CC BY
16УДК 633.66
Морфолопчш та цитолопчм ознаки визначення тетрапло1Д1*в стевИ' медово!
Г. В. Цв1'гун
1нститут бюенергетичних культур 1 цукрових бурямв НААН УкраТни [email protected]
Мета. Визначити особливост анатомо-морфолоп'чних ознак рослин стев11 для прискорення 1дентиф1кац11 тетраплощних форм. Методи. Польовий, лабораторний 1 метод диспера'йного анал1зу. Результати. Встановлено, що характерною особливктю анатомо-морфолоп'чних ознак тетраплощних форм стев11 пор1вняно з диплощними е 61'льший листковий 1ндекс (19-38%), менша мльмсть продих1в на одиниц площ1 (на 39-48%), б1льший д1аметр пил-кових зерен (на 42-92%). Висновки. Допом1жними критер1ями добору (експрес-метод) е параметри листково'1 пластинки, розм1ри продих1в 1 д1аметр пилку. У тетраплощних форм стев11 листковий 1ндекс (в1дношення довжини до ши-рини листково'1 пластинки), а також розм1р продих1в 1 д1аметр пилку е достов1рно большими пор1вняно з диплощними формами. Основним 1 найточншим критер1ем добору тетраплощних форм е визначення млькосп хромосом на основ1 цитолопчного анал1зу, що доц1льно використовувати на тзнших етапах добору.
Ключов! слова: стев1я, полнощи, тетраплощи, гексаплощи, листковий 1ндекс, хромосоми.
Вступ. Стев1ю медову (Stevia твЪаи^апа Бег1оп1) широко використовують в Укра1н1 та св1т1 як природний шдсолоджувач. Кр1м того, вона метить б1лки, мшерали (фосфор, кальщй, зал1зо, натр1й, магн1й, хром, кобальт, селен, кремнш), а також еф1рн1 оли, флавонощи, танши й ряд в1тамш1в, зокре-ма аскорбшову кислоту (в1тамш С), бета-каротин (провмамш А), р1бофлавш (в1тамш В2). Гл1козиди листк1в стеви мають так1 тех-нолог1чн1 характеристики: швидко розчи-няються у вод1, добре поеднуються з орга-н1чними кислотами овоч1в та фруктов, зали-шаються шд час кип'ятшня, е стшкими до кислих 1 лужних середовищ [1-3].
Створення тетрапло'1'дних форм стеви' дасть можлив1сть зб1льшити вих1д рослинно! бюмаси за рахунок шдвищення продуктивность Полшло'1дш. рослини характеризують-ся комплексом анатомо-морфологачних ознак, ф1з1олог1чних 1 б1ох1м1чних властивостей, як1 зумовлен1 1хн1м генотипом. Тетраплощи в1д-р1зняються в1д дипло'1дав за вегетативною масою, висотою рослин, к1льк1стю стебел, зменшеною довжиною м1жвузл1в [4], величиною й товщиною листк1в, формою листково! пластинки, зап1зн1лим цв1тшням. Ц1 ознаки й властивост1 дають змогу досить легко роз-шзнати 1х серед вих1дних диплощних форм.
Полшлощи 1дентиф1кують також за роз-м1рами кл1тини, збшьшення яких безпосеред-ньо пов'язане з подвоенням к1лькост1 хромосом. Для цього найчаст1ше використовують кл1тини продихового апарату (форма, розм1ри та характер контуру клгтин ниж-ньо! ешдерми) та пилков1 зерна. У процесс переходу рослин на больший р1вень пло1д-
ност1 розм1ри продих1в 1 пилкових зерен зб1льшуються на 20-35% [5, 6].
3 л1тературних джерел в1домо, що розм1-ри продих1в залежать в1д р1вня геному - чим вища плоНдшсть, тим большим е розм1р продихового апарату та меншою к1льк1сть проди-х1в на одиницю площ1 [7, 8]. Тому цей крите-р1й може бути допом1жним для прискорення вдентифшаци тетраплоИдних рослин стеви'.
Метою дослвджень е визначення особливос-тей анатомо-морфолог1чних ознак рослин стеви' для прискорення вдентифшаци тетра-пло1дних форм. Для досягнення поставлено! мети необх1дно було виконати так1 завдання:
- встановити в1дм1нн1сть м1ж листковими пластинками рослин стеви р1зно1 пло1дност1;
- досл1дити параметри продихового апара-ту та пилкових зерен пол1пло!дних форм;
- визначити доц1льн1сть проведення добору за морфолог1чними та цитолог1чними озна-ками.
Матер1али та методика дослщжень. Досл1-дження проводили протягом 2006-2010 рр. у лаборатори стеви та на досл1дному пол1 1нституту б1оенергетичних культур 1 цукрових буряк1в НААН.
Вих1дним матер1алом були дипло!дн1 селек-ц1йн1 номери стев1! 1 м 1 3Н (контроль), як1 обробляли колх1цином для пол1пло!дизац1!. М1кроклональне розмноження рослин стеви проводили за методикою I. I. 1льенка [9].
Для досл1джень параметр1в морфолог1чних ознак з кожного вар1анта в1дбирали по 30 рослин, на 10 листках одного в1ку визнача-ли параметри листкових пластинок та вив-чали продиховий апарат за допомогою ма-церацшного методу з використанням сум1ш1
Щульце (концентрация НМ03 з додаванням кристал1в КС103). Для цього вир1зали шма-точки ешдерми 1з середньо! частини листко-во1 пластинки. П1д микроскопом розглядали верхню та нижню ешдерму, визначали тип продихового апарату та к1льк1сть кл1тин еп1-дерми [10]. Встановлювали к1льк1сть проди-х1в у пол1 зору микроскопа в перерахунку на 1 мм2, вим1рювали довжину й ширину про-дих1в у 20-разов1й повторюваност1.
Д1аметр пилкових зерен вим1рювали за до-помогою лшшного окуляр-м1крометра. Р1-вень пло1дност1 встановлювали методом шд-рахунку к1лькост1 хромосом у точках росту [11]. Отримаш експериментальн1 дан1 досл1-джень обробляли за допомогою дисперс1й-ного анализу на комп'ютер1, застосовуючи прикладш програмами Ехсе1 [12].
Результати дослщжень. П1сля колхщину-вання рослин в умовах 1и и1ио протягом трьох поколшь видаляли дипло1дн1 рослини.
Змши параметров листково! пластинки рослин стеви використовували як д1агностичн1 ознаки полшлоИдних форм. Вим1рювання листково! пластинки селекцшних номеров у поколшт Р1-Е3 та визначення ввдношен-ня довжини до ширини листка св1дчать, що листковий шдекс значною м1рою залежить в1д змши р1вня пло1дност1 рослин (табл. 1). Листковий шдекс тетрапло1дних форм вар1ю-вав у межах в1д 2,5 до 2,9 та був достов1р-но вищим за листковий шдекс дипло'1'дних 1 гексапло'1'дних форм. Гексапло1дн1 геноти-пи 66-1м-9 та 66-1м-16 мали значно нижчий листковий шдекс (1,6 та 1,7), шж контроль (2,1), а гексаплоИдш форми 66-ЗН-З та 66-ЗН-8 (2,0 1 1,9) не в1др1знялися в1д контролю.
Враховуючи достов1рн1 в1дмшност1 параметров листково! пластинки у форм стеви р1зно! пло1дност1, можна застосовувати як допом1жний критерш морфолопчш показни-ки для добору бажаних тетрапло'1'дних гено-тип1в. Це дасть можлив1сть на перших ета-пах виокремити тетрапло'1'ди з великого об-сягу селекцшного материалу, вони в1др1зня-ються в1д дипло1дних 1 гексапло'1'дних форм большими розм1рами листкових пластинок.
Кр1м того, доб1р тетрапло1'д1в за морфоло-г1чними ознаками може ускладнюватись у зв'язку з модиф1кац1йною м1нлив1стю дипло-!дних 1 тетрапло!них форм стев1!. Оск1льки за цими особливостями виявлено велик1 в1д-м1нност1 м1ж ними, то вони можуть бути маркерними ознаками для 1дентиф1кац1! те-трапло1'д1в лише на ранн1х етапах селекци, якщо ростуть в 1дентичних умовах. Таким чином, анатомо-морфолог1чн1 ознаки е д1аг-ностичними для попереднього визначення
пло!дност1 рослин, п1сля чого необх1дно про-водити цитолог1чний анал1з пло!дност1.
Таблиця 1
Пор1'вняльн1 параметри листково1 пластинки у вих'дних номер1*в та пол1пло1Д1в (/л у!'уо) рослин стевн
Селекф'йний номер Р1'вень плоТдносп Показники
параметри листково'1 пластинки, см листковий 1'ндекс
довжина ширина
1м (контроль) 22 7,1 3,4 2,1
44-1м-3 44 9,8 3,9 2,5
44-1м-7 44 11,6 4,2 2,7
44-1м-8 44 10,2 3,9 2,6
44-1м-12 44 11,5 3,9 2,9
66-1м-9 66 2,5 1,6 1,6
66-1м-16 66 2,3 1,3 1,7
ЗН (контроль) 22 6,8 3,2 2,1
44-ЗН 44 9,1 3,4 2,7
44-ЗН-5 44 11,3 4,0 2,8
66-ЗН-З 66 3,0 1,5 2,0
66-ЗН-8 66 3,7 1,9 1,9
Н1Р05 2,1 0,9 0,3
Таким чином, морфолог1чн1 особливост1 е д1агностичним засобом для масового вибра-ковування дипло!дних рослин на початко-вому етап1 добору, вони е допом1жними для зменшення великого обсягу робгг, але ви-р1шальними е цитолог1чн1 методи.
П1сля добору за морфолог1чними ознака-ми досл1джували тетрапло!ди за продиховим апаратом. Для стеви е характерним аномо-цитний тип продихового апарату, навколо продиху розм1щено 5-7 кл1тин, под1бних до еп1дермальних [8].
На основ1 досл1джень визначено розм1ри продих1в та виявлено р1зну 1х к1льк1сть на одиницю площ1 листково! поверхн1 в раз1 зм1ни р1вня пло!дност1 (табл. 2).
Таблиця 2
Характеристика продихового апарату листя стевн
Генотип Р1'вень пло'щносп Розм1'р продих1'в, мкм Ю'льк'сть продих'в на 1 мм2
довжина ширина
1м (контроль) 22 26 17 23
44-1м-3 44 38 20 12
44-1м-7 44 53 26 14
44-1м-8 44 51 27 12
44-1м-12 44 54 24 12
66-1м-9 66 31 18 17
66-1м-16 66 29 17 19
ЗН (контроль) 22 21 18 20
ЗН 44 51 30 12
44-ЗН 44 54 25 13
44-ЗН-5 44 52 22 12
66-ЗН-3 66 42 20 16
66-ЗН-8 66 37 19 17
Н^Р0,05 1,6 1,1 2,4
Виявлено, що у тетрапло'1дних кл1тин дов-жина продих1в зб1льшуеться в 1,3-1,6 раза пор1вняно з дипло'1'дними формами та змен-шуеться 1хня к1льк1сть на 1 мм2. У гекса-пло'1'дних форм к1льк1сть 1х також зменшу-еться.
Доб1р пол1пло1д1в зд1йснювали, використо-вуючи як критер1й добору розм1р пилкових зерен. Як ведомо, розм1р пилку може вар1ю-вати залежно в1д умов вирощування, але рослини 4х 1 6х, вирощен1 в 1дентичних умо-вах, характеризуются б1льшим д1аметром пилку. Тому ця особлив1сть е допом1жним критер1ем для 1дентиф1кац11 тетрапло1д1в.
У селекц1йного номера 1м (контроль) д1а-метр пилку був 18,7 мкм, у тетрапло1д1в в1н коливався з 26,5 до 35,9 мкм. У вих1дно-го номера ЗН д1аметр пилку тетрапло1д1в становив в1д 31,7 до 35,0 мкм пор1вняно з контролем - 17,2 мкм. Проте такий доб1р е можливим лише тод1, коли рослини сте-в11 вступають у генеративну фазу розвитку, адже тетраплощш И форми част1ше завер-шують пер1од вегетац11 1нтенсивним ростом, не утворюючи кв1тконосних пагон1в. У тет-рапло'1'дних рослин зб1льшуються розм1ри пилкових зерен пор1вняно з дипло'1'дними.
Як св1дчать результати досл1джень (табл. 3), розм1ри тетрапло'1дного пилку вар1ювали в
90 и 80 -
70 - н
60 50 40 30 20 10 0
За параметрами листю'в
межах 26,5-35,9 мкм. Проте параметри гек-сапло'1дного пилку селекц1йного номера 1м -16,0 1 19,2 мкм були близькими до контролю (18,7 мкм). Аналог1чна тенденц1я спостер1га-лася стосовно 1ншого вих1дного генотипу - ЗН.
Таблиця 3
Варшвання величини пилкових зерен стев!*!
Номер псшплоТдних лп'нтй Р1'вень пло'Тдносл Д1'аметр пилку стев1"Т, мкм
1м (контроль) 22 18,7
44-1м-3 44 26,5
44-1м-7 44 33,9
44-1м-8 44 35,9
44-1м-12 44 27,8
66-1м-9 66 16,0
66-1м-16 66 19,2
ЗН (контроль) 22 33,5
44-ЗН 44 35,0
44-ЗН-5 44 31,7
66-ЗН-З 66 19,4
66-ЗН-8 66 19,8
Н1Р0,05 - 4,2
Про доц1льн1сть проведення добор1в тет-рапло'1'дних рослин за морфолог1чними по-казниками св1дчить те, що за к1льк1стю хромосом (найточн1ший метод 1дентиф1ка-цИ пло'1'дност1) група добору в Е3 за розм1ра-ми продих1в зб1галася (див. рисунок).
За диаметром пилку
За розм1'рами продихтв
За ю'лью'стю хромосом
□ Р1 □ Р2 ■ Р3
Рис. Ефективн1*сть проведення добор1*в тетрапло!д1*в за морфолопчними та цитолоп*чними ознаками в покол!*ннях Р1-Р3 стев**!, %
За параметрами листк1в було в1д1брано в Е3 71% рослин пор1вняно з 82%, в1д1брани-ми за цитолог1чним контролем. За ознакою «д1аметр пилку» ефективн1сть добору була нижчою 1 становила в покол1нн1 Е3 44% пороняно з 82%. Тетрапло'1дн1 форми стеви ха-рактеризувалися спов1льненим розвитком 1 в Е0 покол1нн1 вони зак1нчили св1й пер1од ве-гетацл 1нтенсивним ростом. У зв'язку з цим неможливо 1х 1дентиф1кувати за характером
пилку. За д1аметром пилку вибракувано було найб1льше рослин в ус1х покол1ннях, хоча хромосомний анал1з цього не п1дтвердив.
За розм1рами продихового апарату та за к1льк1стю хромосом отримано наближен1 дан1 протягом покол1нь Е1 1 Е2, у к1нц1 добору результата були однаковими й становили 82%.
Висновки. Таким чином, за великих обсяг1в селекц1йного матер1алу на початкових етапах селекц11 доц1льно використовувати анатомо-
Mop^oaori^Hi noKa3HHKH aK KpHTepifi floSopy TeTpanaoiflHHX ^opM cTeBii'. TaKHMH flonoMi®-hhmh KpHTepiaMH floSopy (eKcnpec-MeTofl) e na-paMeTpn aHcTKoBoi naacTHHKH, po3MipH npoflH-xiB i fliaMeTp nHaKy. y TeTpanaoiflHHX $opM CTeBii ^HCTKOBHH iHfleKC (BiflHomeHHa floB^H-hh flo mapzHH aHcTKoBoi naacTHHKH), a TaKo® po3Mip npoflHxiB i fliaMeTp nHaKy e flocToBipHo SiatmHMH nopiBHaHo 3 flHnaoiflHHMH $opMaMH. Ochobhhm i HaHTo^HimHM KpHTepieM floSopy TeTpanaoiflHHX $opM e BH3Ha^eHHa KiatKocTi xpoMocoM Ha ocHoBi цнтoaori^нoro aHaai3y, m;o flo^iatHo BHKopHcToByBaTH y Siatm ni3Hix eTanaX floSopy.
OcoSaHBicTro aHaToMo-Mop^oaori^HHX o3HaK TeTpanaoiflHHX $opM cTeBii' nopiBHaHo 3 flHnaoiflHHMH e Te, m;o lXHifi aHcTKoBHH iHfleKc Ha 19-38% e SiatmHM, KiatKicTt npoflHXiB Ha oflнннцi naomi - Ha 39-48% MeHraoro, fliaMeTp nHaKoBHX 3epeH - Ha 42-92% SiatmHM.
BMKopwcTaHa ^iTepaTypa
1. Brendle J. E. Heritability for yield, leaf: stem ratio and stevioside content estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana / J. E. Brendle, N. Rosa // Can. J. Plant Sci. - 1992.
- Vol. 72. - P. 1263-1266.
2. ibp6aTeHK0 /1. E. CreBMfl - ^HHoe ni^eBoe ii ^eKapcTBeHHoe pacTeHMe / /. E. ibp6aTeHK0, 0. 0. fl3o6a // HoBbie m HeTpafli^iioHHbie pacTeHiifl m nepcneKTMBw mx wcn0^b30Ba-
ния : материалы V Междунар. симпозиума (Москва, 24-27 июня 2003 г.). - М., 2003. - Т. 3. - С. 317-319.
3. Lewis W. H. Early uses of Stevia rebaudiana leaves as a sweetener in Paraguay / W. H. Lewis // J. Econ. Bot. - 1992. - No 46. -P. 336-337.
4. Induction and morpho-chemical characterization of Stevia rebaudiana colchiploids / A. K. Yadav, S. Singh, S. C. Yadav [et al.] // Indian Journal of Agricultural Sciences. - 2013. - Vol. 83, No 2. - P. 159-169.
5. Селекф'я i наа'нництво альськогосподарських рослин : п"д-руч. / М. Я. Молоцький, С. П. Васильювський, В. I. Князюк, В. А. Власенко. - К. : Вища осв""та, 2006. - С. 175.
6. Бреславец Л. П. Полиплоидия в природе и опыте / Л. П. Брес-лавец. - М. : Наука, 1963. - 364 с.
7. Соловьёва Л. В. Практикум по цитологии / Л. В. Соловьёва. -М. : Изд-во Московского ун-та, 1982. - С. 49-52.
8. Chromosomal and morphological studies of diploid and polyploidcytotypes of Stevia rebaudiana Bertoni (Eupatorieae, Asteraceae) [Електронний ресурс] / V. M. de Oliveira, E. R. Forni-Martins, P. M. Magalhres, M. N. Alves // Genet. Mol. Biol.
- 2004. - Vol. 27, No 2. - Режим доступу : http://dx.doi. org/10.1590/S1415-47572004000200015.
9. Ильенко И. И. Введение в культуру стевии - источника низкокалорийного заменителя сахара / И. И. Ильенко. - К. : ВНИС, 1990. - С. 74- 78.
10. Баранова М. А. Классификации морфологических типов устьиц / М. А. Баранова // Бот. журн. - 1985. - Т. 70, № 12.
- С. 1585-1595.
11. Паушева 3. П. Практикум по цитологии растений / 3. П. Пау-шева. - М. : Агропромиздат, 1988. - 271 с.
12. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) / Б. А. Доспехов.
- 5-е изд., доп. и перераб. - М. : Агропромиздат, 1985. - 351 с.
УДК 633.66
Г. В. Цвигун. Морфологические и цитологические // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. -Цель. Определить особенности анатомо-морфологи-ческих признаков растений стевии для ускорения идентификации тетраплоидных форм. Методы. Полевой, лабораторный и метод дисперсионного анализа. Результаты. Установлено, что характерной особенностью ана-томо-морфологических признаков тетраплоидных форм стевии по сравнению с диплоидными является больший листовой индекс (19-38%), меньшее количество устьиц на единицу площади (на 39-48%), больший диаметр пыльцевых зерен (на 42-92%). Выводы. Вспомогательными критериями отбора (экспресс-метод) являются па-
признаки определения тетраплоидов стевии медовой 2015. - № 1-2 (26-27). - С. 11-14. раметры листовой пластинки, размеры устьиц и диаметр пыльцы. У тетраплоидных форм стевии листовой индекс (отношение длины к ширине листовой пластинки), а также размер устьиц и диаметр пыльцы являются достоверно большими по сравнению с диплоидными формами. Основным и самым точным критерием отбора тетраплоидных форм является определение количества хромосом на основе цитологического анализа, что целесообразно использовать на более поздних этапах отбора.
Ключевые слова: стевия, полиплоиды, тетраплоиды, гексаплоиды, листовой индекс, хромосомы.
UDC 633.66
H. V. Tsvihun. Morphological and cytological characters for defining Stevia 'Honeyleaf tetraploids // Sortovyvchennia ta okhorona prav na sorty roslyn (Plant Varieties Studying and Protection). - 2015. - № 1-2 (26-27). - P. 11-14.
Purpose. Determination of peculiarities of anatomical and morphological characters of stevia plants to accelerate the identification of tetraploid forms. Methods. Field, laboratory and analysis-of-variance methods. Results. It was established that larger leaf area index (19-38%), fewer stomata per unit area (by 39-48%), larger diameter of pollen grains (by 42-92%) is a characteristic feature of anatomical and morphological characters of stevia tetraploid forms as compared to diploid ones. Conclusions. The parameters of leaf plate, the size of stomata and diameter of
pollen grains are auxiliary selection criteria (rapid test). For tetraploid forms of stevia, leaf area index (the ratio of leaf blade length to width), size of stomata and diameter of pollen grains is truly larger as compared to diploid forms. Chromosomes number determination based on cytological analysis is the major and the most accurate criterion for selection of tetraploid forms, that seems advisable to use it at later stages of selection.
Keywords: stevia, polyploids, tetraploids, hexaploids, leaf area index, chromosomes.
Hadiuwfia 4.11.14
