CC BY
194
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 616.613-003.7-078
Романова Ю.М.1, Мулабаев Н.С.2, Толордава Э.Р.1, Серегин А.В.2, Серегин И.В.2, Алексеева Н.В.1, Степанова Т.В.1, Левина Г.А.1, Бархатова О.И.1, Гамова Н.А.1, Гончарова С.А.1, Диденко Л.В.1,
Раковская И.В.1
микробные сообщества на мочевых камнях
1ФГБУ «Федеральный Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ;
2ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения, г. Москва
В работе проведен анализ клинического материала, полученного непосредственно в ходе оперативного вмешательства от больных мочекаменной болезнью (МКБ), на наличие, состав и состояние микрофлоры с помощью стандартных микробиологических, молекулярно-генетических (ПЦР) и современных микроскопических методов. Показано, что приблизительно 50% мочевых камней у больных МКБ могут быть инфицированы широким спектром возбудителей, которые можно обнаружить при исследовании мочевого камня, полученного после оперативного вмешательства стандартными микробиологическими и молекулярно-генетическими методами. Процент выявления Mycoplasma hominis культуральным методом ниже, чем методом ПЦР, что, вероятно, связано с трудностями их выделения и культивирования, а также с возможностью выявления фрагментов ДНК клеток микоплазм, разрушенных после антибиотикотера-пии. С помощью методов современной микроскопии показано, что микроорганизмы на поверхности мочевого камня образуют мультивидовые биопленки
Ключевые слова: биопленки; мочевые камни; мочекаменная болезнь; хронические инфекции.
Впервые о роли бактериальных биопленок в формировании инфекций различной локализации заговорили около 20 лет назад [10, 12-14]. По данным Центра по контролю заболеваемости США, до 65% заболеваний человека может быть связано с формированием биопленок. Возбудители в составе биопленок являются причиной хронических рецидивирующих инфекционно-воспалительных заболеваний. Особенно важную роль биопленки играют в формировании очагов хронической инфекции при заболеваниях моче-выделительной системы [4, 9]. Мочекаменная болезнь (уролитиаз, МКБ) - одно из распространенных урологических заболеваний. Инфекционные заболевания мочевыводящих путей (ИМП) являются прямыми или косвенными провокаторами МКБ. При ИМП отмечается высокий уровень рецидивов инфекции, которая принимает характер хронической с частыми обострениями. До проведения планового оперативного вмешательства все пациенты c МКБ проходят стандартные клинико-лабораторные обследования. Согласно результатам бактериологического исследования мочи проводят предоперационную антибактериальную подготовку. При выраженной бактериурии предварительно проводят курс антибактериальной терапии. Любое оперативное вмешательство проводят на фоне санированной мочи или значительного снижения микробного числа в моче. Однако по наблюдениям практикующих урологов даже на фоне санированной мочи нередки послеоперационные инфекционные осложнения. Вероятно, развитие инфекций связано с разрушением целостности мочевых камней, которые инфицированы еще до операции. По нашему предположению, патогенные микроорганизмы, инфицирующие почки, в таких случаях существуют в виде биопленок, и именно биопленки могут служить причиной инфекционных осложнений и хронизации воспалительного процесса при МКБ. Кроме того, при лечении пациентов с заболеваниями мочеполовой системы широко используются катетеры, дренажи, стенты, на поверхности которых могут
формироваться биопленки, что приводит к развитию «катетер-ассоциированной ИМП», или «биопленочной инфекции» [9, 10, 16]. Среди возбудителей инфекций, которые вызывают заболевания органов мочеполовой системы, важное место занимают микроорганизмы, передающиеся половым путем, а именно, микоплазмы и уреаплазмы. Микоплазмы - представители класса Mol-licutes - являются мельчайшими бесстеночными бактериями, способными к свободному существованию [7, 8]. В организме человека выявляются по крайней мере 16 видов микоплазм, 5 из которых обитают в урогениталь-ном тракте (УГТ). Одна из них Mycoplasma genitalium, как это было недавно показано [17, 20, 21], оказывает наиболее выраженное патогенное действие и вызывает хронический и острый негонококковый уретрит, занимая по частоте выявляемости при этой патологии 2-е место после хламидий. Бактерии Mycoplasma hominis также причастны к развитию воспалительных заболеваний УГТ. Mycoplasma hominis с высокой частотой обнаруживают во влагалище при бактериальном вагино-зе. Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum выделяют из клинического материала при уретрите и других воспалительных заболеваниях УГТ. Mycoplasma homi-nis и Ureaplasma urealyticum обнаруживают в тканях предстательной железы и почках у больных с острым простатитом и пиелонефритом [2, 5, 6]. Микоплазмы способны прикрепляться к любым клеткам макроорганизма, в том числе к эритроцитам и лимфоцитам [5]. С током лимфы и крови они мигрируют по органам и тканям, вследствие чего развивается генерализованная инфекция. Генерализация инфекционного процесса -одна из особенностей патогенеза микоплазменных инфекций [6, 11]. Специфическое свойство Ureaplasma urealyticum - наличие уреазной активности, что является важным провоцирующим фактором в камне-образовании. Несмотря на то что участие возбудителей инфекций, передающихся половым путем (ИППП), в хронизации мочевых инфекций и камнеобразовании уже известно, при стандартных микробиологических исследованиях, проводимых при МКБ, возбудители ИППП не выявляются из-за сложности их культивирования на стандартных питательных средах. До сих пор нет данных и о способности микоплазм и уреаплазм к образованию биопленок. Интенсивное развитие современной молекулярно-биологической и электронно-микроскопической методической базы сформировало качественно новый уровень исследований, позволяющий анализировать развитие инфекционного процесса, используя непосредственно клинически доступные биоматериалы от больных.
Целью данной работы явился анализ клинического материала, полученного непосредственно в ходе оперативного вмешательства от больных МКБ на наличие, состав и состояние микрофлоры с помощью стандартных микробиологических, молекулярно-генетических (ПЦР) и современных микроскопических методов.
Материалы и методы
Клинический материал для исследования - свежевыделенная моча, моча, полученная при катетеризации из почечной лоханки, мочевые камни и образцы сыворотки крови - был получен из урологического отделения ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы. Мочевые камни были получены после проведения чрескожной контактной нефролитола-паксии (дробление и извлечение камня из почки под визуальным контролем с помощью нефроскопа).
Бактериальный состав микрофлоры камней определяли микробиологическими и молекулярно-генетическими методами исследования. Раздробленные в стерильных условиях камни помещали в LB-бульон и инкубировали в течение 24 ч при 370С с аэрацией. Выращенные бульонные культуры высевали на твердые селективные среды (среда Эндо, кровяной агар, энтерокок-ковый агар, стафилококковый агар, среда Сабуро) и получали чистые культуры. Выросшие микроорганизмы идентифицировали до вида с помощью биохимического тестирования используя тест систему «API тест 20 Е».
Для выделения микоплазм из клинического материала использовали коммерческую питательную среду Difco PPLO agar (1,3%) с добавлением 20% сыворотки крови лошади, 1% L-аргинина (для аргининзависимых видов) или 0,05% мочевины (для уреаплазм ). Уреаплазмы выращивали в бульоне той же прописи, что и агар. Чашки с посевами инкубировали до 14 дней при 370С, каждые 2 дня контролируя рост бактерий. При наличии специфического роста или подозрении на него пассировали колонии на чашках с аналогичной питательной средой. Принадлежность выделенных колоний к микоплазмам и уреаплазмам подтверждали с помощью ПЦР.
Образцы клинического материала исследовали на наличие в них ДНК Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium и Ureaplasma spp методом ПЦР. Для этого были использованы лицензированные тест-системы, производимые ООО « ИнтерЛабСервис». Выделение ДНК проводили с помощью тест-системы «ДНК-сорбВ», предназначенной специально для работы с клиническим материалом. Для выделения ДНК использовали следующие тест-системы: Ампли Сенс Mycoplasma hominis, Ампли Сенс Mycoplasma geni-talium, Ампли Сенс Ureaplasma spp (тест-система, обнаруживающая одновременно Ureaplasama urealyticum и Ureaplasmaparvum) и универсальную тест-систему «МИК-КОМ», выявляющую ДНК микоплазм. Использовали электрофоретический метод детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Антигены клеток микоплазм в пробах сыворотки крови выявляли в реакции агрегатгемагглютинации (РАГА) по методике, разработанной в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и подробно изложенной в руководстве [7].
Уреазную активность клинических изолятов определяли, используя твердую среду Кристенсена с мочевиной (производство фирмы ООО «Лабораторный мир»).
Тестирование выделенных микроорганизмов на способность
к формированию бактериальных биопленок проводили по общепринятой методике в 96-луночных микротитровальных планшетах [1, 19].
Оптическую плотность выросших за сутки планктонных клеток определяли на фотометре iEMSReaderMF (Labsystems, Швеция) при длине волны 540 нм.
Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Исследования проводили в двулучевом электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Compani, USA) в режиме высокого вакуума. Для проведения исследования методом СЭМ мочевые камни сразу же после извлечения в операционном блоке фиксировали в 10% формалине или методом S.Ito-Karnovsky [18]. Перед проведением СЭМ зафиксированный материал напыляли слоем золота или углерода толщиной 5 нм с помощью напылительной установки (sPI Inc. UsA). Такой способ подготовки препарата позволяет свести к минимуму изменения структуры изучаемого объекта.
Трансмисcионная электронная микроскопия (ТЭМ). Для анализа ультраструктурной организации бактериального налета на поверхности камней был произведен соскоб с их поверхности. Материал был фиксирован по методу S.Ito-Karnovsky [18] и обработан по общепринятой методике приготовления препаратов для ультраструктурного анализа. Ультратонкие срезы получали с помощью ультратома LKB-3 (Швеция), окрашивали по методу A.Reynolds [3] и анализировали в электронном микроскопе JEOL 100B (Япония).
Результаты и обсуждение
Микроорганизмы образуют биопленки на мочевых камнях. Для проверки нашего предположения о доопе-рационной инфицированности мочевых конкрементов и существования биопленок на их поверхности были изучены 19 мочевых камней, удаленных методом перку-танной нефролитолапаксии. Исследования проводили с помощью двулучевого электронного сканирующего микроскопа Quanta 200 3D. Этот микроскоп позволяет изучать не обработанный агрессивными фиксирующими и красящими веществами материал, подготовка материала для исследования является максимально щадящей для сохранения структуры бактериальной биопленки. При изучении камней диаметром более 1 см мы дробили их на несколько сравнительно мелких фракций и изучали поверхность искусственного скола по сагиттальной линии. С помощью мобильных механизмов микроскоп Quanta 200 3D дает возможность визуализировать исследуемый объект в трех плоскостях. Поэтому были изучены проксимальные (обращенные в полость почечной лоханки), дистальные (обращенные к стенке почечной лоханки) поверхности камней и поверхность искусственного ско-
Рис. 1. Биопленки на поверхности мочевых камней. а - бактериальные клетки под матриксом. Увеличение 2600Х; б - поверхность мочевого камня с биопленкой. Увеличение 1200Х.
Candida albicans 3%
Acinetobacter baumanii 3%
Staphylococcus aureus
3%
Streptococcus spp-
1%
Escherichia coli-
7%
Proteus mirabilis 14%
Klebsiella pneumoniae 8%
Pseudomonas aeruginosa 14%
- Morellf morganii
1%
Enterococcus faecalis 13%
-Enterococcus faecium
9%
Staphylococcus epidermidis 7%
Staphylococcus haemolyticus 17%
Рис. 2. Видовой и процентный состав микроорганизмов, выделенных при микробиологическом высеве из мочевых камней.
ла по сагиттальной линии. По данным СЭМ, рельеф поверхности раздробленных мочевых камней был очень разнообразен: практически гладкий, бугристый, с включениями кристаллов с острыми краями, с округлыми пористыми образованиями, объединенными в конгломераты. В одном и том же камне обнаруживались разные виды поверхностей и кристаллообразных включений. На поверхности 9 из 19 изученных мочевых камней визуализировались бактериальные клетки под плотным слоем матрикса, рыхлые и плотные слизистые образования с перфорацией (рис.1). Морфология обнаруженных образований была полностью идентична структуре биопленок, наблюдаемых в экспериментальных исследованиях, которые проводились ранее в нашем институте.
Таким образом, проведенные электронно-микроскопические исследования мочевых камней показали, что у инфицированных пациентов с МКБ микроорганизмы способны существовать на поверхности мочевых камней в состоянии биопленок. Благодаря этому феномену бактерии остаются жизнеспособными после предоперационной антибиотикотерапии, которая приводит только к эрадикации планктонных форм, и, соответ-
2,5-1
2-
1,5-
1-
0,5-
✓
Г
«S
с/
# -d? ' А к/ **
* с/ </
г
О4
•А-
с/
S
Биопленка, сформированная за 24 ч
Рис. 3. Количество биопленки, сформированной клиническими изолятами разных видов, выделенных из мочевых камней. По оси ординат - оптическая плотность (ОП).
ственно, моча при этом становится стерильной. Предоперационная санация мочевыводящих путей предполагает минимизацию риска развития послеоперационных осложнений, но в реальной клинической практике, к сожалению, возникновение инфекционных осложнений является довольно частым событием. Вероятно, это объясняется тем, что при дроблении или удалении мочевых камней бактериальные биопленки также разрушаются, и высвобождаются свободные бактерии. В результате происходит обсеменение органов мочевыделительной системы теми возбудителями, которыми изначально были инфицированы мочевые камни. Эти возбудители заново формируют биопленки на поврежденных тканях органов мочевыделительной системы или на осколках мочевых камней, являясь причиной хронизации воспалительных процессов в мочевыделительной системе и рецидива МКБ. Отсутствие подтвержденных микробиологическими методами данных об инфицированности удаленных мочевых камней влечет за собой неадекватное послеоперационное антибактериальное лечение.
Микрофлора мочевых камней. Стандартное микробиологическое исследование микрофлоры, удаленных мочевых камней у 200 пациентов показало, что 103 (51%) мочевых камня оказались инфицированными, и в большинстве случаев с поверхности одного и того же камня выделялись микроорганизмы нескольких видов. Смешанная микрофлора из мочевых камней была выявлена у 64 пациентов, в то время как монокультура получена у 39. Обобщенные результаты высевов мочевых камней показали, что наиболее часто выделялись бактерии Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Escherichia coli. Бактерии Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumanii, Candida albicans и Morella morganii выделялись реже. Видовой и процентный состав микроорганизмов, выделенных из мочевых камней, представлен на рис 2.
Как было показано выше, микроорганизмы, колонизирующие мочевыводящие пути и камни при МКБ, объединяются в бактериальные сообщества, формируют общий защитный матрикс и становятся недоступными для антибактериальных препаратов и факторов иммунной защиты организма хозяина. Нами была проверена способность к формированию биопленки практически всех микроорганизмов, выделенных из мочевых камней (166 штаммов разных видов). Максимальной плотности бактериальная биопленка гра-мотрицательных микроорганизмов достигала через 48 ч инкубации, а грамположительных - через 48-72 ч. Результаты количественного анализа биопленок, сформированных микроорганизмами за 24-48 ч, представлены в виде диаграмм (рис. 3).
Уреазная активность микроорганизмов, инфицирующих мочевыво-дящие органы, является фактором патогенности, способствующим формированию мочевого камня. Проведенные тестирования показали, что все проверенные изоляты Pseudomonas aeruginosa (22), Klebsiella pneumonia (13), Proteus mirabilis (22), Staphy-lococcusepidermidis (11), Staphylococ-
/
// /
Биопленка, сформированная за 48 ч
Таблица 1
Результаты культурального исследования клинического материала, полученного от 31 больного МКБ, абс. (%)
Таблица 3
Видовой состав микоплазм и уреаплазм, выявленных в клиническом материале, полученном от 31 больного, абс. (%)
Выделено культур Mycoplasma hominis (количество)
Всего положительных образцов Из них в пробах:
23 (18,5) сыворотка моча свеже- моча из камень крови выделенная лоханки 5 (16,1) 5 (16,1) 8 (25,8) 5 (16,1)
Таблица 2
Частота выявления ДНК микоплазм и уреаплазм в клиническом материале, полученном от 31 больного
Образец клинического материала Число больных с положительным результатом, абс. (%)
Число больных с положительным результатом
25 (80,6)
ДНК только Mycoplasma hominiis ДНК только Mycoplasma genitalium ДНК только Ureaplasma spp ДНК нескольких возбудителей ДНК только Mycoplasma spp
12 (38,7) 1 (3,2) 1 (3,2) 8 (25,8) 3 (9,7)
Мочевой камень Моча из лоханки Моча свежевыделенная Сыворотка крови
21 (67,7) 9 (29,0) 14 (45,1) 8 (25,8)
cus aureus (4), Acinetobacter baumanii (4) и Morganella mor-ganii (2) обладали уреазной активностью.
Анализ частоты выявления «урогенитальных микоплазм» при МКБ в моче и мочевых камнях был проведен культуральным методом. Были исследованы образцы (сыворотка крови, свежевыделенная моча, моча из лоханки и мочевой камень), полученные от 31 пациента (всего 124 образца). Из разных образцов от 8 (25,8%) больных были выделены культуры, идентифицированные методом ПЦР как Mycoplasma hominis (табл. 1). В 5 случаях такая же микоплазма была выделена из сыворотки крови, в 5 -из свежевыделенной мочи (16,1%), в 8 - из мочи лоханки (25,8%) и в 8 случаях из мочевого камня (16,1%). У 2 больных Mycoplasma hominis была выделена из всех 4 образцов. Таким образом, всего в 23 образцах из 124 исследованных (18,5%) куль-туральным методом были выделены бактерии Mycoplasma hominis.
Следует отметить, что все выделенные культуры были представлены в виде чрезвычайно мелких светопреломляющих колоний (менее 10 мкм в диаметре). Они обнаруживались только с помощью светового микроскопа при увеличении х125. Ни в одном случае мы не наблюдали типичных «fried-egg» колоний. Рост был скудным, колонии пассировались с трудом, иногда выдерживали 3-4 пассажа и погибали, но иногда, по-видимому, постепенно адаптировались к среде и успешно перевивались. Но и при пассировании в течение нескольких месяцев морфология колоний не подвергалась изменениям, реверсии к классическим для этого вида колониям ни разу не
наблюдали. Заметим, что и из образцов, взятых с мочевых камней, микоплазма вырастала в культуре также в виде «мини-колоний», но только после нескольких последовательных пересевов. Идентичность таких колоний бактериям Mycoplasma hominis была также доказана с помощью ПЦР. Наряду с культуральным методом клинические образцы были исследованы методом ПЦР. Результаты представлены в табл. 2 и 3.
Из данных табл. 2 следует, что из всех обследованных образцов ДНК микоплазмы чаще всего обнаруживали в мочевых камнях (67,7%) и реже в сыворотке крови (25,8%). При этом наиболее часто выявляли ДНК Mycoplasma hominis и реже Mycoplasma genitalium и Ureaplasma spp (см. табл. 3). В 3 случаях с помощью тест-системы «МИК-КОМ» была выявлена ДНК микоплазм неиден-
Рис. 4. Электроннограммы наложений (соскоб) с поверхности мочевых камней (ТЭМ).
Микоплазмы (|) располагаются в пространствах между волокнами коллагена (К), около эритроцита и лейкоцита (Э и Л).
тифицированных видов, так как эта тест-система не дает возможности проводить видовую идентификацию. Всего из 124 образцов, полученных от 31 пациента, ДНК разных видов микоплазм была обнаружена в 45 (36,2%) образцах.
Образцы сыворотки крови 14 пациентов были исследованы на наличие в них антигенов Mycoplasma hominis. У 8 из них антигены были обнаружены. Следует отметить, что у остальных 6 пациентов, образцы сывороток которых были положительны по ПЦР, также оказались положительными и по содержанию в них антигена. В 5 случаях из сыворотки крови этих пациентов культураль-ным методом были выделены культуры «мини-колоний».
Обращает на себя внимание возможность выделения культуры Mycoplasma hominis (в виде мини-колоний) из камней, удаленных у больных с МКБ в ходе оперативного вмешательства. При этом в ряде случаев положительный результат был получен лишь после ряда последовательных («слепых») пассажей.
Исследование микоплазм в составе бактериальных биопленок, локализованных на мочевых камнях, в сканирующем электронном микроскопе сопряжено с определенными проблемами, связанными с особенностями их субмикроскопической организации. В связи с этим было проведено исследование ультратонких срезов биопленок, так как при этом методе возможна морфологическая идентификация микоплазм. В образцах биопленок, полученных с поверхности почечных камней, были выявлены многочисленные полиморфные структуры (округлые, эллипсовидные, в виде коромысла), окруженные только асимметричной цитоплазматической мембраной, размером от 250 до 400 нм (для округлых форм) и до 800 нм для извитых. Такая субмикроскопическая организация обнаруженных структур соответствует строению микоплазм [15].
Таким образом, было показано, что приблизительно 50% мочевых камней у больных уролитиазом могут быть инфицированы широким спектром возбудителей, которые можно обнаружить при исследовании удаленного мочевого камня стандартными микробиологическими и молекулярно-генетическими методами. С применением электронно-микроскопического метода было показано, что микроорганизмы на поверхности мочевых камней образуют сложно организованные биопленки. Процент выявления Mycoplasma hominis культуральным методом ниже, чем методом ПЦР, что, вероятно, связано с трудностями их выделения и культивирования [5], а также с возможностью выявления фрагментов ДНК клеток микоплазм, разрушенных после антибиотикотерапии. Вероятно, по этой же причине не удалось выделить Ureaplasma spp в том единственном случае, когда была обнаружена ее ДНК. Мы не делали попыток обнаружить Mycoplasma genitalium культуральным методом из-за хорошо известных трудностей ее культивирования и поэтому использовали метод ПЦР как единственный метод ее детекции. Обращает на себя внимание тот факт, что частота выявления ДНК микоплазм в мочевых камнях была значительно выше, чем в моче и сыворотке крови. Микоплазмы, по-видимому, не образуют биопленки, соответствующие традиционным представлениям об их структуре, поскольку они не синтезируют экзоклеточный матрикс. Они могут быть интегрированы в сообщество других микроорганизмов, способных к синтезу экзоклеточного матрикса.
Особый интерес представляет факт выделения Mycoplasma hominis в виде «мини-колоний», не реверсирующих в классическую «fried-egg» форму. Ранее [2, 5] мы описали случаи выделения из сыворотки крови больных с урогенитальной патологией нетипичных по морфологии колоний - «мини-колоний», состоящих из «мини-клеток». Аналогичные культуры были получе-
ны нами в системе in vitro после контакта клеток ми-коплазмы с гипериммунной сывороткой кролика. После контакта длительностью 4 ч и более микоплазмы вырастали на агаре только в виде «мини-колоний», которые длительно пассировались (более 1 года) и никогда не реверсировали в обычные формы. Мы предположили, что индуктором образования этих форм являются иммунные факторы крови. Выделение «мини-колоний» из мочи и почечных камней свидетельствует о более широком распространении этой формы персистенции, чем мы думали прежде. Одновременное обнаружение в сыворотке крови ДНК и антигенов микоплазм, а также выделение в этих случаях культур «мини-колоний» является дополнительным доказательством жизнеспособности необычных персистирующих в организме клеток микоплазм.
Таким образом, полученные данные показали, что для выявления истинного микробного пейзажа при МКБ необходимо исследовать не только мочу, но также мочевой камень и сыворотку крови больных. При выборе стратегии лечения больных с МКБ необходимо учитывать результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований клинических образцов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 10-04-01690 и гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-2038.14.7.
Сведения об авторах:
ФГБУ «Федеральный Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ
Романова Юлия Михайловна - д-р биол.наук, проф., вед. науч. сотр., e-mail: [email protected] - автор для корреспонденции.
Толордава Этери Ромеовна - канд.биол.наук, научн. сотр., e-mail: [email protected]
Алексеева Наталья Валентиновна - канд.биол.наук., ст. науч. сотр.
Степанова Татьяна Валентиновна - канд.биол.наук, ст. науч. сотр.
Левина Галина Александровна - канд.биол.наук, ст. науч. сотр.
Бархатова Ольга Ивановна - канд.биол.наук, ст. науч. сотр.
Гамова Наталья Александровна - канд.биол.наук, ст. науч. сотр.
Гончарова Светлана Александровна - канд.биол.наук, ст. науч. сотр.
Диденко Любовь Васильевна - д-р мед.наук, зав. лабораторией, e-mail: [email protected]
Раковская Ирина Валентиновна - д-р биол.наук, зав. лабораторией
ГКБ им. С.П. Боткина:
Мулабаев Назим Саторович - врач-ординатор, e-mail: [email protected]
Серегин Александр Васильевич - д-р мед.наук, проф. каф. урологии и хирургической андрологии
Серегин Игорь Васильевич - канд.мед.наук, зав. 21-м отделением урологии
литература/references
1. Алексеева Н.В., Степанова Т.В., Толордава Э.Р., Романова Ю.М. Разработка средств борьбы с биопленками: влияние препарата «Лапрот» (на основе человеческого лактоферрина) и антибиотика ципрофлоксацина на рост и процесс образования биопленок бактериями Pseudomonas aeruginosa in vitro. Медицинский алфавит. Лаборатория. 2010; 3: 4-9.
Alexeeva N.V., Stepanova T.V., Tolordava E.R., Romanova Yu.M. Evaluation of means of antibiofilm treatment: influence of 'Laprot' (on a base of humane lactoferrin) and antibiotic cyprofloxacyne on the growth and biofilm formation process by bacteria Pseudomonas
aeruginosa in vitro. Meditsinskiy alfavit. Laboratoriya. 2010; 3: 4-9.
2. Левина Г.А., Бархатова О.И., Горина Л.Г. Гамова Н.А., Гончарова С.А., Миллер Г.Г. и др. Необычные формы персистенции Mycoplasma hominis в организме инфицированных людей. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012; 4: 104-9.
Levina G.A., Barkhatova O.I., Gorina L.G., Gamova N.A., Gon-charova S.A., Miller G.G. et al. Inusual forms of persistence of Mycoplasma hominis in organism of infected humans. Zhurnal mikrobi-ologii, epidemiologii i immunobiologii. 2012; 4: 104-9. (in Russian)
3. Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. СПб. Наука, 1994.
Mironov A.A., Komissarchik Ya. Yu., Mironov V.A. The Methods of Electronic Microscopy in Biology and Medicine: The Methods Manual. St. Petersburg: Nauka; 1994. (in Russian)
4. Перепанова Т.С., Хазан П.Л., Волкова Е.М., Эгамбердиев Д.К., Толордава Э.Р., Романова Ю.М. Проблемы лечения рецидивирующей инфекции нижних мочевых путей. Саратовский научно-медицинский журнал. 2011; 7(2): 38-43.
Perepanova T.S., Khazan P.L., Volkova E.M., Egamberdiev D.K., Tolordava E.R., Romanova Yu.M. Saratovskiy nauchno-meditsinskiy zhurnal. 2011; 7(2): 38-43. (in Russian)
5. Раковская И.В., Бархатова О.И., Гамова Н.А., Гончарова С.А., Горина Л.Г., Левина Г.А. и др. Нетипичные формы Mycoplasma hominis из крови инфицированных ею людей. Клиническая лабораторная диагностика. 2011; 12: 35-8.
Rakovskaya I.V., Barkhatova O.I., Gamova N.A., Goncharova S.A., Gorina L.G., Levina G.A. et al. The atypical forms of myco-plasmas persisting in the organism of mycoplasmas infected persons. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2011; 12: 35-8. (in Russian)
6. Раковская И.В., Горина Л.Г., Балабанов Д.Н., Левина Г.А., Бархатова О.И., Гончарова С.А., Гамова Н.А. Генерализованная ми-коплазменная инфекция у больных и носителей. Журнал микробиологии и иммунобиологии. 2014; 2: 37-43.
Rakovskaya I.V., Gorina L.G., Balabanov D.N., Levina G.A., Barkhatova O.I.,Goncharova S.A., Gamova N.A.Generalized mycoplasma infection in patients and carriers. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2013; 2: 37-43.
7. Раковская И.В. Микоплазмы - возбудители микоплазменных инфекций. В кн.: Руководство по медицинской микробиологии / Под ред. А.С. Лабинской и др. М.: БИНОМ; 2010. 964-91. Rakovskaya I.V. Mycoplasmas - the patogens of mycoplasma infection. In: Ed. A.S. Labinskaya et al. Moscow: BINOM; 2010: 964-91. (in Russian)
8. Раковская И.В. Микоплазмы и микоплазмозы. В кн.: Частная медицинская микробиология / Под ред. Лабинской А.С. и др. М.: Медицина; 2005; 454-5.
Rakovskaya I.V. Mycoplasma and mycoplasma diseases. In: Special Medical. Microbiology. / Ed. A.S. Labinskaya et al. Moscow: Medit-sina; 2005: 454-5.
9. Романова Ю.М., Толордава Э.Р., Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Вестник РАМН. 2011. 10: 31-9.
Romanova Iu.M., Tolordava E.R., Didenko L.V., Gintsburg AL. [Biofilms of pathogenic bacteria and their role in chronization of infectious process. The search for the means to control biofilms. Vest-nik RAMN. 2011; (10): 31-9. (in Russian) 10. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Смирнова Т.А., Андреев А.Л.,Диденко Л.В., Гинцбург А.Л. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006; 4: 38-42.
Romanova Yu.M., Alekseeva N.V., Smirnova T.A., Andreev A.L.,
Didenko L.V., Gintsburg A.L. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii, immunobiologii. 2006; (4): 38-42. (in Russian)
11. Савичева А.М., Прилепская В.Н., Соколовский Е.В., Кисина В.И., Гущин А. Е., Забиров К.И. Роль микоплазм в урогениталь-ной патологии женщин и их половых партнеров. В кн.: Актуальные проблемы здравоохранения. 2008; т. 57: 11-22. Savicheva A.M., PrilepskayaV.N., Sokolovskiy E.V., Kisina V.I., Gushchin A.E., Zabirov K.I. The role of mycoplasmas in urogenital patology of women and their sex partners. In: Actual Problems Care Public Health. 2008; vol. 57: 11-22.
12. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян Р.Р., Романова Ю.М. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. Микробиология. 2010; 79(4): 1-12.
Smirnova T.A., Didenko L.V., Azizbekyan R.R., Romanova Yu. M. Structural and functional characteristics of bacterial biofilms. Mikrobiologiya. 2011; 79(4): 1-12. (in Russian)
13. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilm: a common cause of persistent infections. Sciencе. 1999; 284: 318-22.
14. Davey M. E., O'Tool G. A . Microbial biofilm: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64(4): 847-67.
15. Domermuth C.H., Nielsen M.H., Freundit E.A., Birch-Andersen A. Ultrastrucure of Micoplasma species. J. Bacteriol. Sep. 1964; 88(3): 727-44.
16. Donlan R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg. Infec. Dis. 2002; 8: 1-20.
17. Falk L., Fredlund H., Jensen J. Signs and symptoms of uretritis and cervicitis among women with or without Mycoplasma genitalium and Clamydia trachomatis infection. STD. 2005; 81: 73-8.
18. Ito S., Karnovsky M.J. Formaldrhyde/glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell Biol. 1968; 39: 168a-9a.
19. O'Toole G.A., Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol. Microbiol. 1998; 30: 295-304.
20. Ross J.D., Jensen J.S. Mycoplasma genitalium as a sexually transmitted infection: implication for screening, testing and treatment. Sex. Transm. Infect. 2006; 82: 269-71.
21. Taylor-Robinson D., Gilroy C.B., Thomas B.J., Hay P.E. Uretritis Mycoplasma genitalium in chronic non-gonococcal urethritis. Int. J. STD AIDS. 2004; 15: P. 21-5.
Поступила 24.11.14 Received 24.11.14
MICROBIAL COMMUNITIES ON KIDNEY STONES
Yu. M. Romanova1, N. S. Mulabaev2, E. R. Tolordava1, A. V. Seregin2,
I. V. Seregin2, N. V. Alexeeva1, T. V. Stepanova1, G. A. Levina1, O. I. Barhatova1, N. A. Gamova1, S. A. Goncharova1, L. V. Didenko1, I. V. Rakovskaya1
1 Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow, Russia; 2 Botkin's Moscow City Clinical Hospital, Moscow, Russia
The clinical material obtained surgically in patients with kidney stone disease (KSD) was tested for content of the stone microflora using PCR and standard microbiological methods. It was demonstrated that about 50% of stones in patients with KSD were infected with various infection agents as observed using standard microbiological and molecular genetic methods. The percentage of detection of the Mycoplasma hominis using cultural method is lower than the percentage detected using PCR, which is due to difficult isolation and cultivation, as well as DNA fragments of mycoplasma observed after antibiotic therapy. Studies based on modern microscopy methods showed that microorganisms on the surface of the kidney stone formed multispecies biofilms.
Key words: biofilms, kidney stones, nephrolithiasis, chronic infections.
