Микромицеты –целлюлозолитики нефтезагрязненных почв Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 631.427:665.6

МИКРОМИЦЕТЫ -ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ

Киреева НА., Мифтахова А.М.*

Показано, что при загрязнении почв нефтью целлюлозная активность связана в основном с деятельностью микромицетов. Это является одним из факторов усиления токсичности нефтезагрязненных почв в отношении высших растений.

Существенная роль в микробных ассоциациях принадлежит целлюлозоразрушающим грибам, бактериям и актиномицетам. Подобные ассоциации часто встречаются в природе благодаря значительным запасам клетчатки, имеющийся в растительных остатках. Биологическое значение этих организмов в таких ассоциациях состоит в обеспечении других групп микроорганизмов подвижными углеродсодержащими веществами [1].

Соотношение различных целлюлозоразрушающих организмов (бактерий, актиномицетов и грибов) зависит от многих факторов: типа почвы, характера растительности, климатических условий и многих других. Деградация целлюлозы в почве, совершаемая грибами, занимает одно из важных звеньев в процессе круговорота веществ в природе и создании почвенного плодородия.

Целлюлозные свойства установлены у многих сотен видов и тысяч природных изолятов грибов различного происхождения и систематической принадлежности, как при культивировании на целлюлозных субстратах, так и при развитии их в природе [2].

Целлюлозоразрушающие микромицеты

почв как один из элементов биоценоза, по мнению В.И. Билай [3], могут выполнять двоякую роль:1)участвовать в трансформации целлюлозосодержащих субстратов в углеродном звене круговорота веществ; 2)создавать ассоциативные связи с другими организмами почвы путем накопления во внешней среде легко усвояемых углеводов (глюкозы, реже целлобиозы), продуктов ферментативного расщепления целлюлозы и компонентов мице-лиальной массы, образуемой в результате трансформации целлюлозы. При изучении целлюлазной активности нефтезагрязненных почв нами показано [4], что в комплексе аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов наряду со снижением их общей численности, происходят определенные изменения. Если в контрольных вариантах основными целлюлозоразрушающими микроорганизмами являются бактерии и актиномицеты, а грибы занимают по численности последнее место, то при за-

грязнении почв нефтью преобладающими становятся микромицеты, особенно с увеличением дозы загрязнителя [4].

Известно [7], что целлюлозолитическая активность микромицетов играет определенную роль в патогенезе вызываемых ими заболеваний у растений. Поэтому нами рассмотрена целлюлозолитическая активность у основных представителей комплекса микромицетов почв, загрязненных нефтью, и ее зависимость от присутствия загрязнителя.

Первичный скрининг целлюлозоразрушающих грибов проводили на видоизмененной среде Чапека с фильтровальной бумагой [2]. В ряде случаев была использована среда для выделения почвенных целлюлозоразрушающих грибов с КМЦ [5]. Грибы хорошо растут на агаре с фильтровальной бумагой, КМЦ. Рост, главным образом, поверхностный, сопровождается образованием зон просветления целлюлозного агара вокруг колоний и окрашиванием их в розовый цвет. Зоны целлюлолизиса вокруг колонии на среде с частично гидролизованной целлюлозой появляются, как правило, через 1,5-2 недели роста гриба. Оценка роста грибов на целлюлозосодержащем субстрате производилась по пятибальной системе, предложенной В.И. Билай с соавторами. [2].

Один-два плюса - слабый рост мицелия гриба на субстрате, спорообразование слабое, отсутствуют разрушенные участки субстрата; три-четыре плюса -наличие обильного и хорошо развитого мицелия, обволакивающего целлюлозный субстрат. Визуально отмечалась деградация субстрата. Путем последовательных пересевов со среды Чапека на сусло- агар и среду с КМЦ получали чистые культуры грибов и определяли их до вида, используя определители [6]. В таблицах 1-3 приведены данные по оценке целлюлозолизиса грибами, выделенными из почв, загрязненных высокими дозами нефти или нефтепродуктов, и являющимися доминирующими или типичными в этих почвах.

Целлюлюзолитическая активность 180 штаммов разных видов микромицетов, выделенных из занефтенных почв в большинстве случаев наблюда-

$ Киреева Наиля Ахняфовна - доктор биологических на/к, профессор каф. биохимии и биотехнологии Мифтах ова Айсыл/ Мансафовна - кандидат биологически х на/к, доцент кафедры экологии

лась на 15-ый день роста. По визуально онределяе-мой активности роста к числу наиболее активно ис-нользующих клетчатку можно отнести Chaetomium sp., Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporium, Fusarium sp., Trichoderma sp., Trichoderma viride, штаммы которых обильно росли, мицелий обволакивал субстрат, вызывая дезагрегацию и его лизис.

K числу видов активно разрушающих клетчатку или иснользующих его в качестве единственного источника углерода можно также отнести Aclavatus, A.flavus. A.fumigatus, A.niger, A.oryzae, Aterreus, A.ustus, Aversicolor, P.brevi-compactum, P.cyclopium, P.funiculosum, P.lanosum, Penicillium sp., Cladosporium cladosporioides, Gliocladum sp., Mucor sp., Rhizopus nigricans, Rhizopus sp.. Слабо растут на клетчатке или не снособны иснользо-вать ее штаммы видов P.biforme, P.casei, P.janthinellum, P.martensii, P.piceum, P.restrictum, P.rogueforti, P.tardum, P.vermiculatum,

Acaespitosus, Arestrictus, Asydowi, Awenti, Acremonium sp., Actinomucor sp., Mortierella sp., Paecilomyces sp., Scopulariopsis commimis. Среди внутривидовых изолятов (штаммов) многих видов микромицетов нередко как разрушающие целлюлозный субстрат в разной стенени, так и не растущие на среде его содержащей. K таковым можно отнести, нанример, отдельные штаммы P.canescens, P.variable, Penicillium sp., A.repens, Mucor sp. и др.

В ходе онределения целлюлозной активности ночв методом целлофановых мембран и но убыли льняного нолотна [4] нроисходит обрастание этих целлюлозных субстратов мицелием микромицетов. При этом имеется возможность для выявления разнообразия грибов на нервой стадии колонизации нолимерного субстрата [6] в ночвах, загрязненных нефтью и нефтенродуктами. После онределения целлюлозной активности субстраты нросматрива-ли с бинокулярной луной. Для выделения микромицетов, колонизирующих целлофановую мембрану и льняное нолотно, их раскладывали на нодкислен-ную агаризованную среду Чанека без сахарозы, сверху номешали кружок стерильной фильтроваль-

ной бумаги в качестве источника углерода. Чашки инкубировали нри 250С. Вырастающие культуры микромицетов нересеевали на агаризованную среду Чанека с сахарозой [б]. Идентификацию культур нроводили но онределителям. В таблицах 2, 3 нриведены микромицеты, выявленные на целлофане и нолотне в нроцессе нервичной колонизации субстратов в ходе онределения целлюлазной активности. Микромицеты, выявленные в данном эксне-рименте, относятся к 17 видам, а основном это нредставители родов Aspergillus и PenicUlium. Набор видов микромицетов, колонизирующих льняное нолотно расширен, чем на целлофановой мембране, но в ходе сукцессии с увеличением дозы загрязнителя нроисходит сужение. Так, нанример, на 3O сутки экснеримента на нолотне нри уровне загрязнения ночвы 25% онределяются лишь два вида микромицета (табл.4).

Несколько иная картина наблюдается на целлофановой мембране (табл.5), где наблюдается изменение разнообразия видового состава грибов. Число видов микромицетов, колонизирующих целлофановую мембрану возрастает нри 1 Of-ной дозе загрязнения ночвы нефтью. С увеличением дозы нефти видовое разнообразие микромицетов-целлюлозолитиков также сокращается. Отдельные виды микромицетов доминируют в ночве, начиная с начального нериода инкубации.

Для льняного нолотна и целлофановой мембраны - это A.niger, который не обнаруживается к концу экснеримента нри дозе нефти 25%связана в основном с деятельностью микромицетов. Показано, что грибы, растущие на целлюлозных субстратах, являются доминирующими или тиничными видами комнлекса микромицетов ночв, загрязненных нефтью и нефтенродуктами. При нефтяном загрязнении создаются селективные условия для усиления цел-люлозолитической активности у микромицетов. Что является одним из факторов усиления фитонатоген-ности микросконических грибов в отношении высших растений.

Таблица 1

Целлюлозолитическая активность разных видов грибов Aspergillus, выделенных из почв, загрязненных высокими дозами нефти (А) и нефтепродуктов (Б)

Виды Koличeствo Субстрат

Серая лесная A Серая лесная Б Темно-серая лесная А Выщелоченный чернозем А

Acaespitosus 1 +

A-clavatus З ++++

A.flavus З ++++

A.mmigatus 5 ++++

A.niger 12 ++++ ++++ +++ +++

A.aidulans З ++ ++

A.oryzae 4 ++++ +++

A. repens 2 1 +++ ++

A.restrictus 2 +

A.sydowi З + +

A.terreus 7 ++++ ++++ ++++

A.ustus 1 ++++

A. versicolor 2 + +++

A.wentii 1 +

Таблица 2

Целлюлозолитическая активность разных видов рода РешсШшт, выделенных из почв, загрязненных высокими дозами нефти (А) и нефтепродуктов (Б)

|Виды Koличeствo штаммов Субстрат

Серая Серая Темно-серая лес- Выщелочен-

лесная А лесная Б ная А ный чернозем

А

P. biforme 2 +

P.brevi- З ++++ ++++

compactum 2

P.canescens З ++ +++

2 -

2 —

P.casei 2 +

P.cyclopium 2 ++++

2 +н

P.funiculosum 4 ++++ ++++ ++++

1 +

P.janthinellum 2 +

P.lanosum 6 ++++ ++++

P.martensii 1 1 +

P.piceum 1 +

P.restrictum 1 +

P.rogueforti 1 +

P.tardum 1 +

P.variable 2- 2- +++ +

P.vermiculatum 2 +

Penicillium sp. 7 ++++ +H+

З +++

2 +н

Таблица 3

Целлюлозолитическая активность микромицетов, выделенных из почв, загрязненных высокими дозами нефти (А) и нефтепродуктов (Б)

Виды

Количество

штаммов

Субстрат

Серая лесная А

Серая лесная Б

Темно-серая лес-

ная А

Выщелоченный чернозем А

Acremonium sp.

Actinomucor

sp.

Altemaria elegans

+++-

Chaetomium sp.

ll

2-

2-

++++-

+++-

++++-

++++

Cladosporium

dosporioide

cla-

++++

Cladosrorium sp.

++++

Fusarium moni-liforme

++++

++++-

++++-

Fusarium oxys-porium___________

+-

++++-

++++

Fusarium-

sp_

++++-

Gliocladum sp.

++++

Graphium sp.

+++

Mortierella sp.

Mucor sp.

++++

+++

Paecilomyces sp.

Rhizopus nigricans

++++

++++

Rhizopussp.

+++

++++

++++

Scopulariopsis

communis

Trichoderma sp.

++++

++++

+++++

T.viride

+++++-

++++

8

+

+

Таблица 4

Микромицеты, колонизирующие льняное полотно в серой лесной почве, загрязненной различными дозами нефти

Дозы Время, сут

не и ,- lO 20 30

о Aspergillus flavus Aspergillus niger Aspergillus niger

Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Chaetomium sp.

Fusarium moniliforme Rhizopussp. R-nigricans Penicillium breviompactum Fusarium moniliforme Rhizopus sp Penicillium brevi- compactum SP Trichoderma sp. Fusarium moniliforme Rhizopus nigricans Penicillium sp.

3,5 Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Fusarium moniliforme Penicillium sp Rhizopus sp Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Rhizopussp. Penicillium sp. Aspergillus fiimigatiis Aspergillus niger Chaetomium sp. Trichoderma sp. Rhizopus sp Penicillium sp

10 Aspergillus fumigatus Aspergillus niger A.ustus Fusarium moniliforme Penicillium sp Rhizopussp Aspergillus fumigatus Aspergillus niger A.ustus Penicillium sp Rhizopus sp Aspergillus fumigatus Aspergillus niger A.ustus Penicillium sp

25 Aspergillus niger Austus Fusarium moniliforme Penicillium sp Rhizopus sp Aspergillus niger A.ustus Fusarium moniliforme Penicillium sp Rhizopus sp A.ustus Penicillium sp

Таблица 5

Микромицеты, колонизирующие целлофановую мембрану в темно-серой лесной почве, загрязненной различными дозами нефти

Дозы нефти, % Время, сут

90 200 300

0 Aspergillus fnmigatus A. niger Fusarium moniliforme Trichoderma viride

3,5 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus A. niger A. terreus Fusarium moniliforme Trichoderma viride

A. niger A. terrcus

10 Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus A. niger A. terreus Penicillium cyclopium P. funiculosum P. lanosum Aspergillus niger P. lanosum A. terreus Fusarium moniliforme Penicillium cyclopium P. funiculosum

A. niger A. terreus Penicillium funiculosum P. cyclopium

25 Aspergillus niger Aspergillus terreus Penicillium funiculosum Aspergillus terreus

A. terreus P. lanosum Penicillium

A. fumigatus funiculosum

Penicillium

cyclopium

P. funiculosum

ЛИТЕРАТУРА

1.Билай В.И., Элланская И.А., Кириленко Т.С. и др. Микромицеты почв. Киев: Наукова думка. 1984.264с.

2.Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Трансформация целлюлозы грибами. Киев: Наукова думка. 1982.296с.

3.Билай В.И. Биология целлюлозоразрушающих грибов. //Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: Наука. 1986. С.6-20с.

4.Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова А.М. Влияние нефтяного загрязнения на целлюлазную активность почв. //Почвоведение. 2000. '6. С.748-753.

5.Eggins М. О. W., Pugh G. J. F. Isolation of cellulose decomposing fungi from the soil. //Nature. 1962. №1. P. 94-95.

6.Семенов А.М., Низовцева Д.В., Паников Н.С. Влияние температуры и минеральных элементов на целлюлазную активность и развитие микромицетов в образцах торфа из верхового болота „Микробиология. 1995. №1. С.97-103.

7.Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г., Мифтахова А.М., Водопьянов В.В. Фитотоксичность антропогенно-загрязненных почв. Уфа, Гилем. 2003. 266с.

Поступила в редакцию 01.10.04 г.