CC BY
27
УДК 577.21:579.881.11+595.42
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ РИККЕТСИЙ, ПЕРЕНОСИМЫХ КЛЕЩАМИ IXODES PERSULCATUS SCHULZE НА ТЕРРИТОРИИ ЮГА ЗАПАДНОЙ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА
ИголкинаЯ.П.1, Бондаренко Е.И.2, Рар В.А.1, Епихина Т.Н.1, Панов В.В.3, ВысочинаН.П.4, Пуховская Н.М.4, Малькова М.Г.5, Василенко А.Г.5, Якименко В.В.5, Танцев А.К.5, Иванов М.К.2,6, Тикунова Н.В.1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Россия, 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8. Тел.: (383) 363-51-50 2ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск Россия, 630117, г. Новосибирск ул. Арбузова, д. 1/1, оф. 307, 309 3Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск Россия, 630091, Новосибирск, Россия, ул.Фрунзе, 11; office@eco.nsc.ru 4ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция» Роспотребнадзора, г. Хабаровск Россия, г. Хабаровск, пер. Санитарный, д. 7. Тел.: +7 (4212) 33-44-88 5Омский НИИ природноочаговых инфекций Роспотребнадзора, Россия, 644080, г. Омск, просп. Мира, 7; mail@oniipi.org 6Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Россия, 630090, Новосибирск, Россия, пр.ак. Лаврентьева, 10; icg-adm@bionet.nsc.ru
Методом двухраундовой ПЦР была изучена встречаемость риккетсий, переносимых клещами, среди имаго Ixodes persulcatus Schulze, 1930, собранных на территории юга Западной Сибири и Дальнего Востока (n=718). В Сибири и в Бикинском районе Хабаровского края в клещах I. persulcatus выявлялась только Candidatus Rickettsia tarasevichiae (30-83 % инфицированности). В остальных районах Хабаровского края в клещах выявлялись Candidatus R. tarasevichiae (74,0-85,1% инфицированности), R. helvetica (3,2-7,9 % инфицированности) и впервые в I. persulcatus - Rickettsia heilongjiangensis (7,0-17,8 % инфицированности). В большинстве случаев R. helvetica и R. heilongjiangensis выявлялись одновременно с Candidatus R. tarasevichiae. На Сахалине, в отличие от остальных исследованных областей, в I. persulcatus наиболее часто выявлялась R. helvetica (63,9 % инфицированности), в то время как Candidatus R. tarasevichiae обнаруживалась лишь у 5 % клещей.
Ключевые слова: риккетсии, Ixodes persulcatus, ПЦР.
Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-04-00567 и междисциплинарного интеграционного проекта № 135 фундаментальных исследований СО РАН.
MOLECULAR GENETIC ANALYSIS OF RICKETTSIA SPP. TRANSMITTED BY IXODES PERSULCATUS TICKS IN THE SOUTH-WESTERN SIBERIA AND THE FAR EAST
Igolkina Y.P.1, BondarenkoE.I.2, Rar V.A.1, Epikhina T.I.1, Panov V.V.3, VysochinaN.P.4, PukhovskayaN.M.4,
MalkovaM.G.5, Vasilenko A.G.5, Yakymenko V.V.5, Tancev A.K.5, IvanovM.K2-6, TikunovaN.V.1 institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk;
Join-stock company "Vector-Best", Novosibirsk;
3Institute of Systematics and Ecology of Animals, SB RAS, Novosibirsk;
"Khabarovsk Antiplague Station, Khabarovsk;
5Omsk Research Institute of Natural Foci Infections, Omsk;
6Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk
The prevalence of tick-borne Rickettsia spp. was examined by nested PCR in adult Ixodes persulcatus ticks collected in the South-Western Siberia and the Far East regions (n=718). Only Candidatus Rickettsia tarasevichiae was identified in I. persulcatus ticks in the studied sites in Siberia and in Bikinskyi region of
Молекулярно-генетические исследования
the Khabarovsk Territory (30-83% of infection). In the other studied regions of the Khabarovsk Territory, I. persulcatus ticks contained DNA of Candidatus R. tarasevichiae (74,0-85,1% of infection), R. helvetica (3,27,9% of infection) and, first in I. persulcatus - Rickettsia heilongjiangensis (7,0-17,8% of infection). In most cases, R. helvetica and R. heilongjiangensis were detected simultaneously with Candidatus R. tarasevichiae. On Sakhalin island, in contrast to other studied areas, R. helvetica prevailed in I. persulcatus ticks (63,9% of infection), while Candidatus R. tarasevichiae was detected only in 5% of ticks. Keywords: rickettsia, ixodid ticks, PCR.
Введение. На территории Сибири и Дальнего Востока регистрируют заболеваемость клещевым риккетсиозом, вызываемым Rickettsia sibirica sensu stricto, основные переносчики - клещи рода Dermacentor и Haemaphysalis concinna Koch, 1844 [4]. Кроме того, случаи клинически схожие с клещевым риккетсиозм, но вызванные Rickettsia heilongjiangensis были ретроспективно выявлены в Хабаровском крае [4, 7]. Основными переносчиками риккетсий этого вида являются клещи H. concinna [4, 7]. Однако в последнее время стали появляться данные о возможной патогенности видов, ранее считавшихся непатогенными. Примером таких риккетсий являются Candidatus Rickettsia tarasevichiae, широко распространенные в клещах Ixodes persulcatus [4, 8, 9]. Патогенность этого вида риккетсий не была установлена, тем не менее, недавно ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae была выявлена на территории Китая в образцах крови и первичного аффекта пациентов после укусов клещами [6]. Rickettsia helvetica, которая в настоящее время признана патогенной, была в единичных случаях выявлена в I. persulcatus на территории России [1, 3, 9]. И хотя случаи заболеваний, связанных с R. helvetica, в России не регистрируются, изучение распространенности этого вида рик-кетсий представляет особый интерес.
Целью данной работы было изучение встречаемости и генетического разнообразия рикке-тсий в клещах Ixodes persulcatus - главных переносчиках Candidatus Rickettsia tarasevichiae и Rickettsia helvetica на территории Сибири и Дальнего Востока.
Материалы и методы. Голодные имаго I. persulcatus были собраны с растительности на флаг в 2005-2012 годах на территории Дальнего Востока (Сахалин и Хабаровский край) и юга Западной Сибири (Омская и Новосибирская области) на 8 участках, различающихся по природно-климатическим условиям (Табл.). Видовую принадлежность клещей определяли по морфологическим признакам с последующим подтверждением методом видоспецифичной ПЦР [5]. Суммарную ДНК выделяли из суспензий клещей с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест»). Выявление в анализируемых пробах ДНК риккетсий по гену gltA проводи-
ли с помощью ПЦР в режиме реального времени с использованием наборов реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia spp.» (ЗАО «Вектор-Бест»).
Для выявления микстинфекций и определения видовой принадлежности положительных образцов проводили ПЦР в присутствии видоспеци-фичных праймеров из области гена gltA. В первом раунде использовали родоспецифичные праймеры, а во втором раунде - праймеры, специфичные для Candidatus Rickettsia tarasevichiae [3], и прай-меры, специфичные для всех остальных видов риккетсий, распространенных на изучаемой территории: RH1 5'-gtcagtctactatcacctatatag-3' и RH2 5'-ctcatgatcggcatgtagg-3'. ДНК части образцов, содержащих ДНК риккетсий, была подвергнута дополнительной амплификации с использованием родоспецифичных праймеров из области гена gltA: Rsp-F1 5'-gcaagtattggtgaggatgta-3' и Rsp-R1 5'-gttcagggtcttcgtgca-3' с последующим секвенировани-ем полученных ПЦР фрагментов длиной 1150 п.н.
результаты и обсуждение. ДНК риккетсий была выявлена в 468 из 718 имаго I. persulcatus, собранных на территории Дальнего Востока и юга Западной Сибири. На всех исследованных участках Западной Сибири и на одном участке Хабаровского края в клещах I. persulcatus выявлялась только ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae с уровнем инфицированности - 30, 66,7, 78 и 83 % для участков 2, 1, 4 и 3 соответственно (табл.).
На двух участках Дальнего Востока в клещах I. persulcatus выявлялись риккетсии двух видов -Candidatus Rickettsia tarasevichiae и R. helvetica. На участке 5 Хабаровского края в I. persulcatus преобладала ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae - 74,2 %, а ДНК R. helvetica выявлялась единично. На участке 8 (Сахалин) в клещах преобладала ДНК R. helvetica - 63,9 % инфици-рованности, напротив, ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae выявлялась редко - в 5 % случаев.
На участке 6 Хабаровского края в 74 % I. persulcatus была обнаружена Candidatus Rickettsia tarasevichiae, а в 7 % клещей была впервые обнаружена R. heilongjiangensis (табл.). При этом в подавляющем большинстве случаев (6 из 7) ДНК R. heilongjiangensis встречалась одновременно с Candidatus R. tarasevichiae.
В клещах I. persulcatus, собранных на участке 7 Хабаровского края, выявлялись три вида
ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)
риккетсий: CandidatusR. tarasevichiae,R. helvetica и R. heilongjiangensis. Уровень инфицированнос-ти составлял 85,1, 7,9 и 17,8 % соответственно. При этом R. heilongjiangensis во всех случаях, а R. helvetica в 7 из 8 клещей присутствовала вместе с Candidatus R. tarasevichiae.
Таблица
Выявление Rickettsia spp. в клещах Ixodes persulcatus, методом двухраундовой ПЦр
Участок Место сбора Год Число инфици-ров./ис-следов. клещей Число клещей, содержащих днк
R.ta R.hb R.hgc R.t+ R.h R.t+ R.hg
1 Новосибирская обл., Искитимс-кий р-н 2012 27/35 27 0 0 0 0
2 Новосибирская обл., Тогучинский р-н 2012 6/20 6 0 0 0 0
3 Омская обл Тевризский р-н., 2011 176/212 176 0 0 0 0
4 Хабаровский кр., Бикинс-кий р-н 2005 78/100 78 0 0 0 0
5 Хабаровский кр., с. Чича-говка 2005 24/31 23 1 0 0 0
6 Хабаровский кр., с. Сара-пульское 2006 75/100 68 0 1 0 6
7 Хабаровский кр., Ванинс-кий р-н 2011 88/101 62 1 0 7 18
8 Остров Сахалин 2011 82/119 6 76 0 0 0
aR.t-Candidatus R. tarasevichiae; bR.h-R. helvetica; cR.hg-R. heilongjiangensis
Определенные нуклеотидные последовательности гена gltA для всех образцов Candidatus R. tarasevichiae были идентичны известной последовательности (AF503167), для R. heilongjiangensis уровень гомологии с известной последовательностью данного вида из Haemaphysalis concinna (AB473994) составил 99,8-100 %, последовательности R. helvetica соответствовали известной последовательности R. helvetica из Ixodes
ricinus (U59723), но отличалась одной заменой от последовательности R. helvetica, выявленной в I. persulcatus в республике Коми (KF859958) [2].
Известно, что на территории России в клещах I. persulcatus преобладающим видом является Candidatus R. tarasevichiae [4, 8, 9]. Уровень инфицированности клещей, как было показано ранее, в разных регионах варьирует от 13,3 до 60,4 %. R. helvetica, напротив, выявлялась только в единичных случаях на Камчатке, в Омской и Челябинской области [1, 3, 9]. Исключением является Республика Коми, где в клещах I. persulcatus преобладала R. helvetica (9,4 % инфицированнос-ти) и только в 5 % клещей встречалась Candidatus R. tarasevichiae [2].
Результаты данного исследования подтверждают результаты предшествующих работ о том, что наиболее часто встречающимся видом риккетсий в клещах I. persulcatus является Candidatus R. tarasevichiae [3, 4, 8, 9]. ДНК этого вида выявлялась в клещах на всех изучаемых участках юга Западной Сибири и Дальнего Востока, хотя уровень инфицированности существенно различался - от 5 до 85,1 % (табл).
R. helvetica выявлялась только на Дальнем Востоке, при этом на территории Хабаровского края в клещах I. persulcatus этот вид встречался редко, а преобладала Candidatus R. tarasevichiae, и лишь на Сахалине наблюдалась обратная ситуация, когда преобладала R. helvetica. Несмотря на то, что R. helvetica выявлялась у 69 % I. persulcatus, случаев риккетсиозов, обусловленных данных видом риккетсий, на острове Сахалин не зарегистрировано.
Впервые в клещах I. persulcatus были выявлены патогенные риккетсии R. heilongjiangensis, что было подтверждено секвенированием. Ранее R. heilongjiangensis обнаруживалась на территории России (на Дальнем Востоке, в Красноярском крае и на Алтае) только в клещах родов Haemaphysalis и Dermacentor [4, 7, 8, 9].
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Иголкина Я.П., Фоменко Н.В., Ливанова Н.Н. и др. Выявление различных видов риккетсий у ик-содовых клещей, в крови людей и мелких млекопитающих на юге Западной Сибири и на Урале. // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т. 5, приложение 1. - С. 121-125.
2. Карташов М.Ю., Микрюкова Т.П., Тупота Н.Л. и др. Встречаемость и молекулярно-биологическая характеристика риккетсий из природных очагов Западной Сибири и Северного Урала. // Молекулярная диагностика. - 2014. - Т. 1. - C. 490-491.
3. Пуховская Н.М., Рар В.А., Иванов Л.И., и др. Выявление методом ПЦР возбудителей природно-очаго-вых инфекций, переносимых клещами, на полуострове
Камчатка. // Мед. параз. и паразит. болезни. - 2010. - № 4. - С. 36-39.
4. Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Самойленко И.Е. и др. Риккетсии и риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки в Сибири. - Омск, 2012. - 288 с.
5. Ткачев С.Е., Ливанова Н.Н. Разработка системы молекулярного видотипирования клещей Ixodes persulcatus и Ixodes pavlovskyi // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 5. - Ч.1. - С. 325-327.
6. Jia N., Zheng Y.C., Jiang J.F., et al. Human infection with Candidatus Rickettsia tarasevichiae. // N. Engl. J. Med. - 2013. - V. 369. - P. 1178-1180.
7. Mediannikov O., Sidelnikov Y., Ivanov L., et al. Far eastern tick-borne rickettsiosis: identification of two new
Молекулярно-генетические исследования
cases and tick vector. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. -V. 1078. - P. 80-88.
8. Shpynov S., Fournier P.E., Rudakov N., et al. Candidatus Rickettsia tarsevichiae in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2003. - V. 990. - P. 162-172.
9. Shpynov S., Fournier P.E., Rudakov N., et al. Detection of members of the genera Rickettsia, Anaplasma and Ehrlichia in ticks collected in the Asiatic part of Russia. //Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - V. 1078. - P. 378-383.
Иголкина Яна Петровна - инженер лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Бондаренко Евгений Иванович - канд. мед. наук, научный сотрудник лаборатории ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск Рар Вера Александровна - канд. биол. наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Епихина Тамара Ивановна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
Панов Виктор Васильевич - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Института систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск
Высочина Нэля Павловна - заведующая лабораторией паразитологии ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция» Роспот-ребнадзора
Пуховская Наталия Михайловна - канд. биол. наук, врач-вирусолог лаборатории паразитологии ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция» Роспотребнадзора
Малькова Марина Георгиевна - д-р биол. наук, доцент, главный научный сотрудник лаборатории арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Василенко Алексей Геннадьевич - младший научный сотрудник лаборатории арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Якименко Валерий Викторович - д-р биол. наук, заведующий лабораторией арбовирусных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Танцев Алексей Константинович - научный сотрудник лаборатории зоонозных инфекций ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Иванов Михаил Константинович - канд. биол. наук, заведующий лабораторией ПЦР ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск Тикунова Нина Викторовна - д-р биол. наук, доцент, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 1 октября 2014 г.
