CC BY
173
© Гудима Г.О., Хаитов Р.М., 2019 Гудима Г.О., Хаитов Р.М.
Молекулярно-биологические подходы к терапии ВИЧ-инфекции. Перспективы применения технологий редактирования генома для элиминации ДНК ВИЧ-1 из инфицированных клеток
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва, Россия
Антиретровирусная терапия (АРТ) способна эффективно снижать уровень вирусной нагрузки в плазме крови ВИЧ-инфицированных пациентов, однако вирус, скрытый в латентных резервуарах, недоступен для ее действия и обеспечивает персистирование инфекции. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка способов воздействия на провирусную ДНК, интегрированную в геном клетки-хозяина. В обзоре рассматриваются перспективные стратегии применения технологий редактирования генома для мутагенной деактивации генов вируса, удаления интегрированной ДНК ВИЧ-1 из генома клетки-мишени, а также ликвидации латентного резервуара инфекции.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция; антивирусная терапия; генотерапия; редактирование генома; рекомбиназа; CRISPR/Cas9; обзор
Статья поступила 17.10.2018. Принята в печать 16.11.2018.
Для цитирования: Гудима Г.О., Хаитов Р.М. Молекулярно-биологические подходы к терапии ВИЧ-инфекции. Перспективы применения технологий редактирования генома для элиминации ДНК ВИЧ-1 из инфицированных клеток. Иммунология. 2019; 40 (1): 44-51. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11005.
Финансирование. Работа не имела спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Гудима Георгий Олегович -доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: goudima@mail.ru. https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Gudima G.O., Khaitov R.M.
Molecular biological approaches to HIV infection therapy. Perspectives of usage of genome egiting technologies for HIV DNA elimination from infected cells
NRC Institute of Immunology, FMBA, Moscow, Russia
Antiretroviral therapy (ART) is able to effectively reduce the plasma viral load in HIV-infected patients. However virus hidden in latent reservoirs is unaccessible for ART and supports the persistence of infection. So the development of approaches to affect the proviral DNA integrasted in host cell genome is of great importance. Perspective strategies of the genome editing technologies for mutagenic deactivation of viral genes, HIV DNA removal from host cell genome and also for latent viral reservoir eradication are being analysed in the review.
Keywords: HIV-infection; antiviral therapy; gene therapy; genome editing; recombinase; CRISPR/Cas9; review
Received 17.10.2018. Accepted 16.11.2018.
For citation: Gudima G.O., Khaitov R.M. Molecular biological approaches to HIV infection therapy. Perspectives of usage of genome egiting technologies for HIV DNA elimination from infected cells. Immunologiya. 2019; 40 (1): 44-51. 10.24411/0206-4952-2019-11005. (in Russian)
Acknowledgments. The work had no sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For correspondence
Gudima Georgii O. -PhD, Professor, NRC Institute of Immunology FMBA, Moscow, Russia E-mail: goudima@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Основным препятствием для удаления ВИЧ-1 из организма инфицированного человека является латентный вирусный резервуар, который существует даже при долговременной антиретровирусной терапии (АРТ) и недоступен для химиопрепаратов. Удаление провирусной ДНК из инфицированных клеток рассматривается как принципиально важный подход к лечению ВИЧ-инфекции.
Этот подход был исследован с применением рекомбиназ (ферментов, способных к сайт-специфическому изменению расположения нуклеотидных последовательностей ДНК) [1], цинк-пальцевых нуклеаз ZFN (Zinc Fnger Nucleases) и нуклеаз TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), несущих ДНК-связывающие модули, которые распознают последовательности ДНК ВИЧ-1
[2-4]. Разработка технологии применения бактериальной противовирусной системы CRISPR/Cas9 для редактирования генов в клетках млекопитающих привела к интенсивным исследованиям, посвященным использованию этой системы для блокирования и элиминации вирусных инфекций, в том числе ВИЧ-инфекции [5-7].
CRISPR (сгруппированные регулярно расположенные палиндромные повторы, Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats) - особые локусы простейших, состоящие из повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями-спейсерами. Спейсеры содержат чужеродные генетические фрагменты, с которыми сталкивалась клетка. РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, совместно с ассоциированными белками Cas (CRISPR-associated) обеспечивают защиту клеток простейших от вирусов или плазмид за счет комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их белками Cas [5, 6].
Cas9 представляет собой эндонуклеазу, которая расщепляет двухцепочечную ДНК в специфических последовательностях. Cas9 формирует комплекс с одноцепо-чечной направляющей РНК (single guide RNA, sgPHK), 20 первых нуклеотидов которой комплементарно соединяются с последовательностью-мишенью ДНК [8]. Кроме sgPНК, Cas9 должна распознать мультинуклео-тидный участок, прилежащий к З'-концу ДНК-мишени, который называется PAM (Protospacer Adjacent Motif). Затем нуклеазный домен Cas9 осуществляет сайт-специфическое разрезание ДНК [9]. Разрезание ДНК индуцирует образование мутаций (делеций, вставок или замен), которые возникают в процессе репарации ДНК [10]. Синтезированы sgPНК, направляющие Cas9 к различным участкам ДНК ВИЧ-1, которые содержат структурные и регуляторные гены или LTR вируса. Их применение вызывало выраженную супрессию продукции ВИЧ-1 и распространения инфекции в различных типах клеток, в том числе первичных CD4+-Т-клетках и CD4+-Т-клеточных линиях [11-16].
Технологии генного редактирования и модуляции транскрипции генов на основе комплекса CRISPR/Cas9 рассматриваются в качестве перспективных стратегий генотерапии ВИЧ-инфекции и интенсивно исследуются. Основными направлениями терапевтического применения комплекса CRISPR/Cas9 являются предотвращение интеграции провирусной ДНК в геном клетки-мишени, вырезание интегрированной ДНК ВИЧ из генома клетки-мишени или мутагенная деактивация генов вируса, а также регуляция экспрессии клеточных факторов, необходимых для проникновения и репликации ВИЧ [17-19].
1. Система CRISPR/Cas9 - инструмент генного редактирования и модуляции транскрипции
CRISPR индуцирует направленные мутации ДНК и способствует защите бактерий от патогенных вирусов и плазмид [20, 21]. В 2012 г. была разработана модифицированная система CRISPR, включающая короткие
sgPHK и нуклеазу Cas9 Streptococcus pyogenes [22]. Эта упрощенная система может быть адаптирована к распознаванию целевых последовательностей ДНК практически любого организма, что определяет широту ее функционального применения [5, 6, 23]. Состоящая из 17-20 нуклеотидов sgPHK связывается с целевой последовательностью ДНК, а нуклеаза Cas9, направляемая этой sgPHK, катализирует расщепление ДНК. С помощью направленного мутагенеза в эндонуклеаз-ных доменах получена деактивированная Cas9 (dCas9), что позволило разработать программируемые РНК-зависимые ДНК-связанные белки [24, 25]. Соединение dCas9 с акцессорными белками - активаторами или супрессорами транскрипции - позволяет осуществить РНК-направляемое целевое регуляторное воздействие на определенные локусы ДНК, в том числе и на прови-русную ДНК ВИЧ [24-29].
Провирус ВИЧ с двух концов содержит идентичные LTR-участки. Комплекс CRISPR/Cas9, направленный против LTR, индуцирует разрезание ДНК в этих участках с обоих концов провируса. Процесс восстановления ДНК в удаленных участках между точками разрезания позволяет выявить расположение провируса в геноме хозяина [11, 29, 30]. Целевые sgPHK, направленные к нескольким сайтам 5'-LTR, способны привести к потере промоторной активности этого участка и деактивации провируса [29]. Также sgPHK могут быть направлены к специфическим вирусным рамкам считывания, что приводит к появлению вставок и/или делеций, которые изменяют функциональность белков вируса, и, как следствие, вызывают нарушение образования новых вирионов [13].
Преимуществом системы CRISPR/Cas9 является легкость «программирования» sgPHK, которая экспресси-руется независимо от Cas9 (или dCas9). Множественные sgPHK способны взаимодействовать со множественными целевыми участками ДНК при одновременной экспрессии одного и того же белка Cas9. Таким образом, система CRISPR/Cas9 может рассматриваться как потенциальное средство редактирования вирусных генов и модуляции их активности. Постоянное совершенствование позволило снизить количество ошибок системы CRISPR/Cas9 практически до нуля [31].
С помощью системы CRISPR/Cas9 удалось с высокой точностью удалить из латентно ВИЧ-инфицированных культивируемых CD4+-Т-клеток человека участок интегрированной провирусной ДНК между 5'- и 3'-LTR. Полногеномное секвенирование не выявило никаких нарушений целостности клеточного генома после взаимодействия с CRISPR/Cas9. Клетки сохраняли жизнеспособность и функциональную активность. Персисти-рующая коэкспрессия Cas9 и специфических целевых sgPHR^ в очищенных от вирусного генома Т-клетках обеспечивала их защиту от повторной инфекции ВИЧ-1. Введение CRISPR/Cas9 с помощью лентивирусного вектора значительно снижало репликацию вируса в ВИЧ-инфицированных первичных CD4+-Т-клетках человека in vitro и существенно уменьшало уровень вирусной нагрузки в культурах CD4+-Т-клеток ВИЧ-инфицированных
пациентов ex vivo [15]. Генное редактирование с применением системы CRISPR/Cas9 рассматривается как основа подхода к элиминации ДНК провируса ВИЧ-1 из инфицированных СБ4+-Т-клеток и потенциально эффективной стратегии лечения ВИЧ-инфекции/СПИДа.
2. CRISPR/Cas9-опосредованная реактивация латентного ВИЧ-1
Ген-специфическая активация транскрипции была достигнута с использованием различных вариантов CRISPR/Cas9. Исходные комплексы включали dCas9, соединенную с С-концевым доменом активации транскрипции вируса герпеса (VP16 или VP64), для модуляции эндогенной экспрессии генов. Совместное действие белков слияния dCas9-VP16, dCas9-VP64 и sgPHK приводило к высокоспецифическому усилению экспрессии целевых генов [24, 26-28, 32]. Активация транскрипции усиливалась при использовании множественных неперекрывающихся sgPHK, направленных к одному и тому же промотору, что приводило к рекрутированию нескольких копий dCas9-VP64 [26-28, 32]. Применение множественных активационных доменов в сочетании с одной молекулой dCas9 также усиливало РНК-опосредованную активацию транскрипции [33]. В этом случае использовалась полипептидная конструкция SunTag, которая обеспечивала рекрутирование нескольких доменов VP64 к комплексу sgPHK/dCas9, локализованному на промоторе целевого гена. На примере генов рецептора CXCR4 и ингибитора клеточного цикла CDKN1B было показано, что применение платформы SunTag позволяет усиливать активацию гена с помощью одной sgPHK [33].
На основе взаимодействия Cas9 с аптамерами РНК (короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, способные с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулами различной природы [34]), которые селективно связывались с димеризованными белками оболочки бактериофага MS2, были сконструированы активационные комплексы - синергичные медиаторы активации (synergistic activation mediator, SAM), позволяющие использовать различные активационные домены. В частности, включение в состав SAM белков слияния MS2 с р65-субъединицей NF-kB и активационным доменом HSF1 приводило к значительному усилению транскрипции, опосредуемой соответствующей sgPKK [35].
Направляемая sgPKK активация генов с использованием CRISPR/Cas9 представляет собой новый перспективный подход к целевой индукции транскрипции в латентных резервуарах ВИЧ-1. К числу наиболее важных факторов, влияющих на активацию ВИЧ-1, относится расположение целевого сайта, с которым связывается sgPR^ по отношению к сайту начала транскрипции (transcription start site, TSS). Обычно сайт связывания sgPffi^ находится в районе от -200 до +1 нп относительно TSS [35, 36]. Дальнейшие усилия направлены на разработку сочетаний sgPR^ взаимодействующих с последовательностями промотора 5'-LTR, и достижение синергичной высокоэффективной активации. Несмотря на то, что новая технология представляется многообещающей, необходимы дальней-
шие исследования, связанные с различной локализацией латентных резервуаров провируса. В частности, важный латентный резервуар находится в центральной нервной системе. Он компартментализован, труднодоступен для антиретровирусных препаратов и иммунного надзора.
3. Система CRISPR/Cas9 и редактирование локуса гена CCR5
Для входа в клетку-мишень ВИЧ-1 требуется рецептор CD4 и корецепторы CCR5 или CXCR4 [37]. Воздействие на гены CD4 и CXCR4 нежелательно, так как эти рецепторы жизненно важны для нормального функционирования иммунной системы [38]. CCR5 является мишенью действия антиретровирусного препарата маравирок. Индивидуумы, несущие мутацию CCR5A32 в гомозиготе, обладают естественной устойчивостью к инфекции R5-тропными штаммами ВИЧ-1 [39, 40]. Пересадка костного мозга от донора, гомозиготного по аллелю CCR5A32, позволила впервые вылечить ВИЧ-инфицированного пациента (единственный подтвержденный случай излечения от ВИЧ-инфекции) [41-43]. До сих пор, однако, не подтверждено, что при этом произошло удаление ВИЧ-1 из латентных резервуаров. Существует вероятность, что пересадка костного мозга дала эффект функционального лечения, в результате которого ВИЧ-1, появляющийся из латентный резервуаров, адекватно контролируется функциональной, хотя и генетически модифицированной, иммунной системой. Однако аллогенная трансплантация костного мозга вряд ли имеет перспективы широкого применения для лечения ВИЧ-инфекции, так как число потенциальных доноров, несущих мутацию CCR5A32 в гомозиготном состоянии, невелико (3-5% европеоидной популяции) [44, 45]. Кроме того, подбор HLA-совместимого донора и сложный процесс инактивации собственного костного мозга также обусловливают невозможность широкомасштабного применения этого подхода. Интенсивные исследования направлены на генерацию гомозиготных мутаций гена CCR5 с использованием набора программируемых нуклеаз и модификации CD34+-стволовых клеток-предшественников или CD4+-Т-клеток пациента ex vivo.
В моделях ВИЧ-инфекции на животных CCR5-специфические ZFN удавалось успешно доставлять в первичные CD34+-гемопоэтические стволовые клетки-предшественники [46, 47] или CD4+-Т-клетки [48], которые затем пересаживались мышам. В большинстве случаев ACCR5-клетки имели продолжительное время персистирования и селективно выживали в присутствии вируса. В клинических исследованиях аденовирусный вектор, экспрессирующий CCR5-специфическую ZFN, использовался для трансфекции CD4+-Т-клеток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов [49]. После размножения ex vivo трансфецированные клетки были реинфузированы аутологично. Генномодифици-рованные клетки детектировались у всех пациентов-участников исследования до 42 мес. У пациентов, которые прерывали АРТ, обнаруживалось селективное выживание генномодифицированных клеток. Снижение
вирусной нагрузки коррелировало со степенью биал-лельного удаления CCR5.
Технология CRISPR/Cas9 представляет собой серьезную альтернативу подходам, основанным на применении ZFN или TALEN для разрушения гена CCR5, так как она легче в использовании, требует одного варианта sgPHK для локализации сайта расщепления и обеспечивает более высокий уровень специфичности к мишени. Показано, что значимые разрушения в последовательности гена CCR5 могут быть индуцированы, когда клетки были котрансфецированы плазми-дами, кодирующими Cas9 и определенную sgPHK [50]. При использовании сочетания TALEN или CRISPR/Cas9 с транспозоном piggyBac удалось воспроизвести природную делецию CCR5A32 в стимулированных поли-потентных стволовых клетках. Модифицированные стволовые клетки дифференцировались в моноциты/ макрофаги, которые устойчивы к инфицированию ВИЧ-1 [51]. Для модификации СБ4+-Т-клеток использовали лентивирусные векторы, экспрессирующие Cas9 и CCR5-специфическую sgPHK. Хотя в культивируемых клеточных линиях разрушение гена CCR5 происходило с высокой частотой, те же системы трансдукции приводили к токсическому эффекту [52]. Возможно, это было связано с взаимодействием CCR5-sgPHK с последовательностями в других генах, например, с геном CCR2, последовательность которого сходна с последовательностью гена CCR5 [53, 54]. Следует принимать во внимание и возможность неблагоприятных эффектов, обусловленных реакцией системы врожденного иммунитета на чужеродную ДНК [55]. Отчасти они компенсируются добавлением мРНК, транскрибированной in vitro [56]. Система CRISPR/Cas9 была применена для воздействия на гены CCR5 и B2M в первичных CD4+-T-клетках и CD34+-гемопоэтических стволовых клетках-предшественниках. При использовании двух sgPHK различной специфичности удалось достичь эффективного биаллельного разрушения гена CCR5 в клетках обоих типов. Как и модифицированные полипотент-ные стволовые клетки, модифицированные гемопоэ-тические клетки-предшественники сохраняли способность к мультилинейной дифференцировке in vitro и in vivo при трансплантации мышам [57].
Кроме корецептора CCR5, важными терапевтическими мишенями могут служить и другие белки человека, необходимые для входа вируса в клетку. Широкогеномный скрининг с использованием системы CRISPR позволил выявить ряд факторов организма-хозяина, связанных с ВИЧ-инфекцией. Белки TPST2 (тирозил-протеин-сульфотрансфераза 2) и SLC35B2 (белок В2 семейства растворимых переносчиков 35) обеспечивают сульфатирование внеклеточных остатков тирозина молекулы корецептора CCR5, что облегчает его распознавание комплексом Env вируса. Молекула адгезии активированных лейкоцитов ALCAM опосредует агрегацию лимфоидных клеток, которая необходима для межклеточной передачи ВИЧ. С помощью комплекса
CRISPR/Cas9 и антител в культуре первичных CD4+-T-клеток человека удалось блокировать активность этих белков, что позволяет рассматривать их как возможные мишени молекулярно-генетического терапевтического воздействия [58].
4. Модуляция антисмысловых длинных некодирующих РНК ВИЧ-1 с помощью CRISPR/Cas9
Важная роль в регуляции активности провирусной ДНК ВИЧ-1 принадлежит длинной антисмысловой не-кодирующей РНК (lncPHK), транскрибируемой с гена nef, расположенного на З'-конце вирусного генома [5962]. Сверхэкспрессия nef вызывает супрессию транскрипции генов вируса, а подавление синтеза nef приводит к активации экспрессии генов ВИЧ-1 [62].
Промоторный участок антисмысловой lncPHK nef расположен внутри участка гена nef, который подвергается делеции в штаммах вируса, выделенных в когорте элитных контроллеров [60, 63]. Этот же участок чувствителен к подавлению транскрипции, опосредованному миРНК. Подавление образования антисмыслового транскрипта с помощью миРНК приводило к активации экспрессии генов вируса [62]. Высказано предположение, что lncPHK nef способствует переходу вируса в латентное состояние. В таком случае промоторный участок гена nef является перспективной мишенью для CRISPR/Cas9-опосредованного подавления активности или разрушения [62]. Редактирование промоторных элементов nef с помощью системы CRISPR/Cas9 может привести к воспроизведению делеций, обнаруженных в штаммах ВИЧ-1, выделенных от элитных контроллеров. Мутации в промоторном участке гена nef способны нарушить активацию вируса в результате продукции укороченных транскриптов и неполноценных укороченных вирусных белков. Такой подход требует дальнейшего исследования. В частности, необходимо идентифицировать консервативные lncPHK вируса и хозяина, которые служили бы терапевтической мишенью для воздействия CRISPR/Cas9.
Разработка системы CRISPR/Cas9 существенно продвинула возможности изменения генома и контроля экспрессии генов. Также CRISPR/Cas9 представляет перспективную технологию для разработки новых терапевтических подходов.
Развитие ВИЧ-инфекции может быть блокировано путем направленного воздействия на интегрированную провирусную ДНК [13, 29], а также в результате подавления экспрессии факторов хозяина, например, корецептора CCR5 [50, 51, 53, 64]. Направленное разрезание в LTR-участках может привести к удалению ДНК провируса из генома хозяина [11-13]. Применение множественных sgPHK предложено для разрушения генов ВИЧ, что способно предотвратить синтез вирусных белков, формирование и высвобождение новых вирионов [13]. Воздействие на регуляторные последовательности с помощью активаторов на основе системы CRISPR/Cas9
позволяет стимулировать репликацию ВИЧ в латентных резервуарах. В результате ВИЧ становится доступным для воздействия АРТ.
Применение технологии СЫ8РК/Са89 для блокирования интеграции и прогрессирующей инфекции, а также для инактивации или удаления провируса находится в стадии проверки концепции. Есть весомые основания предполагать, что с помощью этой технологии можно будет эффективно удалять вирус, скрытый в латентных резервуарах. Применение активаторов, основанных на СЯ18РИ/Са89, представляет собой перспективный подход для специфической целевой реактивации латентно инфицированных вирусных резервуаров с последующей элиминацией реплицирующего вируса с помощью АРТ. Кроме того, с помощью СЯ18РИ/Са89-редактирования появилась возможность генерировать делеции гена CCR5, воспроизводящие природную гомозиготную мутацию ССЯ5Д32, и таким образом индуцировать перманентную защиту клеток от ВИЧ-инфекции. Хотя еще существует много препятствий, в том числе вопросы безопасности и технические аспекты, связанные с доставкой векторов экспрессии, технология СЯ18РИ/Са89 представляется перспективным подходом к реальному удалению ВИЧ-1 из инфицированного организма.
5. Ограничения потенциального терапевтического применения системы CRISPR/Cas9
Несмотря на многообещающую перспективу использования системы СЫ8РК/Са59 для инактивации или даже удаления ДНК провируса из ВИЧ-инфицированных клеток, остается важный вопрос: способен ли ВИЧ-1 уходить от действия СЫ8РК/Са59, и если да, то каким образом? Этот вопрос является фундаментальным для стратегий, направленных на лечение и превенцию ВИЧ-инфекции с использованием генотерапии [19].
Важные данные были получены при исследовании эволюции ВИЧ-1 в СБ4+-Т-клетках, которые стабильно экспрессировали СаБ9 и sgРНК, связывающиеся с различными участками генома ВИЧ-1 [65, 66]. В краткосрочных экспериментах наблюдалось выраженное ингибирование репликации вируса, но через продолжительное время обнаруживалась продуктивная инфекция. Быстрый уход от ингибирующего действия наблюдался, когда комплекс sgРНК и СаБ9 был специфичен к менее консервативным последовательностям ДНК ВИЧ-1, а если воздействие было направлено против более консервативных последовательностей, время образования escape-мутантов увеличивалось [65]. На основании представлений о механизме ухода ВИЧ-1 от воздействия специфической РНК-интерференции можно было ожидать изменения последовательности ДНК ВИЧ-1, которая является мишенью sgРНК, или последовательности РАМ [67-69]. Выявлены мутации, которые нарушали процесс узнавания sgРНК соответ-
ствующих мишеней. Затем были получены неожиданные результаты. Большинство устойчивых мутаций были кластеризованы в участке, против которого была направлена расщепляющая активность Cas9, хотя сайт связывания sgРНК имел размеры значительно больше. Другой особенностью стала частая встречаемость вставок и делеций, по крайней мере, в менее консервативных участках последовательностей-мишеней. Предполагается, что эти мутации появляются не из-за ошибок обратной транскрипции, а представляют собой результат негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ) - клеточного механизма, который используется для репарации разрывов ДНК. Глубокое секвенирование показало, что ряд мутаций в escape-вариантах вируса действительно появились в ДНК провируса в СБ4+-Т-клетках в течение 36 ч после ВИЧ-инфекции [66]. После индуцированного sgРНК расщепления ДНК провируса под действием Cas9 механизм NHEJ приводит к образованию мутаций в сайте расщепления. Некоторые мутации блокируют функциональную активность вирусной ДНК и не закрепляются отбором, но другие могут обеспечивать устойчивость вируса к действию комплекса sgРНК/Cas9 за счет изменения последовательности-мишени ДНК. Если мишенями служат консервативные последовательности, мутации в результате вставок/делеций/замен часто оказываются несовместимыми с возможностью репликации ВИЧ-1. Устойчивые замены нуклеотидов в таких последовательностях появляются через продолжительное время.
Знание механизма приобретения устойчивости к действию sgРНК/Cas9 способно ускорить разработку стратегий, которые позволят преодолеть этот уникальный вирусный механизм. Одним из вариантов решения может быть программирование Cas9 с помощью множественных sgРНК, мишенями которых служат консервативные участки генома ВИЧ-1. Подобные комбинированные стратегии оказались успешными при АРТ и при миРНК-опосредованной генотерапии, которые обеспечивали устойчивое подавление репликации вируса [69]. Обнаружено, что воздействие на множественные мишени ДНК ВИЧ-1 с применением набора sgРНК приводит к существенно более сильному подавлению вирусной инфекции [13]. Другим подходом могло бы стать конструирование вариантов Cas9, которые были бы способны расщеплять ДНК вне последовательностей-мишеней. В этом случае NHEJ-индуцируемые мутации не предотвращали бы связывания Cas9/sgРНК и последующего расщепления провирусной ДНК, т. е. не приводили бы к развитию устойчивости. Такой подход представляется осуществимым в свете достижений в создании вариантов Cas9, которые способны распознавать различные РАМ [70]. Кроме модификации Cas9, появление новых CRISPR и CRISPR-подобных ферментов также может способствовать преодолению устойчивости вируса. Например, белок Cpf1 действует подобно Cas9, но в отличие от Cas9, расщепляющей ДНК в участках, прилежащих к РАМ, которые критичны для
распознавания sgPНК, Cpf1 расщепляет ДНК в участках, более удаленных от целевой последовательности и менее критичных для связывания sgPНК [71, 72]. Еще одним способом противодействия развитию устойчивости является подавление NHEJ-активности с помощью препаратов, которые воздействуют на ферменты репарации ДНК [73]. Совершенствование путей преодоления устойчивости ВИЧ-1 к CRISPR/Cas9 может также способствовать применению этой системы для подавления других вирусных инфекций.
Описанные выше проблемы не являются препятствиями альтернативному применению системы CRISPR/Cas9 для противодействия ВИЧ-инфекции, например, для инактивации гена CCR5, что делает клетки-мишени устойчивыми к ВИЧ-инфекции [51, 74]. Мутантные формы Cas9, которые не обладают нуклеазной активностью (dCas9), способны активировать латентный резервуар ВИЧ-1 за счет домена активатора транскрипции [75-77]. При взамодействии sgPНК с промотором LTR ВИЧ-1 варианты dCas9 могли бы стимулировать экспрессию генов вируса и вывести его из латентного состояния.
Существуют и другие ограничения применения системы CRISPR/Cas9. Несмотря на то, что применение CRISPR/Cas9 приводило к эффективному удалению про-вирусной ДНК ВИЧ-1 из остро или латентно инфицированных клеток in vitro [11-13, 15], не исследована способность CRISPR/Cas9 удалять геном ВИЧ-1 из покоящихся CD4+-Т-клеток, выделенных от ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Обнаружено, что подавление репликации ВИЧ-1, опосредованное sgPНК, менее выражено по сравнению с существующими терапевтическими стратегиями с применением малых молекулярных ингибиторов. Возможно, что CRISPR/Cas9 может применяться в соче-
■ Литература/References
1. Karpinski J.H.I., Chemnitz J., Schafer C., Paszkowski-Rogacz M. et al. Directed evolution of a recombinase that excises the provirus of most HIV-1 primary isolates with high specificity. Nat. Biotechnol. 2016; 34: 401-9.
2. Schiffer J.T., Aubert M., Weber N.D., Mintzer E. et al. Targeted DNA mutagenesis for the cure of chronic viral infections. J. Virol. 2012; 86: 8920-36.
3. Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 2013; 31 (7): 397-405.
4. Cai M., Yang Y. Targeted genome editing tools for disease modeling and gene therapy. Curr. Gene Ther. 2014; 14 (1): 2-9.
5. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013; 339: 819-23.
6. Mali P., Yang L., Esvelt K.M., Aach J. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013; 339: 823-6.
7. Price A.A., Grakoui A., Weiss D.S. Harnessing the prokaryotic adaptive immune system as a eukaryotic antiviral defense. Trends Microbiol. 2016; 24: 294-306.
8. Sternberg S.H., Redding S., Jinek M., Greene E.C. et al. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 2014; 507 (7490): 62-7.
9. Anders C., Niewoehner O., Duerst A., Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014; 513 (7519): 569-73.
тании с ВААРТ для удаления латентно инфицированных клеток, на которые ВААРТ сама по себе не действует. В отличие от антиретровирусных препаратов, технология CRISPR/Cas9 имеет потенциал длительной защиты против ВИЧ-1. Доставка CRISPR/Cas9-кодирующих генов in vivo может оказаться проблемой, хотя векторная система на основе лентивирусов эффективна в трансдук-ции в случае и CD4+-Т-клеток, и CD34+-гемопоэтических стволовых клеток. Однако интегрирующийся в клетку лентивирусный вектор несет риск инсерционного онко-генеза. Возможный вариант решения этой проблемы -использование вирусоподобных частиц, содержащих Vpr-Cas9/sgPHK, для доставки этих комплексов в клетки-мишени [78]. Не ясно, могут ли быть преодолены ограничения использования системы CRISPR/Cas9 в результате перехода на системы с использованием TALEN или ZFN. Хотя обе эти системы более простые, так как не имеют РНК, их сложнее программировать в отношении точной специфичности к последовательностям-мишеням [3]. Важно отметить, что ZFN-опосредованное расщепление ДНК ВИЧ-1 также может привести к образованию устойчивых мутантных вариантов [78]. Однако информация, которая приобретена при исследовании редактирования вирусных или клеточных генов с помощью ZFN или TALEN, может облегчить применение CRISPR/Cas9 в сходных условиях. Понимание ограничений системы CRISPR/Cas9 будет только способствовать ее усовершенствованию и оптимизации, а в будущем - широкому использованию ее потенциала [19]. Быстрый прогресс в области применения CRISPR/Cas9 и обнаружение новых генетических инструментов дает уверенность в том, что эта система редактирования генома станет основой для разработки путей эффективного контроля вирусных инфекций.
10. Doudna J.A., Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014; 346 (6213): 1258096.
11. Ebina H., Misawa N., Kanemura Y., Koyanagi Y. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus. Sc. Rep. 2013; 3: 2510-6.
12. Hu W., Kaminski R., Yang F., Zhang Y. et al. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 11 461-6.
13. Liao H.K., Gu Y., Diaz A., Marlett J. et al. Use of the CRISPR/ Cas9 system as an intracellular defense against HIV-1 infection in human cells. Nat. Commun. 2015; 6: 6413.
14. Zhu W., Lei R., Le Duff Y., Li J. et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 2015; 12: 22.
15. Kaminski R., Chen Y., Fischer T., Tedaldi E. et al. Elimination of HIV-1 genomes from human T-lymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing. Sci. Rep. 2016; 6: 22555.
16. Yin C., Zhang T., Li F., Yang F. et al. Functional screening of guide RNAs targeting the regulatory and structural HIV-1 viral genome for a cure of AIDS. AIDS. 2016; 30: 1163-74.
17. Saayman S., Ali S.A. Morris K.V., Weinberg M.S. The therapeutic application of CRISPR/Cas9 technologies for HIV. Expert Opin. Biol. Ther. 2015; 15 (6): 819-30.
18. Bhoj V.G., Thibodeaux S.R., Levine B.L. Novel gene and cellular therapy approaches for treating HIV. Discov. Med. 2016; 21 (116): 283-92.
19. Liang C., Wainberg M.A., Das A.T., Berkhout B. CRISPR/ Cas9: a double-edged sword when used to combat HIV infection. Retrovirology. 2016; 13: 37.
20. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 2005; 60 (2): 174-82.
21. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Almendros C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 2009; 155 (pt 3): 733-40.
22. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012; 337 (6096): 816-21.
23. Jinek M., East A., Cheng A., Lin S. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2013; 2: e00471.
24. Gilbert L.A., Larson M.H., Morsut L., Liu Z. et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154 (2): 442-51.
25. Qi L.S., Larson M.H., Gilbert L.A., Doudna J.A. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 2013; 152 (5): 1173-83.
26. Cheng A.W., Wang H., Yang H., Shi L. et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 2013; 23 (10): 1163-71.
27. Maeder M.L., Linder S.J., Cascio V.M., Fu Y. et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat. Methods. 2013; 10 (10): 977-9.
28. Perez-Pinera P., Kocak D.D., Vockley C.M., Adler A.F. et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat. Methods. 2013; 10 (10): 973-6.
29. Hu J., Lei Y., Wong W.K., Liu S. et al. Direct activation of human and mouse Oct4 genes using engineered TALE and Cas9 transcription factors. Nucleic Acids Res. 2014; 42 (7): 4375-90.
30. Qu X., Wang P., Ding D., Li L. et al. Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DNA from infected and latently infected human T cells. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (16): 7771-82.
31. Sontheimer E.J., Barrangou R. The bacterial origins of the CRISPR genome-editing revolution. Hum Gene Ther. 2015; 26 (7): 413-24.
32. Mali P., Aach J., Stranges P.B., Esvelt K.M. et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31 (9): 833-8.
33. Tanenbaum M.E., Gilbert L.A., Qi L.S., Weissman J.S. et al. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014; 159 (3): 635-46.
34. Кушниров В.В., Митькевич О.В., Ураков В.Н., Тер-Аванесян М.Д. Аптамеры и их использование в биологии и медицине. Успехи соврем. естествознания. 2013; 3: 40-3. [Kushnirov V.V., Mitkevich O.V., Urakov V.N., Ter-Avanesyan M.D. Aptamers and their use in biology and medicine. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. 2013; (3): 40-3. (in Russian)]
35. Konermann S., Brigham M.D., Trevino A.E., Joung J. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 2015; 517 (7536): 583-8.
36. Gilbert L.A., Horlbeck M.A., Adamson B., Villalta J.E. et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 2014; 159 (3): 647-61.
37. Cocchi F., DeVico A.L., Garzino-Demo A., Arya S.K. et al. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. Science. 1995; 270 (5243): 1811-5.
38. Nagasawa T., Hirota S., Tachibana K., Takakura N. et al. Defects of B-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1. Nature. 1996; 382 (6592): 635-8.
39. Samson M., Libert F., Doranz B.J., Rucker J. et al. Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature. 1996; 382 (6593): 722-5.
40. Biti R., Ffrench R., Young J., Bennetts B. et al. HIV-1 infection in an individual homozygous for the CCR5 deletion allele. Nat. Med. 1997; 3 (3): 252-3.
41. Hutter G., Nowak D., Mossner M., Ganepola S. et al. Long-term control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 stem-cell transplantation. N Engl J Med. 2009; 360 (7): 692-8.
42. Allers K., Hutter G., Hofmann J., Loddenkemper C. et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 2011; 117 (10): 2791-9.
43. Hutter G., Thiel E. Allogeneic transplantation of CCR5-deficient progenitor cells in a patient with HIV infection: an update after 3 years and the search for patient No. 2. AIDS. 2011; 25 (2): 273-4.
44. Michael N.L., Chang G., Louie L.G., Mascola J.R. et al. The role of viral phenotype and CCR-5 gene defects in HIV-1 transmission and disease progression. Nat. Med. 1997; 3 (3): 338-40.
45. Zimmerman RA., Buckler-White A., Alkhatib G., Spalding T. et al. Inherited resistance to HIV-1 conferred by an inactivating mutation in CC chemokine receptor 5: studies in populations with contrasting clinical phenotypes, defined racial background, and quantified risk. Mol. Med. 1997; 3 (1): 23-36.
46. Holt N., Wang J., Kim K., Friedman G. et al. Human hematopoietic stem/progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo. Nat. Biotechnol. 2010; 28 (8): 839-47.
47. Schleifman E.B., Bindra R., Leif J., del Campo J. et al. Targeted disruption of the CCR5 gene in human hematopoietic stem cells stimulated by peptide nucleic acids. Chem. Biol. 2011; 18 (9): 1189-98.
48. Perez E.E., Wang J., Miller J.C., Jouvenot Y. et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 2008; 26 (7): 808-16.
49. Tebas P., Stein D., Tang W.W., Frank I. et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N. Engl. J. Med. 2014; 370 (10): 901-10.
50. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013; 31 (3): 230-2.
51. Ye L., Wang J., Beyer A.I., Teque F. et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111 (26): 9591-6.
52. Wang W., Ye C., Liu J., Zhang D. et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PloS One. 2014; 9 (12): e115987.
53. Cradick T.J., Fine E.J., Antico C.J., Bao G. CRISPR/Cas9 systems targeting beta-globin and CCR5 genes have substantial offtarget activity. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (20): 9584-92.
54. Cho S.W., Kim S., Kim Y., Kweon J. et al. Analysis of offtarget effects of CRISPR/ Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 2014; 24 (1): 132-41.
55. Monroe K.M., Yang Z., Johnson J.R., Geng X. et al. IFI16 DNA sensor is required for death of lymphoid CD4 T cells abortively infected with HIV. Science. 2014; 343 (6169): 428-32.
56. Truong L., Wood T., Henley J., Ya-Li L. et al. Autologous hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC) therapy for monogenic blood disorders: scalable, cGMP-compliant process for generating highly efficient genome edited HSPC. Blood. 2013; 122 (21): 4213-3.
57. Mandal P.K., Ferreira L.M, Collins R., Meissner T.B. et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 2014; 15 (5): 643-52.
58. Park R.J., Wang T., Koundakjian D., Hultquist J.F. et al. A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors. Nat Genet. 2017; 49: 193-203. doi: 10.1038/ ng.3741.
59. Ludwig L.B., Ambrus J.L. Jr, Krawczyk K.A., Sharma S. et al. Human Immunodeficiency virus-type 1 LTR DNA contains an intrinsic gene producing antisense RNA and protein products. Retrovirology. 2006; 3: 80.
60. Landry S., Halin M., Lefort S., Audet B. et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 2007; 4: 71.
61. Kobayashi-Ishihara M., Yamagishi M., Hara T., Matsuda Y. et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 2012; 9 (1): 38.
62. Saayman S., Ackley A., Turner A.M., Famiglietti M. et al. An HIV-encoded antisense long noncoding RNA epigenetically regulates viral transcription. Mol. Ther. 2014; 22 (6): 1164-75.
63. Kirchhoff F., Greenough T.C., Brettler D.B., Sullivan J.L. et al. Brief report: absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection. N Engl J Med. 1995; 332 (4): 228-32.
64. Hariharan M., Scaria V., Pillai B., Brahmachari S. Targets for human encoded microRNAs in HIV genes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 337: 1214-8.
65. Wang G., Zhao N., Berkhout B., Das A.T. CRISPR-Cas9 can inhibit HIV-1 replication but NHEJ repair facilitates virus escape. Mol. Ther. 2016; 24: 522.
66. Wang Z., Pan Q., Gendron P., Zhu W. et al. CRISPR/Cas9-derived mutations both inhibit HIV-1 replication and accelerate viral escape. Cell Rep. 2016; 15: 1-9.
67. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Ramratnam B. Human immunodeficiency virus type 1 escape from RNA interference. J. Virol. 2003; 77: 11 531-5.
68. Das A.T., Brummelkamp T.R., Westerhout E.M., Vink M. et al. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. J. Virol. 2004; 78: 2601-5.
69. ter Brake O., Konstantinova P., Ceylan M., Berkhout B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol. Ther. 2006; 14: 883-92.
70. Kleinstiver B.P., Prew M.S., Tsai S.Q., Nguyen N.T. et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nat. Biotechnol. 2016; 33: 1293-8.
71. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 2015; 163: 759-71.
72. Yamano T., Nishimasu H., Zetsche B., Hirano H. et al. Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2016; 165: 949-62.
73. Vartak S.V., Raghavan S.C. Inhibition of nonhomologous end joining to increase the specificity of CRISPR/Cas9 genome editing. FEBS J. 2016; 282: 4289-94.
74. Hou P., Chen S., Wang S., Yu X. et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection. Sci. Rep. 2015; 5: 15577.
75. Zhang Y., Yin C., Zhang T., Li F. et al. CRISPR/gRNA-directed synergistic activation mediator (SAM) induces specific, persistent and robust reactivation ofthe HIV-1 latent reservoirs. Sci. Rep. 2015; 5: 16277.
76. Saayman S.M., Lazar D.C., Scott T.A., Hart J.R. et al. Potent and targeted activation of latent HIV-1 using the CRISPR/dCas9 activator complex. Mol. Ther. 2016; 24: 488-98.
77. Limsirichai P., Gaj T., Schaffer D.V. CRISPR-mediated activation of latent HIV-1 expression. Mol. Ther. 2016; 24: 499-507.
78. Choi J.G., Dang Y., Abraham S., Ma H. et al. Lentivirus prepacked with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 2016; 23 (7): 627-33.
79. De Silva Feelixge H.S., Stone D., Pietz H.L., Roychoudhury P. et al. Detection of treatment-resistant infectious HIV after genome-directed antiviral endonuclease therapy. Antiviral. Res. 2016; 126: 90-8.
