении клеточной линии Jurkat — LD50 для иммунолипосомальной формы составила 0,03 мг/мл, тогда как LD50 для липосомальной формы составила 0,1 мг/мл.
А.В. Соснов1, М.В. Киселевский2, Н.Ю. Анисимова2,
А.А. Gakh3, И.Н. Станъков1, С.В. Садовников1
Использование наномолекул для создания систем доставки лекарств
1Исследователъский институт химического разнообразия, Химки, Московская область 2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 3Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA
Создание систем доставки лекарств на основе наномолекул — один из подходов к созданию улучшенных противоопухолевых препаратов. В настоящее время использование наномолекул для создания новых противоопухолевых препаратов реализуется по 2 основным направлениям: синтез новых наномолекул, содержащих ковалентно связанное действующее вещество, и создание наночастиц, включающих действующее вещество без образования ковалентных связей с наномолекулой-носителем. Данный подход позволяет увеличивать эффективность за счет оптимизации размера, формы и свойств поверхности наночастицы (пассивный таргетинг), защиты от биодеградации и неспецифического связывания. Включение векторов позволяет существенно улучшить специфичность (активный таргетинг). Селективно взаимодействуя с опухолевой клеткой, данные наномолекулы или наночастицы выделяют лекарственные и вспомогательные средства. Неактивная часть коньюгата биодеградирует и/или выводится из организма. Коньюгаты, в свою очередь, могут быть объединены в кластеры с приданием им дополнительных полезных свойств (увеличение растворимости и биодоступности, органо- и/или ткане-специфичность и др.).
В рамках данного подхода к созданию препаратов с улучшенными свойствами нами получены индивидуальные наноразмерные молекулы-коньюгаты активных ингибиторов пролиферации опухолевых клеток, а также клатраты на основе альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов и других наномолекул.
Наномолекулы и наночастицы были протестированы на антипролиферативную активность в отношении различных типов опухолевых клеток. В результате исследований показано: некоторые наномолекулы, способные к эффективной биодеградации с выделением активных веществ, обладают повышенной способностью ингибировать пролиферацию опухолевых клеток относительно входящих в их состав низкомолекулярных веществ; клатраты активных веществ с циклодекстринами в ряде случаев показывают весьма значительное усиление антипролиферативной активности in vitro (на порядок и более) по сравнению с действием индивидуальных веществ; увеличение антипролиферативной активности наблюдается в отношении различных линий опухолевых клеток.
Дальнейшие исследования будут включать расширение спектра используемых активных противоопухолевых препаратов и наномолекул-носителей; оценку возможности комбинации в одной частице веществ с взаимодополняющими механизмами действия, оценку
НAПPABЛEННAЯ ДOCTABKA ПPOTИBOOПУXOЛEBЫXПPEПAPATOB
11
возможности создания кластеров активных наномолекул, разработку оригинальной тест-системы in vitro; исследование молекулярных и клеточных механизмов, отвечающих за увеличение активности.
Частъ исследования выполнена в рамках международной программы Discovery Chemistry Project/Prostate Cancer Chemotherapy (проект МНТЦ 3548р).
Е.В. Тазина, А.П. Полозкова, Е.В. Игнатъева,
О.Л. Орлова, Н.А. Оборотова
Выбор оптимального соотношения препарат/липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Цель исследования. Выбор оптимального весового соотношения препарат/липиды для максимальной загрузки доксорубицина (Докс) в термолипосомы (ТЛ) и получения агрегационно устойчивого препарата.
Материалы и методы. ТЛ получали из 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), пегили-рованного 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтанол-
амина (DSPE-PEG-2000 аммониевая соль) и холестерина в молярном соотношении 9:1:0,02:0,2. Экструзию ТЛ проводили через поликарбонатные мембраны (Whatman) с размером пор 200 нм при 50 °C с помощью ручного мини-экструдера Avanti Mini-Extruder. Докс загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония при 50 °C в течение 1 ч. Весовое соотношение препарат/липиды составляло: 0,13:1; 0,20:1; 0,30:1; 0,40:1; 0,50:1; 0,60:1; 0,70:1. Для очистки Докс-ТЛ от невключившегося Докс использовали метод гель-фильтрации на хроматографической колонке C 10/20, заполненной сефадексом G 50 (Amersham Biosciences). Эффективность включения Докс в ТЛ оценивали спектрофотометрически при длине волны 252 нм. Диаметр везикул измеряли на приборе Nicomp-380 Submicron Particle Sizer.
Результаты. Размеры везикул и включение Докс в ТЛ при разных весовых соотношениях препарат/липиды представлены в табл. __________________
Весовое соотношение препарат/липиды Диаметр везикул, нм Включение Докс в та, %
0,13 1 165 і 10 87,0 - 94,0
0,20 1 155 і 5 87,2
0,30 1 165 і 10 93,6
0,40 1 169 і 4 93,5
0,50 1 210 і 5 88,6
0,60 1 181 і 9 86,0
0,70 1 180 і 10 83,0
Выводы. Как видно из таблицы, включение Докс в ТЛ оставалось высоким при весовых соотношениях препарат/липиды от 0,13:1 до 0,6:1. Однако агрегаци-онная устойчивость Докс-ТЛ при увеличении весового соотношения препарат/липиды от 0,30:1 до 0,70:1 снижалась. Поэтому для получения агрегационно устойчивого препарата с наибольшим включением Докс в ТЛ могут быть предложены весовые соотношения препарат/липиды 0,13:1 и 0,20:1.
Е.В. Тазина, А.П. Полозкова, Е.В. Игнатьева,
О.Л. Орлова, Н.А. Оборотова Изучение влияния криопротекторов на включение доксорубицина в термочувствительные липосомы
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Важный аспект создания липосомаль-ных препаратов — их стабильность во время хранения. Один из способов повышения стабильности ли-посом — лиофилизация с добавлением соответствующего криопротектора, который препятствует
интеграции везикул и вытеканию инкапсулированного вещества.
Цель исследования. Изучение влияния различных криопротекторов на включение доксорубицина (Докс) в термолипосомы (ТЛ) после замораживания и лио-филизации.
Материалы и методы. ТЛ получали из фосфолипидов, пегилированного фосфолипида и холестерина методом обращения фаз. Докс загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. В качестве криопротекторов использовали: 4%-ный раствор сахарозы; 1,9%-ный раствор сахарозы + 1,3%-ный раствор мочевины; 3%-ный раствор декстрана 10 000; 4%-ный раствор глюкозы; 2%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) 2000; 2%-ный раствор сахарозы + 1%-ный раствор дек-страна 40 000; 2%-ный раствор сахарозы + 1%-ный раствор ПЭГ 2000. Для разделения Докс-ТЛ от невк-лючившегося Докс использовали метод гель-фильтрации на хроматографической колонке, заполненной сефадексом G 50. Содержание Докс в ТЛ определяли спектрофотометрически при длине волны 252 нм. Докс-ТЛ замораживали в холодильнике до температуры -18 °С. Лиофилизацию препарата проводили в сублимационной сушке Minifast БО.2, замораживая его в камере установки до температуры -40 - -45 °С.
Результаты. Включение Докс в свежеприготовленные ТЛ, а также после процессов замораживания и лиофилизации представлены в табл.__________________
Криопротектор Включение Докс, %
Свежеприготовленные та После замора- живания После лиофи- лизации
4 % сахароза 88 86 73
1,9 % сахароза + 1,3 % мочевина 86 59 52
3 % декстран 10 000 70 агрегация Докс-TH
4 % глюкоза 75 68 47
2 % ПЭГ 2000 77 5 агрега- ция Докс-та
2 % сахароза + 1 % декстран 40 000 80 62 27
2 % сахароза + 1 % ПЭГ 2000 74 - 45
Выводы. Как видно из таблицы, после замораживания и лиофилизации наименьшее количество Докс вытекало из ТЛ с использованием в качестве криопротектора 4%-ного раствора сахарозы, поэтому данный криопротектор был выбран как наиболее оптимальный для замораживания и лиофилизации Докс-ТЛ.
Работа выполнена в рамках программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса».
Е.В. Тазина, В.В. Мещерикова, Е.В. Игнатъева,
А.А. Вайнсон, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников Повышение противоопухолевой активности доксорубицина с помощью термочувствительных липосом
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Одним из методов повышения эффективности противоопухолевой терапии является использование термочувствительных липосом (ТЛ) в комбинации с локальной гипертермией (ГТ). При температуре фазового перехода фосфолипидов из геля в жидкокристаллическое состояние в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный цитостатик проникает в окружающую среду.
Цель исследования. Оценка противоопухолевого действия ТЛ с доксорубицином (Докс) in vitro и in vivo в комбинации с ГТ.
Материалы и методы. ТЛ получали методом обращения фаз из 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), холестерина и пегилированного
1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DSPE-PEG-2000). В качестве антиоксиданта использовали а-токоферола ацетат. ТЛ экструдировали через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм. Докс загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. Для стабилизации Докс-ТЛ проводили их сублимационную сушку. Диаметр везикул измеряли на приборе Nicomp-380 Submicron Particle Sizer. Докс-ТЛ очищали от невключившегося препарата методом гель-фильтрации. Эффективность действия Докс-ТЛ оценивали по сравнению со свободным Докс. In vitro Докс-ТЛ и свободный Докс вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 3-15 мкг/мл Докс, а в суспензию клеток китайского хомячка V-79
— в дозе 10 мкг/мл Докс. Суспензии клеток с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °C или 42,5 °C. In vivo действие препаратов оценивали на меланоме В-16 и карциноме Эрлиха линии ELD, привитых самкам мышей в мышцу голени. Докс-ТЛ и свободный Докс вводили животным в ретроорбитальный синус в дозах 9 и 4,5 мг/кг Докс. ГТ голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате при температуре 43 °C в течение 30 мин.
Результаты. По разработанной технологии получен препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Включение Докс в ТЛ составило 88 - 94 % (диаметр везикул — 170 ± 10 нм). В условиях ГТ Докс-ТЛ значительно увеличивали гибель как клеток меланомы B-16, так и клеток китайского хомячка V-79. In vivo время удвоения объема меланомы B-16, подвергнутой воздействию ГТ на фоне введения свободного Докс в дозе 9 мг/кг, составило 9 дней, а после введения Докс-ТЛ в дозах 4,5 и 9 мг/кг в комбинации с ГТ время удвоения объема опухоли увеличилось до 12 и 16 дней соответственно. В группе мышей, которые подвергались воздействию ГТ на фоне введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг, 50 %-ная выживаемость составила 34 дня, а в группе мышей, которым вводили Докс-ТЛ в дозе 4,5 мг/кг + ГТ, — 29 дней. Наименьшую скорость роста карциномы Эрлиха линии ELD и наибольшую выживаемость животных наблюдали в группе, которой провели ГТ спустя 15 - 20 мин после введения Докс-ТЛ.
Выводы. Термолипосомальный Докс в комбинации с ГТ менее токсичен и более эффективен по сравнению
со свободным Докс при воздействии на опухолевые клетки и солидные опухоли.
Чан Тхи Хай Иен1, А.П. Полозкова2, Е.В. Тазина2,
В.М. Печенников1, Н.А. Оборотова2, А.П. Арзамасцев1 Разработка технологии получения липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора фотодитазина
1ММА им. И.М. Сеченова, Москва 2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. В последние годы широко изучаются ли-посомы как средство доставки фотосенсибилизаторов с целью повышения эффективности фотодинамической терапии и снижения токсичности препаратов. В настоящее время выпускается и используется в клинике липосомальная лекарственная форма фотосенсибилизатора — производного хлорина e6 — Визудин (Visudyne, Novartis, США). Концентрат фотодитазина с концентрацией 5мг/мл (Вета-гранд, Россия), являющийся отечественным фотосенсибилизатором второго поколения группы хлорина e6, применяется в фотоди-намической терапии рака кожи и легких.
Цель исследования. Разработка технологии получения липосомального водорастворимого фотосенсибилизатора фотодитазина.
Материалы и методы. Липосомы получали методом обращения фаз из лецитина (EPCS1080030-2/165 Lipoid Germany), холестерина (Avanti Polar Lipids) и дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000, Lipoid, Germany). Липидную пленку смывали водным раствором фотодитазина c концентрацией 2,5 мг/мл. Экструзию липосом проводили через поли-карбонатные мембраны (Whatman) с размером пор 200 нм с помощью ручного мини-экструдера Avanti MiniExtruder. Размер липосом измеряли на приборе Nicomp-380 Submicron Particle Sizer (США). Липосомальную дисперсию очищали от невключившегося препарата на хроматографической колонке C 10/20 (GE Healthcare, Великобритания) методом гель-фильтрации. Включение фотодитазина в липосомы определяли спектрофотометрически при длине волны 662 нм.
Результаты. Полученная лекарственная форма фо-тодитазина представляла собой липосомальную дисперсию темно-зеленого цвета. Размер везикул после экструзии составил 196 - 210 нм. Включение фотодита-зина в липосомы составило 45,4 %.
Выводы. Необходимы дальнейшие исследования по выбору оптимального состава и совершенствованию технологии для увеличения эффективности включения препарата в липосомы.
