Научная статья на тему 'Характеристика механизмов биологической активности циклоферона'

Характеристика механизмов биологической активности циклоферона Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
121
26
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
STAPHYLOCOCCUS AUREUS / ЦИКЛОФЕРОН / ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ / АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ / CYCLOFERON / PERSISTENCE FACTORS / ATOMIC FORCE MICROSCOPY

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Уткина Т. М., Потехина Л. П., Карташова О. Л., Васильченко А. С.

Цель. Изучение влияния циклоферона в экспериментальных и клинических условиях на персистентные свойства золотистых стафилококков, а также особенностей их морфофункциональной реакции методом атомно-силовой микроскопии. Материалы и методы. Исследования проведены на 12 клонах Staphylococcus aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя. Влияние циклоферона in vivo оценено на 26 резидентных стафилококковых бактерионосителях под контролем антикарнозиновой активности стафилококков. Антикарнозиновую активность определяли по Бухарину О.В. и др. (1999), биопленкообразование по O'Toole G.A. et al. (2000). Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SММ-2000. Результаты. Снижение персистентных свойств стафилококков под воздействием циклоферона в условиях in vitro и in vivo может рассматриваться в качестве одного из механизмов биологической активности препарата. Выявлено значительное увеличение шероховатости поверхности S.aureus и изменение их морфологии под воздействием циклоферона, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков. Заключение. Полученные данные расширяют представления о механизмах биологической активности циклоферона.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Уткина Т. М., Потехина Л. П., Карташова О. Л., Васильченко А. С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

CYCLOFERON BIOLOGICAL ACTIVITY CHARACTERISTICS

Aim. Study the effect of cycloferon in experimental and clinical conditions on persistence properties of aurococci as well as features of their morpho-functional reaction by atomic force microscopy. Materials and methods. The study was carried out in 12 Staphylococcus aureus clones isolated from mucous membrane of nose anterior part of a resident carrier. The effect of cycloferon in vivo was evaluated in 26 resident staphylococci carriers under the control of anti-carnosine activity of staphylococci. Anti-carnosine activity was determined by O.V. Bukharin et al. (1999), biofilm formation by G.A. O'Toole et al. (2000). Staphylococci treated with cycloferon were studied by atomic force microscopy in contact mode using scanning probe SMM-2000 microscope. Results. The decrease of persistence properties of staphylococci under the effect of cycloferon in vitro and in vivo may be examined as one of the mechanisms of biological activity of the preparation. A significant increase of S. aureus surface roughness and changes in their morphology under the effect of cycloferon allow stating the disorder of barrier functions in the aurococci cell wall. Conclusion. The data obtained expand the understanding of cycloferon biological activity mechanisms.

Текст научной работы на тему «Характеристика механизмов биологической активности циклоферона»

8. Немцева Н.В., Селиванова Е.А., Плотников А.О. Роль симбиотических взаимодействий в выживании микроорганизмов в гипергалинных водоемах. Журн. микробиол. 2006, 4: 117-120.

9. Новожилова М.И., Фролова Л.Ф. Микрофлора лечебных грязей Казахстана. Алма-Ата, Наука, 1975.

10. Определитель пресноводных водорослей СССР. Под ред. М.М. Голлербаха. М.-Л., Изд-во АН СССР, 1951 — I986.

11. Пономаренко С.П., Паршикова ТВ. Экспресс-оценка эффективности биологически активных веществ на тест-культурах водорослей. Альгология. 2001, 1 1(4): 495-501.

12. Царенко П. М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Украинской ССР. Киев, Наукова думка, 1990.

13. Alghazeer R., Whida F., Abduelrhman E. et al. Screening of antibacterial activity in marine green, red and brown macroalgae from the western coast of Libya. Natural Science. 2013, 5 (1): 7-14.

14. Amaro H.M., Guedes A.C., Malcata F.X. Antimicrobial activities ofmicroalgae: an invited review. Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. A. Mйndez-Vilas (ed.), 2011.

15. Christobel G.J., Lipton A.P., Aishwarya M.S. et al. Antibacterial activity of aqueous extract from selected macroalgae of southwest coast of India. Seaweed Res. Utilization. 2011, 33: 67-75.

16. Ghasemi Y., Moradian A., Mohagheghzadeh A. et al. Antifungal and antibacterial activity ofthe micro-algae collected from paddy fields of Iran: characterization of antimicrobial activity of Chroococcus disperses. J. Biological Sciences. 2007, 7 (6): 904-910.

Поступила 20.01.14

Контактная информация: Немцева Наталия Вячеславовна, д.м.н., проф.,

460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

Т.М.Уткина, Л.П.Потехина, О.Л.Карташова, А.С.Васильченко

ХАРАКТЕРИСТИКА МЕХАНИЗМОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОФЕРОНА

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Цель. Изучение влияния циклоферона в экспериментальных и клинических условиях на перси-стентные свойства золотистых стафилококков, а также особенностей их морфофункциональной реакции методом атомно-силовой микроскопии. Материалы и методы. Исследования проведены на 12 клонах Staphylococcus aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя. Влияние циклоферона in vivo оценено на 26 резидентных стафилококковых бактерионосителях под контролем антикарнозиновой активности стафилококков. Антикарнозиновую активность определяли по Бухарину О.В. и др. (1999), биопленкообразование — по O'Toole G.A. et al. (2000). Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SММ-2000. Результаты. Снижение персистентных свойств стафилококков под воздействием циклоферона в условиях in vitro и in vivo может рассматриваться в качестве одного из механизмов биологической активности препарата. Выявлено значительное увеличение шероховатости поверхности S.aureus и изменение их морфологии под воздействием циклоферона, что позволяет констатировать нарушение барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков. Заключение. Полученные данные расширяют представления о механизмах биологической активности циклоферона.

Журн. микробиол., 2014, № 4, С. 76—79

Ключевые слова: Staphylococcus aureus, циклоферон, факторы персистенции, атомно-силовая микроскопия

T.M.Utkina, L.P.Potekhina, O.L.Kartashova, A.S.Vasilchenko CYCLOFERON BIOLOGICAL ACTIVITY CHARACTERISTICS

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

Aim. Study the effect of cycloferon in experimental and clinical conditions on persistence properties of aurococci as well as features of their morpho-functional reaction by atomic force microscopy. Materials and methods. The study was carried out in 12 Staphylococcus aureus clones isolated from mucous membrane of

nose anterior part of a resident carrier. The effect of cycloferon in vivo was evaluated in 26 resident staphylococci carriers under the control of anti-carnosine activity of staphylococci. Anti-carnosine activity was determined by O.V. Bukharin et al. (1999), biofilm formation — by G.A. O'Toole et al. (2000). Staphylococci treated with cycloferon were studied by atomic force microscopy in contact mode using scanning probe SMM-2000 microscope. Results. The decrease of persistence properties of staphylococci under the effect of cycloferon in vitro and in vivo may be examined as one of the mechanisms of biological activity of the preparation. A significant increase of S. aureus surface roughness and changes in their morphology under the effect of cycloferon allow stating the disorder of barrier functions in the aurococci cell wall. Conclusion. The data obtained expand the understanding of cycloferon biological activity mechanisms.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 4, P. 76—79

Key words: Staphylococcus aureus, cycloferon, persistence factors, atomic force microscopy

Золотистые стафилококки, вегетирующие на слизистой оболочке переднего отдела носа, вызывают развитие болезней органов дыхания, учащают и утяжеляют бронхолегоч-ные заболевания [8], влияют на развитие аллергических заболеваний респираторного тракта [3].

Одним из перспективных направлений профилактики данных заболеваний является использование лекарственных препаратов, обладающих не только прямым и опосредованным воздействием на иммунитет, но и универсальной противоинфекционной активностью [1].

К числу таких препаратов можно отнести циклоферон, который стимулирует иммунитет и естественную колонизационную резистентность слизистых оболочек макроорганизма [9], снижает способность микроорганизмов к инактивации комплемента [7], оказывает преимущественно ингибирующее действие на образование биопленок грибами Candida spp. [5]. Однако механизмы действия циклоферона на S.aureus изучены недостаточно.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния циклоферона в экспериментальных и клинических условиях на персистентные свойства золотистых стафилококков, а также особенностей их морфо-функциональной реакции методом атомно-силовой микроскопии.

В экспериментах использовали раствор циклоферона для внутривенного введения (ООО «Наука» — технологическая фармакологическая фирма «ПОЛИСАН», Санкт-Петербург).

Экспериментальное изучение влияния препарата на антикарнозиновую активность (АКрА) стафилококков [2] и их способность к образованию биопленок [11] проводили на 12 клонах S.aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа резидентного бактерионосителя по методике [7] в течение 10 дней с ежедневным пересевом. Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры золотистого стафилококка на плотную питательную среду в соответствии с [10].

Обработанные циклофероном стафилококки исследовали методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) в контактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия).

Клиническое наблюдение включало обследование на стафилококковое бактерионосительство 80 детей в возрасте 8 — 12 лет с формированием группы резидентных бактерионосителей из 26 человек, просанированных циклофероном в течение 10 дней с ежедневным бактериологическим контролем.

Экспериментальное изучение влияния циклоферона на персистентные свойства золотистых стафилококков было проведено методом популяционного анализа. При определении популяционной структуры исследуемых штаммов стафилококков установлено, что под действием циклоферона происходило перераспределение клональной структуры исходной культуры S.aureus. В контроле популяция золотистого стафилококка содержала 67% клонов с высокими значениями АКрА 2,0 — 3,0 мг/мл; 16,5% диссоциантов со значениями признака в диапазоне 1,0 — 1,9 мг/мл; 16,5% клонов не обладали способностью к инактивации карнозина. Среднепопуляционный уровень АКрА составлял 2,1±0,3 мг/ мл.

Соинкубирование стафилококков с циклофероном приводило к изменению популя-ционной структуры стафилококков в сравнении с контролем: увеличивалось число клонов, не обладающих АКрА (76%), снижалась доля диссоциантов со средними значениями признака (8%) и появлялись клоны с низким (0,1 — 0,9 мг/мл) уровнем активности (16%). Среднее значение антикарнозиновой активности в популяции снизилось до 0,2±0,12 мг/ мл.

Одновременно нами проведено изучение влияния циклоферона на способность золотистых стафилококков образовывать биопленки. Популяция З.аигеш была представлена клонами с различной степенью выраженности признака: 80% клонов со средними значениями биопленкообразования (от 1,9 до 2,5) и 20% диссоциантов с высокими значениями свойства (2,6 и более), средняя способность популяции образовывать биопленки была равна 2,44+0,04.

При соинкубировании стафилококков с циклофероном отмечалась диссоциация популяции бактерий, в результате которой 80% клонов характеризовались низким уровнем биопленкообразования (1,1 — 1,8) и 20% диссоциантов не обладали способностью образовывать биопленки, средний уровень БПО в популяции составил 1,26+0,05.

Полученные экспериментальные данные послужили основанием для проведения клинических исследований: по трехкратному бактериологическому обследованию была сформирована группа резидентных стафилококковых бактерионосителей и определена антикарнозиновая активность у S.aureus, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа этих лиц. Среднее значение признака составило 1,8 мг/мл. В зависимости от исходного уровня АКрА все исследуемые штаммы стафилококков были разделены на три группы: с низкими значениями признака (0,7 мг/мл и 0,9 мг/мл) — 15,4% выделенных штаммов, средними значениями (от 1,1 мг/мл до 1,7 мг/мл) — 46,2% стафилококков и высокими значениями (от 2,2 мг/мл до 3,0 мг/мл) — 38,5% S.aureus.

Под влиянием циклоферона было отмечено уменьшение числа бактерионосителей S.aureus до 19,0%, снижение обсемененности слизистых оболочек золотистыми стафилококками с 5х103 до <1х103 КОЕ/мл и с 1х103 КОЕ/мл до единичных колоний.

Среднее значение АКрА у выделенных штаммов S.aureus составило 0,9 мг/мл, низкие значения признака (от 0,2 до 0,7 мг/мл) отмечены у 41,6% штаммов, средние — в диапазоне от 1,1 мг/мл до 1,5 мг/мл у 58,3% золотистых стафилококков, высоких значений АКрА у культур не было.

Таким образом, проведенные экспериментальные и клинические исследования по изучению биологической активности циклоферона показали однозначное снижение персистентных свойств стафилококков под действием этого препарата. Полученные данные могут быть представлены в качестве одного из механизмов, раскрывающего антибактериальное действие циклоферона.

Далее изучали особенности морфо-функциональной реакции S.aureus на воздействие циклоферона с помощью атомно-силовой микроскопии.

Основные морфологические параметры бактерий, оцениваемые количественно, включали в себя: длину, ширину, высоту клеток, а также рассчитанный на этой основе объем бактерий. Проведенная на атомно-силовом микроскопе визуализация контрольных образцов S.aureus показала, что интактные бактериальные клетки имеют овоидную форму со средними значениями длины 0,64+0,09 мкм, ширины 0,88+0,10 мкм, высоты 0,64+0,05 мкм. АСМ ультраструктуры клеточной стенки интактных бактерий позволила охарактеризовать рельеф поверхности, среднеквадратичная шероховатость — отклонение точек профиля от его средней линии) которой составила 2,46+0,72 нм.

При культивировании S.aureus в присутствии терапевтических концентраций циклоферона (50 мг/мл) было отмечено увеличение длины бактерий на 23,4% и высоты клеток на 12,5%, при этом ширина клеток не изменялась. Кроме того, шероховатость поверхности стафилококков достоверно увеличивалась с 2,46+0,72 до 3,8+0,27 нм (р<0,05).

В работе установлено, что под действием циклоферона происходит снижение уровня антикарнозиновой активности и способности к биопленкообразованию S.aureus в результате внутрипопуляционной перестройки микробного сообщества, проявляющейся в значительном увеличении доли клонов с низкой выраженностью указанных свойств или их отсутствием.

Бактериологические исследования по выделению золотистых стафилококков у резидентных бактерионосителей с последующей оценкой антикарнозиновой активности штаммов показали, что влияние циклоферона приводило не только к снижению уровня микробной колонизации слизистой оболочки носа S.aureus и способности у них к инактивации карнозина, но и к исчезновению штаммов с высокой АКрА.

Выявленное совпадение результатов направленности воздействия регулирующего фактора на персистентные свойства стафилококков в условиях in vitro и in vivo согласуется с результатами работ по изучению влияния лекарственных средств на способность стафилококков к инактивации факторов естественной резистентности организма [4, 6].

С использованием атомно-силовой микроскопии детализированы механизмы биологической активности циклоферона в отношении S. aureus. Исследование ультраструктуры поверхности золотистых стафилококков выявило значительное увеличение ее шероховатости, а также изменение морфологии бактериальных клеток, что свидетельствует о нарушении барьерных функций клеточной стенки золотистых стафилококков под воздействием препарата.

Полученные материалы открывают перспективы для использования циклоферона в качестве препарата для санации резидентных стафилококковых бактерионосителей как превентивной меры в возникновении заболеваний верхних дыхательных путей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Башкина О.А., Бойко А.В., Красилова Е.В. Способ санации респираторного тракта бактерионосителей. Патент РФ № 2257223 от 27.07.2005.

2. Бухарин О.В., Чернова О.Л., Матюшина С.Б. Способность стафилококков к инактивации карнозина. Бюлл. экспер. биол. мед. 1999, 5: 545-546.

3. Высочина И.Л., Шостакович-Корецкая А.Е., Абатуров А.Е. Эффект аэрозольной терапии цикло-фероном у пациентов с хроническими ринитами. Грузинские медицинские новости. 2006, 135: 39-44.

4. Гандыбин Е.А., Карташова О.Л., Абрамзон О.М. и др. Микробиологические подходы к местному лечению венозно-трофических язв нижних конечностей. Грудная сердечно-сосуд. хирургия. 2008, 4: 47-50.

5. Гордеева С.В. Влияние иммуномодулирующих препаратов на образование биопленок дрожжевыми грибами. Пробл. мед. микол. 2009, 11 (2): 66.

6. Карташова О.Л., Уткина Т.М., Жестков А.В. и др. Влияние фитосубстанций, обладающих анти-оксидантной активностью, на персистентные свойства микроорганизмов. Антибиот. химиотерап. 2009, 9-10 (54): 16-18.

7. Кириллов Д.А. Лекарственная регуляция персистентных свойств микроорганизмов. Автореф. дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2004.

8. Красилова Е.В. Клинико-патогенетическое значение носительства стафилококка у часто болеющих респираторными заболеваниями детей. Автореф. дис. канд. мед. наук. Астрахань, 2003.

9. Романцов М.Г., Ершов Ф.И. Часто болеющие дети. Современная фармакотерапия. М., ГЭОТАР-Медиа, 2006.

10. Lederberg J., Lederberg E.M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol.

1952, 63: 399-406.

11. O'Toole G.A., Kaplan A.N., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. An. Rev. Microbiol.

2000, 4: 49-76.

Поступила 20.01.14

Контактная информация: Уткина Татьяна Михайловна, к.б.н., 460000, ул. Пионерская, 11, р.т., (3532)77-44-63

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.