CC BY
18МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
О.В.Бухарин1, Н.Б.Перунова1, Е.В.Иванова1, А.С.Васильченко1, Л.Н.Чуркина2, Л.В.Авдеева2, Л.В.Ярошенко2
МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ БИОПЛЕНОК STAPHYLOCOCCUS AUREUS ПОД ДЕЙСТВИЕМ БАТУМИНА
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного, Киев, Украина
Цель. Изучение влияния батумина, выделенного из метаболитов бактерии Pseudomonas batumici, на формирование биопленок стафилококков под контролем атомно-силовой микроскопии. Материалы и методы. В качестве тест-культур использовали S. aureus 25923 (АТСС) и S. aureus 104. В экспериментах исследовали батумин со степенью очистки 80%. Микроскопическое исследование препаратов проводили на атомно-силовом микроскопе SMM-2000 (ОАО ПРОТОН-МИЭТ, Россия) в контактном режиме в воздушной среде. Образование биопленок (БПО) изучали фотометрическим методом (O'Toob G.A., 2000). Диссоциацию микробной популяции выявляли при рассеве стафилококков на агаризо-ванную среду LB. Результаты. Под действием препарата визуально были отмечены изменения структурного компонента биопленки — экзополимерного матрикса и снижение количества адгезированных стафилококков в виде отдельных островковых образований. Аналогичная закономерность была выявлена при определении биопленкообразования стафилококков фотометрическим методом. Также под действием батумина происходило перераспределение клональной структуры S. aureus с появлением диссоциантов, не обладающих способностью образовывать биопленки, и снижение количества клонов с высокими значениями БПО. Заключение. Полученные данные раскрывают один из механизмов антимикробного действия батумина, основанного на подавлении препаратом биопленкообразования стафилококков.
Журн.микробиол., 2013, № 5, С. 3—8
Ключевые слова: биопленка, батумин, клональная структура, атомно-силовая микроскопия, S. aureus
O.V.Bukharin1, N.B.Perunova1, E.V.Ivanova1, A.S.Vasilchenko1, L.N.Churkina2, L.V.Avdeeva2, L.V.Yaroshenko2
MORPHO-FUNCTIONAL CHANGES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS BIOFILMS UNDER THE EFFECT OF BATUMIN
1Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia; 2Zabolotny Research Institute of Microbiology and Virology, Kiev, Ukraine
Aim. Study the effect of batumin isolated from metabolites of Pseudomonas batumici bacteria on the formation of biofilms by staphylococci under the control of atomic force microscopy. Materials and methods. S. aureus 25923 (АТСС) and S. aureus 104 were used as test cultures. Batumin with the degree of purification of 80% was used in the experiments. Microscopy of the preparations was carried out on atomic force microscope SMM-2000 (Proton-MIET Closed Joint-Stock Company, Russia) in contact mode in air environment. Biofilm formation (BFF) was studied by photometric method (O'Toole G.A., 2000). Dissociation of microbial population was detected during seeding of staphylococci into agarized LB medium. Results. Changes of structural component of biofilm were noted visually under the effect of the preparation — exopoly-meric matrix and reduction of quantity of adherent staphylococci in the form of separate islet
formations. Similar pattern was detected during determination of staphylococci biofilm formation by photometric method. Redistribution of S. aureus clonal structure with the appearance of dissociants that do not possess the ability to form biofilms and reduction of quantity of clones with high values of BFF also occurred under the effect ofbatumin. Conclusion. The data obtained reveal one of the mechanisms of antimicrobial effect of batumin based on suppression of staphylococci biofilm formation by the preparation.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 5, P. 3-8
Key words: biofilm, batumin, clonal structure, atomic force microscopy, S. aureus ВВЕДЕНИЕ
Одним из перспективных направлений в настоящее время в борьбе с лекарственно устойчивыми возбудителями инфекций рассматривается разработка новых антимикробных препаратов на основе метаболитов микроорганизмов. К числу таких средств можно отнести батумин, выделенный из бактерии Pseudomonas batumici (Esi-pov S.E., Kiprianova E.A., 1996), проявлявший высокую избирательную антимикробную активность в отношении стафилококка [2]. Выявленный хороший антимикробный эффект батумина в отношении биопленкообразования бактерий [1] определил дальнейшее развитие наших исследований в этом направлении с использованием метода атомно-силовой микроскопии для изучения ультраструктуры биопленок стафилококков.
Возможность применения атомно-силовой микроскопии (АСМ) для исследования морфофункциональных особенностей биопленок заложена высоким пространственным разрешением визуализации метода и отсутствием при использовании АСМ ряда существенных недостатков электронной микроскопии [3]. К тому же, посредством АСМ были визуализированы и количественно охарактеризованы ультраструктурные и механические особенности клеток биопленок Haemophilus influenzaе и Pseudomonas putida, в том числе формирующихся при различных условиях окружающей среды [4,
9].
В связи с этим, целью нашей работы было изучение влияния батумина на формирование биопленок стафилококков под контролем атомно-силовой микроскопии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При изучении влияния батумина на биопленкообразование бактерий рода Staphylococcus в качестве тест-культур использовали S. aureus 25923 (ATCC) и S. aureus 104 (клинический изолят, выделенный при гнойной раневой инфекции (коллекция ИКВС УрО РАН). Выбор штаммов был обусловлен тем, что S. aureus 25923 и S. aureus 104 проявляли типичные для коагулазоположительных стафилококков биологические свойства: лецитиназную, гемолитическую, плазмокоагулазную, антилизоцимную активность, а также обладали способностью к биопленкообразованию.
В экспериментах использовали батумин со степенью очистки 80%, получение которого осуществляли в Институте микробиологии НАН Украины с использованием высокопродуктивного мутантного штамма Pseudomonas batumici 17 по оригинальным методикам.
В экспериментах применяли батумин в концентрации 0,125 мкг/мл, определенной (в ранее проведенных опытах) как концентрация препарата, эффективно подавляющая биопленкообразование исследуемых штаммов стафилококков [1].
Методика изучения биопленок с использованием метода атомно-силовой микроскопии включала помещение покровных стекол, выполняющих функцию подложек, непосредственно в среду культивирования микроорганизмов, где в результате естественной адгезии клеток к стеклянной поверхности происходило формирование биопленок [6, 7].
При проведении исследований чистые покровные стекла помещали в пробирки с жидкой питательной средой LB (Sigma-Aldrich, США) с последующей стерилизацией при 2,0 атм и температуре 120°С в течение 30 минут. В опытные пробирки вносили батумин, растворенный в этаноле с 3% DMSO в концентрации 0,125 мкг/мл, в контроле — эквивалентное количество растворителя. В стерильную питательную среду иннокулировали 0,1 мл суспензии клеток 1-суточной агаровой культуры стафилококков в физиологическом растворе. Микроорганизмы культивировали втечение 72 часов при 37°С. По истечении периода культивирования покровные стекла изымали из пробирок и отмывали бидистиллированной водой от питательной среды и не-адгезированных к стеклу клеток.
Микроскопическое исследование препаратов проводили на атомно-силовом микроскопе SMM-2000 (ОАО ПРОТОН-МИЭТ, Россия) в контактном режиме в воздушной среде. При микроскопии использовали зонды для контактной атомно-силовой микроскопии MSCT-AUNM (Veeco, США) с жесткостью балки 0,03 Н/м и радиусом кривизны зонда 10 нм. Количественный морфометрический анализ проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа.
Кроме того, образование биопленок (БПО) исследовали фотометрическим методом, определяя способность штаммов микроорганизмов к адгезии на поверхности 96-луночной полистероловой планшеты с последующей окраской кристаллвиолетом [8]. Измерения оптической плотности проводили на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Значения биопленкообразования стафилококков выражали в условных единицах (ед.), которые представляли собой отношение оптической плотности изучаемой культуры (опыт) к оптической плотности питательного бульона (контроль).
Определение диссоциации микробной популяции выявляли при рассеве микроорганизмов на агаризованные среды LB с получением 100 колоний. Градацию по уровню биопленкообразования микроорганизмов в популяции проводили условно: низкие значения биопленкообразования соответствовали уровню БПО менее 1,5 ед., средние варьировали в диапазоне 1,5 — 2,5 ед., а высокие составляли более 2,5 ед. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Атомно-силовая микроскопия поверхности покровных стекол, использованных в качестве подложки, позволила выявить результат воздействия антимикробного препарата батумина на способность стафилококков формировать биопленку.
Исследование подложек, инкубированных в питательной среде, инокулированной эталонным штаммом S. aureus 25923 и клиническим изолятом S. aureus 104, позволило установить особенности образования биопленок изучаемых микроорганизмов под действием батумина. Так, штамм S. aureus 25923 в контроле (отсутствие батумина в среде культивирования) формировал выраженную биопленку на поверхности стекла (рис. А). При визуализации поверхность биопленок была сформирована экзополи-мерным матриксом с погруженными в него клетками округлой формы (рис. Б), поперечные размеры которых (692±52 нм) оказались типичными для клеток S. aureus [5].
При внесении батумина в среду культивирования бактерий были отмечены признаки нарушения биопленкообразования S. aureus 25923: клетки штамма на поверхности подложки определялись в виде монослойных островковых образований (рис. В), в значительном количестве визуализировались отдельные частицы экзополимер-ного матрикса, расположенные между соседними клетками, на их поверхности и на подложке вблизи микроорганизмов (рис. Г). При этом средний диаметр клеток в подобных ассоциатах оказывался равным 734+123, что находилось в пределах физио-
АСМ-изображения топографии (А, В, Д, Ж) и отображения ошибки обратной связи (Б, Г, Е, З) клеток S.aureus.
А, Б — S.aureus 25923 (контроль, без внесения батумина); В, Г — S.aureus 25923 (опыт; культивирование бактерий с батумином); Д, Е — S.aureus 104 (контроль); Ж, З — S.aureus 104 (опыт). Шкала — 2 мкм (А, В, Д, Ж); 1 мкм (Б, Г, Е, З).
логических колебаний размера клеток исследуемого штамма, достоверно не отличаясь от значений контроля.
На стеклянной подложке, инкубированной со штаммом S. aureus 104, изолированным из раневого отделяемого пациента, в контрольных пробах зафиксировано значительное количество бактериальных клеток, расположенных в один сплошной слой (рис. Д). Средний диаметр клеток клинического изолята S. aureus 104 (1002±75 нм) превышал размеры эталонного штамма S. aureus 25923 (p<0,05). Изучение ультраструктуры поверхности клеток позволило выявить на них частицы экзополимерного матрикса (рис. Е), небольшое количество которого также определялось на поверхности подложки вблизи микробных клеток.
Под действием батумина клинический изолят S. aureus 104 на подложке также формировал островковые монослойные ассоциаты (рис. Ж), однако количество ад-гезированных к твердому субстрату клеток было существенно меньше, что свидетельствовало о нарушении образования биопленок стафилококка под действием батумина. При этом средний диаметр клеток стафилококка находился в пределах 988±142 нм, не отличаясь от значений контроля. На поверхности бактериальных клеток в незначительном количестве визуализировались частицы экзополимерного матрикса (рис. З).
Аналогичная закономерность, отражающая нарушение биопленкообразования стафилококков под влиянием батумина, была выявлена при определении БПО исследуемых штаммов фотометрическим методом. В результате проведенных исследований отмечено снижение значений биопленкообразования как эталонного штамма S. aureus 25923 с 2,6±0,1 до 1,8±0,1 ед. (p<0,05), так и клинического изолята S. aureus 104 с 3,1±0,2 до 1,9±0,1 ед. (p<0,05).
При определении популяционной структуры исследуемых штаммов стафилоко-кокков установлено, что под действием батумина происходило перераспределение клональной структуры эталонного и клинического штаммов S. aureus. В контроле популяция S. aureus 25923 содержала 35% клонов со значениями БПО менее 1,5 ед., 30% диссоциантов с показателями биопленкообразования в диапазоне 1,5 ед. — 2,5
ед. и 35% — со значениями БПО более 2,5 ед. Соинкубирование микроорганизмов с антибиотиком батумином приводило к изменению популяционной структуры стафилококков, в сравнении с контролем: увеличивалась численность вариантов с низкими значениями биопленкообразования (50% клонов), снижалась доля диссоциан-тов с высокими (20%) и средними (15%) значениями БПО и появлялись клоны с нетипичным фенотипом — не обладающие способностью образовывать биопленки (15%).
Популяция клинического изолята S. aureus 104 в контроле также была представлена клонами с различной степенью выраженности признака: 20% диссоциантов с низкими значениями биопленкообразования, 35% клонов со средними значениями БПО и 45% — c высокими значениями свойства. При соинкубировании стафилококков с батумином отмечалась диссоциация популяции бактерий, в результате которой наряду с появлением вариантов (20%), не обладающих способностью образовывать биопленки, происходило увеличение доли диссоциантов (35%) с низким уровнем БПО. Кроме того, в популяции отмечалось снижение доли клонов со средними (20%) и высокими (25%) значениями биопленкообразования.
ОБСУЖДЕНИЕ
Биопленка — популяция микроорганизмов, растущая на различных биотических и абиотических поверхностях, является серьезной медицинской проблемой вследствие высокой устойчивости к антимикробным препаратам. Вот почему поиск средств, эффективно разрушающих микробную биопленку, актуален и стимулирует исследования междисциплинарного характера [1].
Применение атомно-силовой микроскопии позволило определить морфо-функциональные особенности биопленкообразования стафилококков под влиянием батумина. Под действием антимикробного препарата визуально были отмечены изменения структурного компонента биопленки — экзополимерного матрикса, а также снижение количества адгезированных к подложке клеток, выявляющихся в виде отдельных островковых образований. Полученные при помощи ACM данные были подтверждены фотометрическим методом оценки антимикробного действия препарата в отношении биопленок исследуемых стафилококков. Существенную поддержку этому выводу принесли исследования и популяционного анализа при оценке эффектов влияния батумина, показавшие угнетение БПО под действием этого препарата. К тому же, эти данные могут быть представлены в качестве одного из механизмов, раскрывающего антимикробное действие препарата на популяцию микроорганизмов на модели стафилококков.
Работа выполнена по проекту фундаментальньх исследований, выполняемых совместно с национальными академиями наук стран СНГ и отраслевых академий №12-С-4-1010 «Роль микробных метаболитов в формировании биопленок микроорганизмов».
Л ИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В., Чуркина Л.Н., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. и др. Влияние антистафилококкового антибиотика батумина на биопленкообразование микроорганизмов. Журн. микро-биол. 2012, 2: 8-12.
2. Клочко В. В., Киприанова Е. А., Чуркина Л. Н., Авдеева Л. В. Антимикробный спектр антибиотика батумина. Ыикробиол. журн. 2008, 70 (5): 41-46.
3. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян F.F., Романова Ю.Ы. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. Ыикробиология. 2010, 79 (4): 435-446.
4. Auerbach I.D., Sorensen C., Hansma H. G., Holden P. A. Physical morphology and surface properties of unsaturated Pseudomonas putida biofilms. J. Bacteriol. 2000, 182 (13): 3809-3815.
5. Eaton P., Fernandes J.C., Pereira E. et al. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects ofchitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy. 2008, 108 (10): 11281134.
6. Mitik-Dineva N., Wang J., Mocanasu R.C. et al. Impact ofnano-topography on bacterial attachment. Biotechnol. J. 2008, 3: 536-544.
7. Megan E.N., Martin M. O., Chan P. H. et al. Atomic force microscopy of bacterial communities. Meth. Enzymol. 2005, 397: 256-258.
8. O'Toole G.A., Kaplan A.N., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. An. Rev. Microbiol. 2000, 4: 49-76.
9. Teran Arce F., Carlson R., Monds J. et al. Nanoscale structural and mechanical properties of non-typeable Haemophilus influenzae biofilms. J. Bacteriology. 2009, 191 (8): 2512-2520.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Перунова Н.Б.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. 93532)77-86-97
© А.В.ВАЛЫШЕВ, А.С.ВАСИЛЬЧЕНКО, 2013 А.В.Валышев, А.С.Васильченко
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ДЕЙСТВИЯ КАТИОННОГО АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА НИЗИНА НА БАКТЕРИИ LISTERIA MONOCYTOGENES С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург
Цель. Характеристика морфо-функциональной реакции бактериальных клеток Listeria monocytogenes на воздействие катионного пептида низина. Материалы и методы. Культуру бактериальных клеток L. monocytogenes 88-BK выращивали в присутствии низина (опыт) и в его отсутствие (контроль). Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000. Исследование упругих свойств бактериальных клеток проводили с использованием АСМ в режиме силовой спектроскопии. Результаты. Выращенные в присутствии субингибиторных концентраций антибиотика микроорганизмы характеризовались изменением морфологии клеток и механических свойств, что посредством АСМ было зафиксировано как изменение размерных параметров бактерий, визуализированные локальные разрушения поверхности с увеличением ее шероховатости, а также снижение механической прочности клеточной стенки. Заключение. Использование атомно-силовой микроскопии позволяет детализировать механизмы биологической активности катион-ного пептида низина на грамположительные бактерии, оценить спектр произошедших изменений морфологических и механических параметров клеток, проанализированных в условиях, близких к нативным.
Журн. микробиол., 2013, № 5, С. 8—13
Ключевые слова: листерии, низин, катионные антимикробные пептиды, атомная силовая микроскопия
A.V.Valyshev, A.S.Vasilchenko
STUDY OF FEATURES OF THE EFFECT OF CATIONIC ANTIMICROBIAL PEPTIDE NISIN ON LISTERIA MONOCYTOGENES BACTERIA BY USING ATOMIC-FORCE MICROSCOPY
Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia
Aim. Characteristic of morpho-functional reaction of Listeria monocytogenes bacterial cells to the effect of cationic peptide nisin. Materials and methods. Culture of L. monocytogenes 88-BK bacterial cells was grown in the presence of nisin (experiment) and without it (control). The samples obtained were studied by atomic-force microscopy method in contact mode by using scanning probe of SMM-2000 microscope. Study of elastic properties of bacterial cells was carried out by using AFM in force spectroscopy mode. Results. Microorganisms grown in the presence of subinhibitory concentrations of antibiotic were characterized by changes in cell morphology and
