CC BY
28
DOI: 10.17816^9413-17
МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИДИОПАТИЧЕСКИХ ЭПИРЕТИНАЛЬНЫХ МЕМБРАН И ИХ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ
© У.Р. Алтынбаев1, А.И. Лебедева 2
'Медико-санитарная часть ОАО «Татнефть», Альметьевск;
2 ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава РФ, Уфа
Дата поступления: 05.09.2016 Статья принята к печати: 22.11.2016
ф Дана сравнительная морфологическая характеристика и оценка реакции на антигены фибронек-тина, ламинина, глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) идиопатических эпиретинальных мембран (иЭРМ). Установлена сопоставимая положительная реакция иЭРМ на фибронектин и ГФКБ, что указывает на участие данных цитокинов в развитии и прогрессировании нейродегенеративного процесса в заднем отрезке глаза. Клеточными элементами, ответственными за её формирование, являлись клетки стекловидного тела — фибробласты, миофибробласты, гиалоциты, а также клетки сетчатки — радиальные глиоциты. В формировании рецидивирующей иЭРМ основная роль отводится исключительно радиальным глиоцитам сетчатки.
ф Ключевые слова: идиопатическая эпиретинальная мембрана; фибронектин; ламинин; глиальный фибриллярный кислый белок.
MORPHOLOGICAL STUDY OF IDIOPATHIC EPIRETINAL MEMBRANES AND THEIR CYTOKINE PROFILE
© U.R. Altynbaev1, A.I. Lebedeva12
1 Medical Centre of OAO "Tatneft", Almetjevsk, Russian Federation;
2 FSBI "Russian Eye and Plastic Surgery Center of the Health Ministry of the Russian Federation", Ufa,
Russian Federation
For citation: Ophthalmology Journal, 2016;9(4):13-17 Received: 05.09.2016
Accepted: 22.11.2016
^ The article presents comparative morphological analysis and assessment of response to antigens of fibronectin, laminin, glial fibrillary acidic protein (GFAP) in idiopathic epiretinal membranes (iERM). Authors found a comparable positive iERM reaction to fibronectin and GFAP, which indicates the involvement of these cytokines in the development and progression of the posterior segment neurodegenerative process. Cellular elements in the vitreous gel responsible for iERM formation were fibroblasts, myofibroblasts, hyalocytes, and retinal radial glial cells. Retinal radial glial cells play the main role in the recurrent iERM formation. Conclusion. Due to its hemodynamic, nootropic, neurotrophic action, the investigated bioregulatory complex increases the optic nerve tolerance to the stress effect of IOP, SBP, and DBP asynchronous fluctuations, and improves the ocular blood perfusion.
Keywords: idiopathic epiretinal membrane; fibronectin; laminin; glial fibrillary acidic protein.
ВВЕДЕНИЕ
Частота развития идиопатических эпиретинальных мембран (иЭРМ) варьирует от 1,5 до 4,5 %, при этом в 28,6 % случаев отмечается их прогрессирующее течение [3]. Патогенетические механизмы формирования иЭРМ до сих пор
остаются противоречивыми. Известно, что развитие иЭРМ происходит в результате миграции и пролиферации глиальных клеток из дефектов во внутренней пограничной мембране сетчатки (ВПМ), которые образуются при патологической задней отслойке стекловидного тела (СТ)
[5, 9, 10]. По данным литературы, морфологическая взаимосвязь СТ и сетчатки осуществляется при участии гликопротеинов фибронектина и ламини-на [4]. В единичных исследованиях указывается на обнаружение фибронектина в эпиретиналь-ных и субретинальных мембранах, установлено изменение показателей фибронектина и ламини-на в СТ у пациентов с иЭРМ и макулярным отверстием [1, 13]. Исходы хирургического лечения иЭРМ во многом зависят от давности и тяжести процесса, степени адгезии иЭРМ с подлежащей сетчаткой, поэтому углублённое изучение морфологических аспектов развития иЭРМ является актуальной проблемой.
Цель работы: определить морфологические особенности иЭРМ, выявить антигены фибронектина, ламинина и глиального фибриллярного кислого белка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для проведения исследования были использованы 15 фрагментов иЭРМ, удалённых во время витрэктомии. В трёх случаях иЭРМ были повторные и удалялись в течение 10—15 месяцев после первичной операции. Фрагменты мембран фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 (Германия), которые окрашивали гематоксилином и эозином по Мал-лори. Для выявления эластических волокон проводили окраску резорцин фуксином по Вейгерту с докраской литиевым кармином Орта.
Рис. 1.
Fig. 1.
Идиопатическая эпиретинальная мембрана. Отложения коллагеновых волокон в эпиретинальной мембране (окрашивание в синий цвет). Окраска по Маллори
Idiopathic epiretinal membranes. Collagen fibers deposition in the epiretinal membrane (blue staining). Mallory staining
Для иммуногистохимических исследований парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В качестве первых антител применяли: фибронектин в разведении 1 : 100 (номер по каталогу sc 8422), ламинин в разведении 1 : 100 (номер по каталогу sc 6018), глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) в разведении 1 : 300 (номер по каталогу sc 33673) (Santa Cruz Biotechnology, США). Для окрашивания использовали непрямую стрептави-дин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием светового микроскопа Axiolmager Z1, оснащённого фотонасадкой ProgRes C3 и программой анализа изображений Axiovision (Carl Zeiss, Германия). Морфометрию объектов проводили при увеличении х1000 с иммерсией. Для обработки числовых данных использовали параметрический анализ по Стьюденту.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идиопатические иЭРМ представляли собой различной толщины непрерывные фибриллярные мембраны, с волокнистым строением, инфильтрированные различными фибробластическими клетками: фибробластами, ламиноцитами, мио-фибробластами (рис. 1). Также на поверхности мембраны встречались гиалоциты округлой формы, относящиеся к клеткам макрофагального ряда. Клетки воспалительного ряда, такие как лимфоциты, нейтрофилы, лаброциты, отсутствовали. Толщина мембран варьировала от 6,03 ± 1,6 до 7,56 ± 2,9 мкм.
В некоторых мембранах присутствовали утолщения с отложениями фибриллярных компонентов. При окраске по Маллори все идиопатические иЭРМ окрашивались в интенсивный синий цвет, что свидетельствовало о наличии в них коллагеновых волокон, которые имели вид разнокалиберных образований от тонких фибрилл до утолщённых плотных пучков, направленных вдоль мембраны (см. рис. 1).
Реакция всех исследуемых препаратов на присутствие белка эластина во всех случаях была отрицательной. Выявленные плотные кол-лагеновые волокна в иЭРМ, не содержащие белка эластина, свидетельствуют о низкой степени их растяжимости и определённых тракционных свойствах.
i.
Рис. 2. Гистологическая картина эпиретинальной мембраны пациента с псевдоразрывом сетчатки. Определяются коллагеновые волокна (синий цвет) и скопления миофибробластов. Окраска по Маллори
Fig. 2. Epiretinal membrane histology in the patient with retinal pseudotear. Collagen fibers (blue staining) and myofibroblasts accumulation are seen. Mallory staining
В эпиретинальных мембранах, которые клинически сочетались с ламеллярным разрывом сетчатки, в макулярной области среди фибро-бластических клеток выявлялись очаги скоплений миофибробластов (рис. 2).
Ядра этих клеток были вытянутой удлинённой формы. В широком ободке цитоплазмы содержались тонкие параллельные филаменты, имеющие оранжевый цвет при окраске по Мал-лори (см. рис. 2), что является признаком мио-фибриллярной дифференцировки. Миофибробла-сты располагались пристеночно возле мембраны и образовывали массивные пролиферирующие инфильтраты, состоящие из нескольких рядов. Линейная ориентация клеток вдоль тяжей пролиферации может играть роль в феномене сокращения мембран. Известно, что миофибробласты являются основным типом клеток в мембранах со значительным тракционным компонентом [12]. По данным C. Guidry (1996), радиальные глио-циты могут трансформироваться в миофибробла-сты. При изменении фенотипа нейроглиальных клеток на фибробластический экспрессия ГФКБ редуцировалась, а а-актин гладкомышечных клеток в цитоплазме накапливался [7].
В 66,7 % (n = 8) у иЭРМ отмечалась положительная реакция на фибронектин различной степени интенсивности. Более интенсивное окрашивание определялось возле ламиноцитов и фи-бробластических клеток (рис. 3).
Фибронектин является гликопротеином внеклеточного матрикса и может играть роль хемо-аттрактанта клеток, образовывать каркас для их
Рис. 3. Положительная реакция эпиретинальной мембраны на фибронектин (коричневое окрашивание). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления фибронектина с докраской гематоксилином
Fig. 3. Epiretinal membrane positive reaction to fibronectin (brown staining). Indirect immunoperoxidase method for detecting fibronectin with additional hematoxylin staining was used
миграции, обладает высоким сродством к основным компонентам СТ, к коллагену II типа и ги-алуроновой кислоте [1, 13]. Фибронектин продуцируется в основном фибробластоподобными клетками, а также другими клетками: клетками пигментного эпителия,радиальными глиоцитами, гиалоцитами [6].
Реакция иЭРМ на ламинин была не выражена, он выявлялся фрагментарно в виде следов на поверхности мембраны в непосредственной близости от фибробластических клеток (рис. 4).
Рис. 4. Положительная реакция на ламинин (Т). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления ламинина с докраской гематоксилином
Fig. 4. Positive reaction to laminin (t). Indirect immunoper-oxidase method for detecting laminin with additional hematoxylin staining was used
Рис. 5. Эпиретинальная мембрана. Положительная реакция на глиальный фибриллярный кислый белок (коричневое окрашивание) на ретинальной стороне мембраны (Т). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления глиального фибриллярного кислого белка с докраской гематоксилином
Fig. 5. Epiretinal membrane. Positive reaction to glial fibrillary acidic protein (brown staining) on the retinal side of the membrane is seen (Т). Indirect immunoperoxidase method for detecting glial fibrillary acidic protein with additional hematoxylin staining was used
ГФКБ обнаруживался как в умеренном, так и в большом количестве на поверхности мембраны с ретинальной стороны. Он локализовался независимо от расположения фибробластических клеток (рис. 5), видимо, он секретировался радиальными глиоцитами сетчатки, цитоплазма которых интенсивно окрашивалась, что согласуется со многими исследованиями [11]. Известно, что ГФКБ является биомаркером глиальных клеток
сетчатки (астроцитов и активированных мюлле-ровских глиоцитов), которые играют основную роль в формировании глиального рубца [2, 5, 10, 13]. Также ГФКБ выявлялся при иммуноги-стохимическом окрашивании в цитоплазме гиа-лоцитов СТ [8].
Реакция иЭРМ на ГФКБ коррелировала с интенсивностью окраски мембран на фибронектин, что указывает на значимость данного гликопро-теина в развитии нейродегенеративного процесса.
Рецидивирующие иЭРМ имели определённое гистохимическое отличие. В целом плотность клеток витреальной полости в них была значительно меньше по сравнению с первичными мембранами (р < 0,05). Встречались только ла-миноциты непосредственно в толще мембраны, а также радиальные глиоциты. Фибронектин и ламинин не определялись вовсе, а ГФКБ выявлялся очень интенсивно непосредственно в самой мембране, а не откладывался на её поверхности (рис. 6). Следовательно, иммунопозитивные клетки по ГФКБ образовывали саму рецидивирующую мембрану.
Выраженная клеточная активность и высокая плотность фибробластических клеток в иЭРМ способствуют фиброзированию, утолщению мембраны и усилению тракционного воздействия на сетчатку, поэтому удаление СТ и пи-линг внутренней пограничной мембраны вполне оправданы. Данные манипуляции способствуют предупреждению тракционного синдрома, про-грессированию дегенеративного процесса в этих глазах. В результате элиминации коллагенпро-дуцирующих клеток реакция мембран на фибро-
а b
Рис. 6. Рецидивирующая эпиретинальная мембрана: а) низкая клеточная плотность. Окраска гематоксилином и эозином; b) ГФКБ-позитивная мембрана. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления ГФКБ с докраской гематоксилином
Fig. 6. Recurrent epiretinal membrane: a) low cell density. H & E staining; b) GFAP-positive membrane. Indirect immunoper-oxidase method for detecting GFAP with additional hematoxylin staining was used
нектин, эластин и ламинин была отрицательной или незначительной. Напротив, реакция на ГФКБ в рецидивирующих иЭРМ была наиболее выражена, что указывает на основную роль глиальных клеток при формировании данного типа эпирети-нальных мембран.
Таким образом, сопоставимая положительная реакция иЭРМ на фибронектин и ГФКБ может означать участие данных цитокинов в развитии и прогрессировании нейродегенеративного процесса в заднем отрезке глаз. В первичных иЭРМ ответственными за её формирование клеточными элементами являлись клетки СТ — фибробла-сты, миофибробласты, гиалоциты и клетки сетчатки — радиальные глиоциты. В формировании рецидивирующей иЭРМ основная роль отводится только радиальным глиоцитам сетчатки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алтынбаев У.Р. Оценка уровня гликопротеинов в стекловидном теле при различных дегенеративных заболеваниях центральной области сетчатки // Казанский медицинский журнал. - 2015. - Т. 96. - № 3. - С. 358-360. [Altynbaev UR. Ocenka urovnja glikoproteinov v steklovidnom tele pri razlichnyh degenerativnyh zabolevanijah central'noj oblasti setchatki. Kazanskij medicinskij zhurnal. 2015;96(3):358-360. (In Russ.)]
2. Bravo R, Macdonald-Bravo H. Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) but not its synthesis depend on DNA replication. EMBO J. 1985;4(3):655-61.
3. Fraser-Bell SI, Guzowski M. Five-year cumulative incidence and progression of epiretinal membranes: the Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 2003;110(1):34-40. doi: 10.1016/ S0161-6420(02)01443-4.
4. Foos RY. Vitreoretinal juncture; topographical variations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1972;11:801.
5. Hikichi T, Takahashi M. Relationship between premacular cortical vitreous defects and idiopathic premacular fibrosis. Retina. 1995;15(5):413-416. doi: 10.1097/00006982-199515050-00007.
6. Grisanti SI, Heimann K, Wiedemann P. Origin of fibronec-tin in epiretinal membranes of proliferative vitreoretinopa-thy and proliferative diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol. 1993;77(4):238-42.
7. Guidry C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996;37(5):740-52. doi: 10.1136/bjo.77.4.238.
8. Kohno RI, Hata Y. Possible contribution of hyalocytes to idiopathic epiretinal membrane formation and its contraction. Br J of Ophthalmology. 2009;93(8):1020-1026. doi: 10.1136/bjo.2008. 155069.
9. Kishi S, Demaria C. Vitreous cortex remnants at the fovea after spontaneous vitreous detachment. International Ophthalmology. 1986;9(4):253-260. doi: 10.1007/BF00137539.
10. Mandal N, Kofod M. Proteomic analysis of human vitreous associated with idiopathic epiretinal membrane. Acta Ophthalmologic. 2013;91(4):333-334. doi: 10.1111/aos.12075.
11. Schumann RG, Eibl KH, Zhao F, et al. Immunocytochemical and ultrastructural evidence of glial cells and hyalocytes in internal limiting membrane specimens of idiopathic macular holes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2011;52(11):7822-7834. doi: 10.1167/iovs.11-7514.
12. Snead DR, Cullen N. Hyperconvolution of the inner limiting membrane in vitreomaculopathies. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2004;242(10):853-862. doi: 10.1007/s00417-004-1019-3.
13. Weller MI, Wiedemann P. The significance of fibronectin in vitreoretinal pathology. A critical evaluation. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1988;226(3):294-298. doi: 10.1007/BF02181200.
Сведения об авторах:
Урал Рифович Алтынбаев — канд. мед. наук, врач офтальмологического отделения МСЧ ОАО «Татнефть». Республика Татарстан, Альметьевск. E-mail: [email protected].
Анна Ивановна Лебедева — канд. биол. наук, заведующая лабораторией гистологии и иммуногистохимии отдела морфологии, ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии», Уфа. E-mail: [email protected].
Information about the authors:
Ural R. Altynbaev — MD, PhD. Ophthalmology Department, Medical Unit, OAO "Tatneft". Republic of Tatarstan, Almetyevsk. E-mail: [email protected].
Anna I. Lebedeva — PhD, head of histology and immunohis-tochemistry laboratory. Morphology Department, Federal State Institution "All-Russian Eye and Plastic Surgery Center", Ufa. E-mail: [email protected].
