Нанотехнологии Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

НАНОТЕХНОЛОГИИ

Д. А. Безруков1, А. И. Королева1, А. П. Каплун1, О. Л. Орлова2 ОЦЕНКА ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА ИЗ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ

1 Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова 2ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Одним из перспективных методов доставки лекарственных препаратов являются липосомы. Для повышения эффективности высвобождения действующего вещества из носителя разрабатываются термочувствительные липосомы, высвобождающие лекарственное вещество в нагреваемых тканях.

Цель исследования. Оценка динамики высвобождения доксору-бицина из стерически стабилизированных термочувствительных ли-посом при температуре фазового перехода липидной композиции и ниже.

Материалы и методы. Для получения липосом использовали ди-пал ьмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), пегелированный дистеароилфосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) фирмы Lipoid; яичный фосфатидилхолин (ePC) (Биолек); холестерин (Chol) (Sigma); сульфат аммония (Химмед, х.ч.). Все вещества соответствовали нормативной документации и использовались без дополнительной очистки.

Включение доксорубицина в термочувствительные (DPPC:DSPC:DSPE-PEG-2000:Chol 9:1:0,02:0,2 (мольн.)) и обычные липосомы (ePC:DSPE-PEG-2000:Chol 10:0,02:0,2 (мольн.)) проводили против градиента сульфата аммония. Моноламеллярные липосомы получали экструзией через поликарбонатные мембраны (Watman) с размером пор 200 нм. Интенсивность флюоресценции доксорубицина измеряли на спектрофлюориметре Cary Eclipse (Varian, США). Липосомы получали с концентрацией доксорубицина внутри выше концентрации самотушения флюоресценции для того, чтобы фиксировать высвобождение субстанции по возрастанию флюоресценции. Дисперсию липо-сом термостатировали при температуре 37 °C или 43 °C и измеряли изменение флюоресценции (Ex/Em 475/590) во времени.

Результаты. Для термочувствительных липосом увеличение флюоресценции через 10 мин при 43 °C в 4 раза превышало изменение флюоресценции при 37 °C. Флюориметрическое количественное определение высвободившегося доксорубицина затруднено рассеянием света в липосомальной дисперсии, а также тем, что доксорубицин, по-видимому, частично ассоциирован с поверхностью бислоя липосом. Определение остаточного количества док-сорубицина с помощью колоночной гель-хроматографии показывает, что при нагревании до 43 °С данные термочувствительные липосомы через 10 мин высвобождают около 30 % загруженной субстанции. Для нетермочувствительных липосом скорость и степень высвобождения доксорубицина при 37 °С и 43 °С существенным образом не отличалась.

Разработка поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Госу дарственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

Д. А. Безруков1 , А. И. Королева1, А. П. Каплун,1 О. Л. Орлова,2 Е. В. Игнатьева2,

А. В. Ланцова2, Н. А. Оборотова2 МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЛИПОСОМ С АКТИВНОЙ ЗАГРУЗКОЙ ДОКСОРУБИЦИНОМ

1Московская государственная академия

тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

2ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН на протяжении многих лет ведутся поиски новых средств доставки противоопухолевых препаратов. В качестве новой лекарственной формы доксоруби-цина (DOX) нами предложены длительноциркулирующие термочувствительные липосомы с активной загрузкой DOX рН-градиентным методом. С целью повышения загрузки препарата в липосомы разработана модификация метода получения термочувствительных стери-чески стабилизированных липосом с активной загрузкой против градиента сульфата аммония.

Материалы и методы. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), пегелированный дистеароил-фосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) фирмы Lipoid; холестерин (Chol) (Sigma); сульфат аммония (Химмед, х.ч.). Все вещества соответствовали нормативной документации и использовались без дополнительной очистки.

Результаты. В ходе исследования подбирались оптимальные условия для получения стерически стабилизированных липосом (DPPC:DSPC:DSPE-PEG-2000:Chol 9:1:0,02:0,2), активно загруженных доксорубицином против градиента сульфата аммония. Показано, что при формировании первоначальной дисперсии мультиламелляр-ных везикул путем удаления смешивающегося с раствором сульфата аммония спирта, в котором вносятся необходимые липиды, остаточные количества спирта неконтролируемым образом снижают степень загрузки субстанции и стабильность липосомальной дисперсии в целом. Поэтому липидную пленку получали упариванием на роторном испарителе раствора липидов в хлороформе и высушивали под вакуумом для максимального удаления органического растворителя. Далее при 50 °С пленку гидратировали 250 мМ раствором сульфата аммония и экструдировали при нагревании через поликарбонатные мембраны (Watman) с размером пор 200 нм. Необходимый для загрузки градиент концентрации сульфата аммония формировался 20-кратным разбавлением дисперсии моноламеллярных липосом 10 мМ буфером HEPES (с использованием в качестве криопротектора 5%-ного раствора лактозы). Загрузку проводили при 50 °С и перемешивании в течение 1 ч. Наилучшие значения степени загрузки DOX получены для pH 8,4. Использование для создания градиента существенно более трудоемких методов, основанных на удалении не включившейся в липосомы соли, таких, как гель-фильтрация и диализ, не дает для липосом данного состава преимущества по сравнению с предложенным.

Полученные по разработанной методике липосомы стабильны в течение нескольких суток, имеют степень включения доксорубицина в липосомы до 85 % и размер 230-250 нм.

Работа поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

Е. Л. Водовозова, Н. Р. Кузнецова,

Г. П. Гаенко, Юл. Г. Молотковский ЛИПОСОМЫ С ЛИПИДНЫМ КОНЪЮГАТОМ МЕТОТРЕКСАТА: СТАБИЛЬНОСТЬ ПРИ ХРАНЕНИИ И АКТИВНОСТЬ В КУЛЬТУРЕ МЕТОТРЕКСАТ-РЕЗИСТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА

Институт биоорганической химии им. акад. М. М.Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

Введение. Эффективность применения метотрексата (МТХ) ограничивается развитием клеточной устойчивости, связанной с нарушением импорта МТХ в клетку из-за понижения активности белка-транспортера восстановленного фолата (RFC). Включение лекарств в липосомы в виде липидных биодеградируемых производных позволяет уменьшить системную токсичность и преодолеть резистентность клеток, обусловленную трансмембранным переносом.

Задачи исследования. Изучить способность синтезированного нами диглицеридного конъюгата МТХ (МТХ-БО) встраиваться в мембрану липосом, предназначенных для системного введения, и возможность получения липосомальных препаратов длительного хранения. Сравнить цитотоксичность указанных липосом в культурах клеток лейкемии человека, обладающих различной чувствительно -стью к МТХ.

Материалы и методы. Липосомы получали экструзией суспензий смесей яичный фосфатидилхолин - фосфатидилинозит («анти-опсонизирующий» липид) - МТХ-БО, 8:1:1 (мольн.), в буферном растворе через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм. Размеры и степень агрегации липосом определяли с помощью динамического лазерного светорассеяния и электронной микроскопии, состав - с помощью гель-хроматографии, анализируя смешанные с этанолом фракции на фосфолипиды колориметрическим методом, на МТХ-БО - УФ-спектрофотометрически (£300 = 25000). Дисперсии замораживали (-196 °С), хранили неделями (-20 °С), размораживали и обрабатывали 5 мин на ультразвуковой (УЗ) бане. Цитотоксическую активность в культурах клеток Т-лимфобласто-идной лейкемии линии СЕМ-ССИР и МТХ-устойчивой сублинии СЕМ/МТХ определяли стандартно для антифолатов по включению трипанового синего.

Результаты. 1. МТХ-БО полностью включался в липосомы диаметром 126±30 нм. 2. После размораживания липосомы регенерировали размеры; агрегации не наблюдалось даже без УЗ-обработки; МТХ-БО из мембраны липосом не выделялись. 3. Для МТХ 1С50 16,4±4,9 и 0,075±0,005 мкМ в культурах СЕМ/МТХ и СЕМ-ССйР соответственно; для липосом с МТХ-БО - 3,8±1,9 и 0,77±0,06 мкМ, т.е. резистентность уменьшилась в 43 раза (данные 2 независимых экспериментов в 2 повторах).

Выводы. 1. Дисперсии липосом, содержащие релевантные для IV-введения концентрации МТХ-БО, можно длительно хранить. 2. Переход от МТХ к липосомальной форме МТХ-БО позволяет преодолеть устойчивость клеток, связанную с дефицитом КРС.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 06-04-49432).

С. И. Воробьев

НАНОНОСИТЕЛИ НА ОСНОВЕ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНЫХ ЭМУЛЬСИЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ

Московская государственная академия

тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, Москва

Наноносители на основе перфторуглеродных эмульсий медикобиологического назначения - это прямые, концентрированные, высоко- и свободно-дисперсные, гетерогенные термодинамически неустойчивые коллоидные системы, обладающие избыточной свободной энергией и огромной сорбционной поверхностью (поверхность раздела фаз), в которых дисперсная фаза - нерастворимых монодисперс-ных наночастиц перфторуглеродов покрыта поверхностно-активным эмульгатором и находится в дисперсной водной структурированной среде во взвешенном состоянии. Сорбционная поверхность 1 л 20%-ной эмульсии перфторуглеродов составляет 12 тыс. м2. Перфторэ-мульсии являются универсальными наноносителями, способными проникать в любые участки организма и отдельного органа и активно влиять на них, транспортировать на своей поверхности не только любой газ и органические соединения, но и механические частицы, маркеры, активные фармакологические элементы, действующие активные вещества и т.д. Высокодисперсные наносистемы на основе пер-фторуглеродных эмульсий занимают промежуточное положение между макроскопическими гетерогенными системами и молекулярными растворами - гомогенными системами. Высокодисперсные системы термодинамически неравновесны и требуют для своего существования специальной стабилизации - эмульгации с помощью специальных гомогенизаторов и эмульгаторов. Термодинамическая неустойчивость лиофобных систем связана с большим запасом свободной поверхностной энергии на огромной межфазной поверхности. Наличие большой поверхностной энергии обусловлено коллоидным состоянием, а именно, высокой дисперсностью субмикронных эмульсий, полученных диспергационным способом. Диспергирование или разрыв перфторуглеродов на субмикронные частицы (наночастицы) можно рассматривать как процесс образования новых сорбционных

поверхностей, способных выполнять транспортную роль различных веществ и газов. Перфторуглеродные наноносители - относительно монодисперсные эмульсии (более 85 % частиц находятся в пределах до 100 нм), с узким распределением дисперсии, максимальным диаметром частиц не более 250 нм (0,1 %) и средним диаметром частиц не более 50-80 нм.

Л. Г. Гатинская, Е. В. Игнатьева, Н. А. Дмитричева,

Б. С. Кикоть, И. В. Ярцева КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИОСЕНСА В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

В лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН с целью улучшения фото сенсибилизирующих свойств тиосенса получено несколько моделей его лиофилизирован-ной липосомальной лекарственной формы (ЛЛФ).

Задачей настоящего исследования явилась разработка методики количественного определения тиосенса в полученных моделях ЛЛФ. Для этого был использован метод спектрофотометрии в видимой области. При работе с субстанцией тиосенса было показано, что положение максимума в спектре не фиксировано и сильно зависит от условий съемки. Наиболее воспроизводимые результаты были получены при работе с хлороформно-спиртовыми растворами. Содержание тиосенса в ЛЛФ определяли в самом интенсивном максимуме поглощения при 717±4 нм. Было установлено, что интенсивность поглощения хлороформно-спиртовых растворов ЛЛФ препарата в интервале от 712 до 724 нм подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера в необходимом диапазоне концентраций от 1,33 мкг/мл до 3,33 мкг/ мл в пересчете на тиосенс. Исследование влияния вспомогательных веществ, входящих в состав ЛЛФ, показало, что они не имеют собственного поглощения, но влияют на положение аналитического максимума в спектре основного вещества. Обычно наблюдается его батохромный сдвиг (до 8 нм) относительно спектра субстанции. Для разработки методики количественного определения тиосенса в ЛЛФ для разных составов ЛЛФ экспериментально были подобраны условия приготовления хлороформно-спиртовых растворов рабочего стандартного образца (РСО) и испытуемого раствора ЛЛФ. При этом раствор РСО в хлороформе для более полного растворения вещества выдерживался перед разбавлением спиртом в течение 30 мин, в то время, как раствор ЛЛФ - не более 5 мин, поскольку при более длительном его выдерживании появлялась опалесценция. В некоторых случаях, особенно когда ЛЛФ содержала повышенные количества лактозы, добавление спирта этилового к хлороформному раствору ЛЛФ тиосенса сопровождалось выпадением осадка, который однако легко удаляется фильтрованием и не влияет на результаты анализа. Разработанная методика обладает достаточной точностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка определения не превышает 2,0 %.

Работа поддержана Правительством г. Москвы. Авторы благодарят Г. Н. Ворожцова, Е. А. Лукьянца и В. М. Деркачеву за сотрудничество и предоставленные для исследования образцы тиосенса.

Г. К. Григорьев, В. Г. Певгов ЛАЗЕРНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ. ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ КРОВИ В ДИАПАЗОНЕ РАЗМЕРОВ 10-1000 НМ

ГКНПЦ им. Хруничева, Москва

Лазерная корреляционная спектроскопия (ЛКС) позволяет перекрывать диапазон измеряемых размеров наночастиц в растворах от 1 до 10000 нанометров при динамическом диапазоне, по концентрации достигающем нескольких порядков. Для измерения достаточен вес пробы в несколько десятых миллиграмма, время отдельного измерения составляет несколько мин.

ЛКС позволяет оценивать состояние процессов, происходящих в биологической жидкости, в реальном масштабе времени и в реальных (нативных) условиях. В этом принципиальное отличие его от других методов, используемых в лабораторной практике, где применяется препарирование.

На основе ЛКС нами создан прибор, специально предназначенный для исследования биологических жидкостей. Он позволяет анализировать нативные жидкости человека (мочу, слюну, кровь), определяя в них сверхмалые количества (10‘5 частиц) крупномолекулярных фрагментов из частиц размерами 1-3000 нм, присущими либо онкопатологии, либо патологии, связанной с сердечно-сосудистой системой. Результат анализа - компьютерная обработка, позволяющая развивать метод на определение групп риска различных заболеваний.

Для верификации получаемых с помощью ЛКС результатов и выяснения природы объектов в сыворотке крови, дающих основной вклад в спектры рассеянного лазерного излучения, нами разработаны методики подготовки образцов для анализа на атомно -силовом микроскопе. Исследования образцов на атомно-силовом микроскопе показали, что в сыворотке крови пациентов в норме основной вклад в рассеяние лазерного излучения дают молекулярные частицы, группирующиеся в области размеров 30-50 и 100-200 нм. 1-я группа частиц имеет форму, близкую к сферической, и предположительно представлена липопротеинами низкой плотности. Ко 2-й группе частиц относятся молекулярные образования неправильной формы, предположительно являющиеся комплексами 2 липопротеинов низкой плотности с другими компонентами сыворотки крови.

В сыворотке крови больных появляется большое количество молекулярных образований в диапазоне размеров от 100 до 1000 нм, имеющих сложную форму и отличающихся большим разнообразием.

A. В. Иванов1, В. М. Мушта2,

B. Г. Певгов2, М. В. Уткина1, А. Ю. Барышников1 МЕТОДЫ НАНОТЕХНОЛОГИИ

В ИССЛЕДОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР

1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2Московский физико-технический институт

В современной медицине и биологии все большее количество вопросов решаются на субклеточном уровне, имеющем дело с объектами нанометрового диапазона. К ним относятся все разновидности белков, липидов, ДНК и различных крупномолекулярных комплексов. Многие успехи современной фармакологии, генной инженерии, биотехнологий связаны с проведением технологических операций, приводящих к изменениям нанометровых объектов. В настоящее время возрастающая потребность в измерении и контроле концентрации частиц нанометрового диапазона размеров привела к интенсивным исследованиям для создания соответствующих средств. Для этих целей применяются методы рентгеновского и нейтронного рассеяния, электронная микроскопия, атомно-силовая и туннельная микроскопия. Однако названные методы применимы, как правило, для наночастиц, помещенных на поверхности твердого тела. Для измерения параметров наночастиц в жидкости ситуация существенно хуже. В биологии для этих целей применяют центрифугирование, седиментацию, хроматографию, исследования осмотического давления и пр. Эти методы трудоемки и длительны, к тому же малоэффективны в случае гетерогенных сред, состоящих из частиц с широким распределением размеров.

Для реального внедрения многих разработанных современной фармакологией эффективных лекарственных препаратов необходимо капсулирование их в липосомные и мицелярные объекты, имеющие размеры не более 100 нм. Отсутствие технических средств контроля размеров этих объектов в нативных жидкостях тормозит внедрение в широкую практику лекарственных препаратов нового поколения не только у нас, но и за рубежом. На этом фоне привлекательно выглядят методы лазерной корреляционной спектроскопии, где достигнут диапазон измеряемых размеров от 1 до 10 000 нанометров при динамическом диапазоне по концентрациям, достигающем 5-8 порядков. Достижения в лазерной технике и электронике позволяют сделать названные устройства достаточно компактными и высоко автоматизированными. Нами разработаны приборы и методы измерения размеров наночастиц в растворах, в том числе в биологических жидкостях, таких, как плазма крови, лимфа и др. Для измерения достаточен объем пробы в несколько десятых миллилитра, а время отдельного измерения составляет несколько мин.

Выявление тяжелых заболеваний на ранней стадии - одна из актуальных задач медицины. Развитие патологических процессов в орга-

низме сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров биологических жидкостей. Исследования оптических свойств биополимеров, включая белки плазмы крови, показали эффективность использования метода динамического рассеяния лазерного излучения для контроля этих параметров. С помощью метода может быть получено распределение молекул сыворотки по размерам и концентрации, но, самое главное, он позволяет оценивать состояние процессов, происходящих в биологическом объекте, в реальном масштабе времени. В серии проведенных клинических испытаний основные диагностические характеристики (чувствительность, специфичность, эффективность) метода лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) ложатся в интервал 80-90 %. ЛСК является достаточно эффективным, не зависящим от локализации опухоли методом скрининговой диагностики онкологических заболеваний и динамического наблюдения онкологических больных.

В настоящее время в отечественной медицине сложилась ситуация для экономически эффективного массового внедрения методов нанотехнологий. Реализация этого направления требует междисциплинарного подхода и консолидированного научно-технического потенциала, который в России пока еще есть.

Е. В. Игнатьева, О. Л. Орлова, И. В. Ярцева, Л. Г. Гатинская, М. А. Кортава,

Е. В. Тазина, Н. А. Оборотова ОЦЕНКА ВКЛЮЧЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА В ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН разрабатывается липосомальная лекарственная форма доксорубицина. В настоящее время для увеличения загрузки препарата в липосомы и повышения технологичности процесса осуществлена модификация метода с активной загрузкой доксорубицина против градиента сульфата аммония.

Цель исследования. Разработка методики оценки эффективности включения доксорубицина в липосомы, отличающейся достаточной точностью и быстротой исполнения.

Материалы и методы. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC); дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), пегелированный дистеароил-фосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) (Lipoid), холестерин (Chol) (Sigma), сульфат аммония (Химмед, х.ч.). Включение доксорубицина в термочувствительные липосомы проводили против градиента сульфата аммония в весовом соотношении препарат : липиды (0,2:1). Не включенный в липосомы доксорубицин отделяли методом гель-фильтрации, пропуская дисперсию липосом через колонку с Сефа-дексом G-50. На выходе из колонки получали I фракцию - липосомы, нагруженные доксорубицином. Доксорубицин, не включенный в ли-посомы, оставался на колонке. Эффективность включения доксору-бицина в липосомы оценивали методом прямой спектрофотометрии при длине волны ^=498+2 нм. Измеряли оптическую плотность спиртовых растворов исходных липосом и I фракции. Содержание доксо-рубицина в липосомах рассчитывали, учитывая величину разбавления рабочих растворов.

Результаты. Исследование влияния на спектральные характеристики доксорубицина вспомогательных веществ (DPPC, DSPC, PEG-2000-DSPE и Chol), входящих в состав ЛЛФ, показало, что они не влияют на положение максимумов в спектре основного вещества, однако имеют собственное поглощение (около 0,1 при ^=252 нм и около 0,02 при ^=498 нм). Вследствие этого эффективность включения доксорубицина в липосомы определяли при ^=498+2 нм, где поглощение вспомогательных веществ минимально относительно спирта этилового. Установлено, что включение доксорубицина в липосо-мы составляло 75-85 %.

Выводы. Разработанная методика проста в исполнении и позволяет оценить эффективность включения доксорубицина в липосомы с точностью 2 %.

Работа поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

H. В. Классен, В. В. Кедров, И. М. Шмытько, О. А. Кривко,

Е. А. Кудренко, Г. К. Струкова, С. З. Шмурак НАНОДЕТЕКТОРЫ ДЛЯ НАНОСКОПИЧЕСКОГО РАЗРЕШЕНИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ

Институт физики твердого тела РАН, Черноголовка

Для непосредственного рентгеноскопического наблюдения биопроцессов, происходящих в живых организмах на клеточном уровне, весьма желательно улучшение пространственного разрешения до субмикронных или даже наноскопических масштабов. Это могло бы, например, дать существенно новую информацию о механизмах воздействия лекарственных препаратов, фотодинамических и других методов на опухолевые клетки. Однако несмотря на то, что длина волны излучения, применяемого для просвечивающей рентгенодиагностики, не превышает и десятитысячной доли микрона (что определяет теоретический предел соответствующего пространственного разрешения), достигаемая на практике четкость рентгеновских изображений на 5-6 порядков хуже. Одним из наиболее существенных факторов, лимитирующих пространственное разрешение рентгеноскопии, являются характеристики существующих детекторов рентгеновского излучения. Во-первых, при поглощении рентгеновского кванта в материале детектора за счет переизлучения вторичных рентгеновских фотонов значительно расширяется возбужденная область, сигнализирующая тем или иным способом (например, сцинтилляци-онной вспышкой) о месте и времени попадания рентгеновского кванта. Во-вторых, применяемые обычно для регистрации рентгеновского излучения экраны из сцинтилляционной керамики характеризуются высоким светорассеянием, за счет чего точность позиционирования места попадания рентгеновского кванта еще более ухудшается.

Применение нанокристаллов для детектирования рентгеновского излучения позволяет все же довести пространственное разрешение просвечивающей рентгенодиагностики до субмикронного или нанос-копического уровня. Это основано на способностях обширного набора кристаллических материалов при определенных внешних воздействиях (например, изменении давления или температуры) переходить из одного структурного состояния в другое. При фазовых переходах изменяются многие характеристики материала: спектральные зависимости отражения и пропускания света, электросопротивление, химическая активность и т.д. Простые оценки показывают, что поглощение рентгеновского фотона с энергией в несколько десятков Кэв наночастицей диаметром порядка 50 нм способно повысить ее температуру на сотни градусов, что вполне может вызвать в ней структурное превращение, которое возможно зарегистрировать по локальным изменениям оптических или электрических параметров. В этой ситуации размеры наночастиц и энергии используемых рентгеновских квантов должны быть подобраны так, что если первичный квант вызывает структурное превращение, вторичные переизлученные рентгеновские фотоны (обладающие, естественно, значительно меньшей энергией), поглощаясь аналогичными наночастицами, вызывать структурные превращения уже не будут. За счет этого точность локализации места поглощения будет определяться размерами поглотившей квант наночастицы.

Безусловно, считывание пространственного распределения вызванных рентгеновским излучением структурных превращений с субмикронной или наноскопической точностью - самостоятельная технически сложная задача. Но при учете современного состояния сканирующей микроскопии (например, атомно - силовой и оптической микроскопии ближнего поля) она вполне выполнима. Более того, такое считывание может осуществляться не только a posteriori (подобно проявлению фотопленки), но и in situ, т.е непосредственно в процессе наблюдения.

H. В. Классен, В. В. Кедров, H. П. Кобелев, О. А. Кривко, Е. А. Кудренко, И. М. Шмытько, С. З. Шмурак, Г. К. Струкова

НАНОКРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ

СЦИНТИЛЛЯТОРЫ

ДЛЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ

Институт физики твердого тела РАН, Черноголовка

Наши исследования в области нанотехнологий, физических и химических свойств нанокристаллических сцинтилляторов из оксидов и галогенидов тяжелых металлов показали, что они представляют инте-

рес для противоопухолевых воздействий, сочетающих в себе преимущества фотодинамической и химической терапии. Размеры сцин-тилляционных наночастиц могут регулироваться в пределах от 20 нм до 100 нм, что дает возможность доставлять их теми или иными методами в опухолевые клетки, расположенные в различных участках организма, как это делается при химической терапии (а в результате дополнительных исследований избирательность доставки наночастиц именно в опухолевые клетки может быть сделана достаточно высокой). Более того, в отличие от химиотерапии наносцинтилляционные частицы проявляют терапевтическое воздействие не всегда, а только будучи активированными рентгеновским излучением, которое можно направлять именно на пораженные опухолью участки, что еще более повысит противоопухолевую избирательность воздействия наносцинтилляторов. За счет того, что плотности веществ, составляющих сцинтилляторы, намного превышают плотность живых организмов, рентгеновское излучение будет в основном поглощаться именно сцинтилляторами, свободно проходя через живые ткани. Наносцинтиллятор, поглотив рентгеновский квант, излучает интенсивную вспышку света. Спектральный диапазон вспышки может подбираться с помощью специальных активаторов свечения сообразно поставленной цели. В одном случае это может быть жесткое ультрафиолетовое излучение, само по себе разрушающее клетки в радиусе нескольких микрон. В другом случае сцинтилляторы могут испускать видимый свет, возбуждающий молекулы фотосенсибилизаторов, которые, в свою очередь, как при фотодинамической терапии, будут образовывать активный кислород, разрушающий опухолевые клетки. Есть и еще одна весьма интересная возможность подбора такого спектрального диапазона и интенсивности сцинтилляционной вспышки, которые будут не разрушать клетки, а лишь модифицировать их функции в заданном направлении.

Серьезное преимущество наносцинтилляторов по сравнению с традиционной фотодинамической терапией в том, что фотодинамическое воздействие может оказываться лишь на клетки, расположенные на глубине не более, чем в несколько миллиметров от открытой поверхности, которые можно достичь лазерным излучением. Использование же наносцинтилляторов, свечение которых возбуждается рентгеновскими квантами, снимает ограничения по глубине залегания опухоли, сохраняя в силе все преимущества фотодинамической терапии.

Безусловно, практическое применение описанной выше нанос-цинтилляционной методики для противоопухолевой терапии требует решения целого ряда технических вопросов: отбора наносцинтилляторов, наименее токсичных для живого организма, с одной стороны, но при этом эффективно переводящих просвечивающие организм рентгеновские кванты в оптические фотоны, преобразующие опухолевые клетки необходимым образом; разработки методик селективной доставки наносцинтилляторов в намеченные для терапии участки (с помощью липосом, мицелл или иных приемов), подбора оптимальных параметров рентгеновского облучения (спектральной частоты квантов, интенсивности и интегральной энергии облучения) и т.д. Для решения указанных вопросов требуется тесная кооперация раз-работников нано сцинтилляторов со специалистами медикобиологического профиля.

М. А. Кортава, А. П. Полозкова, М. К. Кандаурова, Н. А. Томашевская, О. Г. Рогова, О. Л. Орлова,

Е. В. Игнатьева, Н. А. Оборотова ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КРИОПРОТЕКТОРА(САХАРОЗЫ)

НА РАЗМЕР ВЕЗИКУЛ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ФОТОСЕНСА

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Применение сублимационной сушки в производстве липосомальных лекарственных средств является одним из способов получения препарата высокого качества. При замораживании, лио-филизации и последующем ресуспендировании липосом в воде происходит их реорганизация и высвобождение значительной части внутреннего содержимого - раствора лекарственного препарата -во внешний раствор. Для защиты целостности везикул при лиофи-лизации и хранении сухого препарата в состав липосомальной дис-

персии ввели ряд криопротекторов: декстран, глюкозу, лактозу, маннит и сахарозу. Наиболее приемлемым криопротектором оказалась сахароза.

Цель исследования. Определение влияния способа добавления сахарозы на размер везикул после лиофилизации липосомальной дисперсии фотосенса (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

Материалы и методы. Липосомы получали путем гидратирова-ния тонкой липидной пленки, образованной упариванием в вакууме на роторном испарителе хлороформного раствора липидов (Lipoid, Германия). В качестве водной фазы использовали следующие растворы: I - 1% раствор фотосенса; II - 1% раствор фотосенса, содержащий

2 % сахарозы; III состав - 1% раствор фотосенса 1, к которому, после образования липосом, добавляли раствор сахарозы (2 % от общего объема липосомальной дисперсии). Размер липосом измеряли на приборе Submicron Particle Sizer NIC0MP-380.

Результаты. Средний диаметр многослойных липосом фотосенса всех составов составил около 500 нм. При измельчении многослойных липосом ультразвуком оказалось, что диаметр липосом в дисперсии I состава без криопротектора уменьшился до 200 нм, а липосомы составов II и III, содержащие сахарозу, укрупнились. Поэтому криопротектор следует добавлять после измельчения дисперсии ультразвуком. Получение однослойных липосом проводили также и методом экструзии, последовательно пропуская дисперсию через фильтры Nucleopore с размерами пор 0,4 и 0,2 мкм. Размер однослойных липо-сом после экструзии составил около 200 нм. Затем, измельченные липосомальные дисперсии фотосенса с криопротектором по 2 мл разливали во флаконы, замораживали и лиофилизировали на полке сублимационной сушки «Mинифаст». Лиофилизированную стерически стабилизированную лекарственную липосомальную форму фотосенса диспергировали 2 мл деионизированной воды.

Выводы. По среднему диаметру везикул, который остался на уровне 200 нм, и по эффективности включения фотосенса внутрь ли-посом выбрали состав III.

Работа поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

A. И. Котельников1, Р. А. Котельникова1, H. П. Коновалова1, Г. H. Богданов1 ,И. И. Сходкина1,

B. С. Романова2, С. М. Андреев3 ГИБРИДНЫЕ НАНОСТУКТУРЫ НА ОСНОВЕ ФУЛЛЕРЕНОВ.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И ПРИМЕНЕНИЕ В ОНКОЛОГИИ

1Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка

2Институт элементоорганических соединений

им. А. Н. Несмеянова РАН, Москва

3ГНЦ Институт иммунологии ФМБА РФ, Москва

Введение. Значительное место среди современных наноматериалов занимают структуры на основе фуллеренов и эндометаллофулле-ренов.

Задачи исследования. Создание на базе фуллеренов и эндоме-таллофуллеренов новых гибридных биологически активных наноструктур (ГБАНС) для их применения в медицине, в том числе в онкологии, и в качестве контрастирующих материалов для ЯMP-томографии.

Результаты. Предложена методика селективного присоединение к фуллереновому ядру 1 или 2 аддендов из класса аминокислот, других метаболитов и биологически активных соединений. Комбинация

2 различных аддендов открывает возможность создания широкого набора гибридных наноструктур: один из аддендов, аминокислота или пептид, придает фуллереновому ядру водорастворимость и мем-бранотропность, а 2-й - дополнительные биологические свойства, в том числе антиоксидантные, фотосенсибилизирующие, способность донировать оксид азота или ингибировать ключевые ферменты. Развиты методики ковалентного присоединения фуллеренов к белкам и ДНК, что важно для исследования иммунологических свойств ГБАНС и их фотодинамического действия.

При малой токсичности такие структуры проявляют мембрано-тропные и антиоксидантные свойства, влияют на функционирование многих ферментативных систем и проникают через гематоэнцефали-

тический барьер, могут выступать в качестве фотоактивных молекул. Выявлена их противоопухолевая, антивирусная (в том числе против СПИДа) и фотодинамическая активность.

Обнаружено противоопухолевое и антиметастатическое действие при комбинированном применении ГБАНС (аминокислотных производных фуллерена с использованием в качестве вторых аддендов группировок - доноров N0 и антиоксидантов) и известных цитоста-тиков.

Созданы гибридные структуры на основе эндометаллофуллере-нов, перспективные для применения в ЯМР-томографии.

Выводы. Развитые методы и подходы позволяют осуществить создание на базе фуллеренов нового класса биологически активных соединений, перспективных для применения в химиотерапии и фото-динамической терапии опухолей и для их диагностики.

А. В. Ланцова, Н. А. Оборотова, З. С. Шпрах, О. Л. Орлова, А. П. Полозкова, К. В. Костин РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОМУСТИНА В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЕ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Для увеличения избирательности противоопухолевого действия лизомустина в лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН создана стерически стабилизированная липосомальная форма препарата. Однократное внутривенное введение липосомальной дисперсии позволило расширить диапазон терапевтических доз лизомустина с эффектом 100%-ного излечения (Ь-1210, карцинома легкого Льюис).

Цель исследования. Для стандартизации новой лекарственной формы разработать методику количественного определения лизому-стина в липосомах.

Материалы и методы. При проведении исследований использованы вещества, соответствовавшие требованиям нормативной документации: ГФ XI изданий, и8Р 27, отдельных Фармакопейных статей и ГОСТов.

Результаты. В электронном спектре поглощения спиртового раствора лизомустина наблюдается интенсивная полоса поглощения с максимумом 230±2 нм. Установлено соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера для спиртового раствора липосомального лизомусти-на в этой области спектра в интервале концентраций от 0,01 мг/мл до 0,05 мг/мл. Показано, что спектр поглощения спиртового раствора липосомального лизомустина относительно раствора вспомогательных ингредиентов по положению максимумов, форме кривой и величине поглощения идентичен спектру субстанции лизомустина. Предложенная методика предусматривает использование раствора сравнения, содержащего соответствующие вспомогательные вещества в таком же разведении, для исключения погрешностей при количественном определении лизомустина в липосомальной лекарственной форме. Воспроизводимость методики оценивали на модельных смесях липосом с точными навесками лизомустина. Ошибка среднего результата количественного определения лизомустина в модельных смесях составила 0,18-0,57 %. Среднее содержание лизомустина во флаконе (в мг) - 99,92±0,15; относительная ошибка среднего результата количественного определения лизомустина в липосомальной дисперсии не превышала 0,16 %.

А. В. Ланцова, О. И. Саквина, К. В. Костин, Н. А. Оборотова СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДИК АНАЛИЗА ЛИЗОМУСТИНА В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Лизомустин в лиофилизированной лекарственной форме разрешен для медицинского применения у взрослых при лечении меланомы кожи, мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого. Для увеличения избирательности его противоопухолевого действия предложена липосомальная форма для внутривенного введения.

Цель исследования. Усовершенствование методик химикофармацевтического анализа лизомустина для быстрого и точного определения препарата в липосомальной лекарственной форме.

Материалы и методы. Лизомустин - смесь изомеров положения нитрозогруппы: 9- (2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (I) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитруллин (II) (ФСП 42-0494003, ООО «АКАДЕМФАРМА»).

Результаты и обсуждение. В качестве одного из основных критериев оптимальности разрабатываемой рецептуры и технологии получения липосомального лизомустина выбрали эффективность включения препарата в формируемые липосомы. Спектрофотометрическую методику применили для оценки количественного содержания включенного в везикулы лизомустина после очистки дисперсии липосом от невключенного препарата методом диализа. Основным методом анализа для определения примесей в липосомальной лекарственной форме лизомустина является метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Системой растворителей в данном методе является спирт н-бутиловый : кислота уксусная : вода - 12 : 3 : 5. Установлена возможность разделения всех входящих в липосомальную форму компонентов при проявлении хроматограмм раствором нингидрина и парами йода. Вспомогательные компоненты липосомальной формы проявляются на хроматограммах в виде четких пятен, не мешая определению как самого лизомустина, так и специфических примесей, характерных для субстанции.

Редиспергирование липидной пленки при получении липосомаль-ной дисперсии лизомустина для лиофилизации проводили 1%-ным раствором лизомустина с добавлением криопротектора. Размер липо-сом определяли до и после замораживания, а так же после лиофили-зации. После изучения влияния замораживания на структуру липосом ( при -40 °С и выдерживании в течение 3 ч) дисперсию размораживали при комнатной температуре и определяли средний диаметр липо-сом на приборе «Наносайзер» (Submicron Particale Sizer Nicomp 380, США). Экспериментальные исследования показали, что углеводы защищают липосомальную мембрану от разрыва в процессе замораживания, так как размороженные липосомы практически не изменились в размере. Влияние сублимации и состава криопротекторов (сахарозы, лактозы и маннита) проверяли после лиофильной сушки замороженных препаратов при нагреве полок до 20 °С со скоростью 5 °С в час. Распределение липосом по размерам определяли после регидратации лиофилизатов водой для инъекций. Показано, что ман-нит при лиофилизации является хорошим формообразующим компонентом (мелкокристаллический лиофилизат), но средний диаметр липосом с маннитом увеличился в 5 раз (от 107 до 530 нм). Однако после лиофилизации липосомальной дисперсии с лактозой или с сахарозой структура липосом с лизомустином не изменились.

Выводы. Разработана СФ-метрическая методика, позволяющая определять лизомустин в липосомальной дисперсии и лиофилизате. Модифицированный метод ТСХ обнаруживает все компоненты, входящие в состав липосом. Определение гомогенности и среднего диаметра липосом методом лазерного светорассеивания дает возможность следить за качеством препарата как в процессе приготовления водной дисперсии, так и в процессе выбора режимов замораживания и лиофилизации лекарственной формы.

М. Ю. Ларин1, П. К. Иванов1, Д. Ю. Блохин1,

В. И. Филиппов2, О. Л. Ершов3 МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫЕ ИММУНОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ НОСИТЕЛЕЙ С ПОКРЫТИЕМ ИЗ ДИОКСИДА КРЕМНИЯ

1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН,

2Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва

3ФГУП ГНИИхимии и технологии элементоорганических соединений, Москва

Введение. В настоящее время в различных областях клинической и экспериментальной медицины все более широкое применение находят гомогенные по иммунофенотипу фракции клеток. Одним из наиболее эффективных методов получения таких клеточных фракций является магнитная сепарация, в основе которой лежит взаимодействие клеток определенного типа с магнитоуправляемым иммуносорбентом и последующее их выделение в приложенном неоднородном магнитном поле.

Цель исследования. Создание магнитоуправляемых иммуносорбентов для разделения клеток периферической крови или костного мозга методом негативной селекции.

Материалы и методы. В качестве магниточувствительного компонента иммуносорбентов использовали магнетит, обладающий свойствами мягкого ферромагнетика. Для получения водных суспензий магнетита с размерами частиц менее 1 мкм применялся метод ультразвукового диспергирования.

Матрицу сорбента формировали путем поликонденсации крем-нийорганического олигомера с одновременным осаждением образующегося композита на частицах магнетита в водной фазе.

Для стандартизации частиц носителя по размерам использовали метод корреляционной спектроскопии светорассеяния (Nicomp 380, Nicomp PSS). Магнитные характеристики определяли с помощью вибрационного магнитометра.

Конъюгирование частиц носителя с моноклональными антителами серии ICO проводили после активации матрицы из диоксида кремния тетрахлоридом титана. Количественную оценку связывания антител с носителем проводили путем спектрофотометрического определения концентрации белка и методом простой радиальной иммунодиффузии в геле.

Результаты. Разработана технология получения и созданы образцы магнитоуправляемых иммуносорбентов на основе носителей с покрытием из диоксида кремния и моноклональных антител ICO-90, ICO-86, ICO-31, ICO-115, IC0-180 со следующими характеристиками: размер частиц 0,5.. .0,6 мкм; намагниченность насыщения 41+3 кА-м'1; остаточная намагниченность 1,14+0,15 кА-м'1; удельная загрузка антителами до 50 мкг на 1 мг носителя.

И. Г. Мгерович1, Д. Г. Гуревич1, Г. А. Меерович2,

С. И. Воробьев3, В. Г. Певгов4, З. С.Смирнова1,

Н. А. Оборотова1, Е. А. Лукьянец5, А. Ю. Барышников1 ВЛИЯНИЕ РАЗМЕРОВ ЛИПОСОМ НА УРОВЕНЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ НАКОПЛЕНИЯ ТИОСЕНСА В ОПУХОЛИ

}ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

2ЦЕНИ институт общей физики им. А. М. Прохорова РАН, Москва 3МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва 4ГКНПЦ им. Хруничева, Москва 5ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва

Введение. Одним из основных факторов, определяющих эффективность нанопрепаратов в онкологии, является размер наноструктур. Взаимодействие наноструктур с дефектами неоваскуляризаций новообразований обеспечивает повышенное накопление в них включенного в наноструктуру препарата. В настоящей работе исследовалось влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления в опухоли инфракрасного фотосенсибилизатора тиосенс (липосомаль-ной формы фенилтиофталоцианина алюминия гидроксида).

Материалы и методы. Липосомы были получены методом Бен-гема. Липофильная субстанция [(PhS)4PcAlOH] была введена в липидный бислой. Уменьшение размеров липосом обеспечивалось использованием миниэкструдера «Avanti Mini-Extruder» (США) и гомогенизатора высокого давления «Донор-1» (Россия). Размер ли-посом определялся методом лазерной корреляционной спектроскопии. Исследования уровня и селективности накопления тиосенса в опухоли проводились in vivo лазерно-флюоресцентным методом. Для исследований использовались мыши Fi с опухолью Эрлиха (ELD), перевитой внутримышечно в правую заднюю лапу за 6 дней до опыта. Фотосенсибилизатор вводился в хвостовую вену в дозе 4 мг/кг веса животных.

Результаты. Был проведен ряд экспериментов, в которых сравнивались уровни накопления тиосенса при различном распределении липосом по диаметру. Было показано, что селективность и накопление липосомального препарата определяется в основном содержанием фракций с диаметром менее 150 нм, в то время, как крупные фракции быстро выводятся из плазмы крови, предположительно из-за поглощения ретикулоэндотелиальной системой, и не вносят существенного вклада в накопление фотосенсибилизатора.

Работа к.б.н. И. Г. Мееровича поддержана грантом Президента Российской Федерации для молодых ученых-кандидатов наук МК-6258.2006.4.

А. П. Полозкова, Е. В. Тазина, О. Л. Орлова, Е. В. Игнатьева, H. Д. Бунятян, H. А. Оборотова, О. И. Тарасова РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОГО СОСТАВА ТЕРМОЧУВТВИТЕЛЬНЫХ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Повышение эффективности лекарственной терапии злокачественных новообразований продолжается по разным направлениям, в том числе для комбинированного воздействия на опухоли в последние годы разрабатывается метод химиотерапии совместно с локальной гипертермией.

Цель исследования. Разработка оптимального состава термочувствительных стерически стабилизированных липосом с доксоруби-цином (Dox), позволяющих в сочетании с локальной гипертермией увеличить селективность противоопухолевого действия препарата.

Материалы и методы. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), пегилированный дистеароил-фосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) фирмы Lipoid; холестерин (Chol) (Sigma); кардиолипин-стандарт 0,5% раствор в спирте этиловом 95% ^инмедбиопром, г. Xарьков) и доксорубицин (ICN Biomedicals, Inc).

Липосомы с доксорубицином получали pH-градиентным методом с молярным соотношением липидов DPPC, DSPC, ПЭГ-липид - 9 : 1 : 0,02 (состав 1). Для увеличения твердости мембраны и для лучшего удерживания в липосоме доксорубицина к составу 1 добавили холестерин и отрицательно заряженный кардиолипин в соотношении 6 : 1 (состав 2). Весовое соотношение доксорубицин : липиды составило 1 : 5 в обоих случаях. Анализ среднего диаметра везикул и стандартное отклонение их распределения проводили на приборе Submicron Particle Sizer Nicomp-380 (США). Для разделения включенного и не включенного в везикулы препарата использовали метод гель-фильтрации на хроматографической колонке с сефадексом G-50 (элюент - вода). Содержание доксорубицина в липосомах определяли методом спектрофотометрии при длине волны 252±2 нм.

Результаты. Получены моноламеллярные липосомы с размером от 140 до 180 нм для состава 2 и от 190 до 230 нм для состава 1. Содержание доксорубицина в 1 мл липосомальной дисперсии с холестерином и кардиолипином составило 0,119 мг/мл, а для состава 1 -0,0l3 мг/мл. Включение доксорубицина в состав 1 липосом оказалось около 45 %, тогда как в состав 2 липосом включилось не менее l5 % доксорубицина.

Выводы. Таким образом, показано преимущество состава термо-липосом доксорубицина, включающего в себя наряду с термозависимыми липидами холестерин и кардиолипин.

Разработка поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

А. П. Полозкова, Е. В. Тазина, О. Л. Орлова,

Е. В. Игнатьева, H. Д. Бунятян, H. А. Оборотова ПОЛУЧЕНИЕ ТЕРМОЗАВИСИМОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Большой раздел современных исследований посвящен разработке липосомального носителя, гарантирующего направленную доставку и контролируемое высвобождение инкапсулированного лекарственного вещества в опухолевые ткани. Идея термочувствительных липосом заключается в их способности высвобождать препарат в ответ на действие локальной гипертермии, в процессе которой опухоль нагревается до 41—43 °С.

Цель исследования. Разработка технологии получения термочувствительных липосом с доксорубицином, способствующих увеличению избирательности противоопухолевого действия препарата.

Материалы и методы. Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), пегилированный дистеароил-фосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) фирмы Lipoid; холестерин (Chol) (Sigma); кардиолипин-стандарт 0,5 % раствор в спирте этиловом 95 % ^инмедбиопром, г. Xарьков) и доксорубицин (ICN Biomedicals, Inc).

Липосомы с доксорубицином получали методом «обращения фаз» и с использованием рН-градиента. Молярное соотношение липидов в обоих случаях - 9 : 1 : 0,02. Согласно методу «обращения фаз» смешивали 1%-ный водный раствор доксорубицина с раствором липидов в хлороформе и озвучивали в течение 15 мин. Органический растворитель выпаривали при 37 °С. Далее липосомы измельчали путем повторного озвучивания в течение 30 мин.

В соответствии с рН-градиентным методом смесь липидов растворяли в хлороформе с подкислением 300 мМ раствором лимонной кислоты до pH 4,0 и последующим озвучиванием. Органический растворитель отгоняли при 60 °С. Охлажденную до комнатной температуры дисперсию подщелачивали 1М раствором едкого натра до pH 7,8. Затем липосомы термостатировали при 60 °С в течение 5 мин, смешивали с предварительно нагретым до той же температуры водным раствором доксорубицина (весовое соотношение препарат : липид - 1 : 5) и повторно инкубировали при 60 °С в течение 15 мин.

Размер липосом определяли на приборе Submicron Particle Sizer Nicomp-380 (США), содержание доксорубицина в липосомах - методом спектрофотометрии при длине волны 252+2 нм по величине оптической плотности.

Результаты. Средний диаметр липосом с доксорубицином, полученных методом «обращения фаз», составил 400 нм, а липосом, полученных «рН-градиентным» методом, - 195 нм. Липосомы с доксору-бицином, полученные методом «обращения фаз», оказались большого размера и не удерживали доксорубицина в процессе как диализа, так и последующего хранения.

Вывод. Из 2 предложенных методов получения термолипосо-мального доксорубицина наиболее приемлем метод рН-градиента, однако включение препарата в липосомы не превышало 60 %. Поэтому продолжены работы по повышению эффективности включения доксорубицина в липосомы.

Разработка поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

А. П. Полозкова, М. А. Кортава, Н. А. Томашевская,

О. Л. Орлова, Е. В. Игнатьева, Н. А. Оборотова ВЫБОР КРИОПРОТЕКТОРА ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ЛИПОСОМАЛЬНОГО ФОТОСЕНСА

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Введение. Фотосенс применяется в ФДТ и флюоресцентной диагностике рака. С целью снижения нежелательной высокой кожной фоточувствительности, обусловленной длительным удерживанием препарата в коже, разрабатывается липосомальная лекарственная форма фотосенса, для стабилизации которой используется сублимационная сушка. Обязательное условие целостности везикул при лио-филизации - наличие криопротектора, который обеспечивает снижение температуры фазового перехода липидов, входящих в состав бислоя, и сохраняет их в жидкокристаллическом состоянии.

Цель исследования. Выбор криопротектора для создания лиофи-лизированной липосомальной лекарственной формы фотосенса.

Материалы и методы. Фосфатидилхолин (Lipoid, Германия); пе-гилированный дистеароилфосфатидилэтаноламин (PEG-2000-DSPE) (Lipoid, Германия); холестерин (Chol) (Sigma); сахароза (ГОСТ 583375), маннит, глюкоза, лактоза. Наиболее удобный и информативный параметр, характеризующий изменения в дисперсионной системе, -размер липосом, который измеряли до и после замораживания и лио-филизации на приборе «Наносайзер» (Submicron Particale Sizer Ni-comp 380,США). Распределение липосом по среднему диаметру и однородность дисперсии определяли после регидратации лиофилиза-тов водой для инъекций. Включение фотосенса в липосомы определяли СФ-метрически.

Результаты. Полученные результаты свидетельствуют о различном влиянии углеводов на размер липосом в процессе их образования, замораживания и сушки. При использовании маннита, лактозы или сахарозы получили более мелкие по размеру липосомы, чем с глюкозой. Несмотря на то, что маннит при лиофилизации оказался хорошим формообразующим компонентом (мелкокристаллический лиофилизат), средний диаметр липосом с маннитом после лиофили-зации увеличился в 3,5 раза. После лиофилизации с лактозой или са-

харозой диаметр липосом не изменился. Лиофилизация липосом со смешанными криопротекторами лактоза-маннит или сахароза-маннит также не привела к уменьшению кристаллов лиофилизата.

Выводы. По критериям средний диаметр липосом, однородность дисперсий, количество включенного фотосенса, структура лиофили-зата и возможность его регидратации отобран криопротектор сахароза. По внешнему виду полученный лиофилизат представляет собой крупнокристаллическую однородную сухую массу сине-зеленого цвета. Средний диаметр липосом фотосенса с сахарозой не превышал 250 нм.

Разработка поддержана грантом Федерального государственного унитарного предприятия «Государственный научный центр «НИОПИК» (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК»).

Н. Я. Рапопорт

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ КОМБИНИРОВАННОГО ИМАДЖИНГА И ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ

Университет штата Юта, Солт-Лейк-Сити, США

Возможность комбинирования в одной лекарственной форме лекарственной субстанции и ультразвукового контрастирующего агента - одна из научных проблем, вызывающих в настоящее время повышенный интерес. Современные нанотехнологии позволяют создать новый класс лекарственных форм на базе микроэмульсий, содержащих полимерные мицеллы. Эхогенные свойства таких систем позволяют одновременно использовать их как эффективные ультразвуковые контрастирующие агенты. Недавно нами были разработаны био-деградируемые наноэмульсии, диспергируемые в растворе полимерных мицелл; при этом нанокапли наноэмульсии инкапсулируются в микровезикулах, которые могут быть стабилизированы био-деградируемым сополимером - тем же, из которого образованы мицеллы, либо другим. Микровезикулы усиливают инициированное ультразвуком высвобождение лекарственной субстанции из мицелл и облегчают ее проникновение в клетку. Разрабатываемые нами микровезикулы отличаются от коммерческих образцов или разработок других групп тем, что: 1) они получаются in situ при введении специально разработанных микроэмульсий; 2) стенки микровезикул образованы из биодеградируемого диблок-сополимера; 3) тот же диблок-сополимер, что образует стенки микровезикул, образует и полимерные мицеллы, которые эффективно инкапсулируют химиотерапевтические субстанции; 4) после введения препарата местное ультразвуковое воздействие на опухоль, сенсибилизированную микровезикулами, обеспечивает эффективное введение лекарства в клетки опухоли.

Эти системы могут быть применены различным образом, в частности, для диагностической эхографии, эхографически контролируемой химиотерапии, генной доставки и т.д.

Применение разработанных систем для эхографии опухолей позволило при использовании клинической сканирующей системы Acuson Sequoia с частотой 14 МГц обеспечить четкое выявление малых метастазов рака молочной железы в селезенке мыши. При химиотерапии подкожно перевитого рака молочной железы путем комбинирования системного введения микроинкапсулиро-

ванного доксорубицина с местным воздействием на опухоль импульсным ультразвуком с частотой 3 МГц были получены хорошие результаты.

М. А. Рубцова1, А. Н. Сомов2, З. А. Соколова1,

Е. В. Игнатьева1, А. Ю. Барышников1 АНТИ-СВ5 ИММУНОЛИПОСОМЫ, НАГРУЖЕННЫЕ ДОКСОРУБИЦИНОМ: АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO

]ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2ФГУНГНЦПМБ, пос. Оболенск

Введение. Один из способов, позволяющих уменьшить побочное действие на нормальные клетки и увеличить терапевтический эффект лекарственных средств, - доставка препаратов с помощью иммуно-липосом. Иммунолипосомы представляют собой липосомы, к которым прикреплены моноклональные антитела (МКА), обеспечивающие специфическое связывание липосом с антигенпозитивными клетками, а липосомы несут соответствующий гидрофобный или гидрофильный химиотерапевтический препарат.

Цель исследования. Получение анти-CD5 иммунолипосом, нагруженных противоопухолевым препаратом доксорубицином, для их адресной доставки к опухолевым клеткам-мишеням.

Материалы и методы. Липосомы готовили гидратацией лиофи-лизованной липидной пленки в соответствующем буферном растворе. Включение доксорубицина проводили по принципу активной загрузки при искусственно созданных трансмембранных градиентах рН. МКА ICO-80 к пара-нитрофенилкарбонильной группе активированного полиэтиленгликоль-липидного конъюгата присоединяли с образованием карбаматной связи. Количество молекул антител на одну липосому определяли по бицинхониновой кислоте согласно стандартной методике. Включение доксорубицина определяли спектрофотометрически. Способность иммунолипосом специфически связываться с антигеном определяли в реакции прямой иммунофлюоресценции, для чего использовали МКА, конъюгированыые с FITC (флюоресцеинтиоцианатом), ICO80 и бараньи антитела к иммуноглобулину мыши (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия). Цитотоксичность полученных препаратов иммунолипосом оценивали в МТТ-тесте согласно стандартной методике.

Результаты. Для конъюгации с липосомами были наработаны МКА ICO80 в достаточном количестве. Была создана методика получения иммунолипосом типов А и В, нагруженных противоопухолевым препаратом доксорубицином. Количество молекул антител, связанных с поверхностью липосом, составило 45-80 молекул белка на липосому; процент включения доксорубицина варьировал от 58 до 85 %. На клеточной линии Jurkat и клетках периферической крови здоровых доноров продемонстрирована способность полученных иммунолипосом, содержащих МКА ICO80, специфически связываться c антигеном CD5 in vitro в 75-100 % случаев. На клеточной линии Jurkat показана цито-токсическая активность иммунолипосомальной формы доксорубицина.

Выводы. Таким образом, получены анти-CD5 иммунолипосомы, способные специфически связываться с антигеном и обладающие цитотоксической активностью in vitro.