CC BY
265
УДК 616.931:616-078
Г.Я. Ценева', Л.А. Краева', С.А. Габриелян2, Е.Е. Щедеркина'
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ У ШТАММОВ ООЯУЫЕВЛОТЕЯ/ЛЕ й/РНТНЕЯЛЕ
1 Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург) 2 Национальный институт здравоохранения (Ереван)
Дана сравнительная оценка пяти фенотипических методов определения дифтерийного токсина и молекулярного — для. обнаружения гена токсина у штаммов, изолированных в Северо-Западном. Округе РФ в период подъема и спада эпидемии дифтерии. Методы, сравнивали между собой по чувствительности, специфичности, времени для. подготовки, и. проведения, реакций, простоте постановки, срокам, и. условиям, хранения диагностических наборов.
Учитывая, тот. факт, что получение положительного результата в ПЦР требует, подтверждения в фенотипическом, методе, результаты, сравнения между собой фенотипических методов показали существенное преимущество иммунохроматографического теста и. реакции непрямой гемагглюти-нации в качестве подтверждающих тестов.
При. наличии в настоящее время чувствительных и. специфичных методов определения токсигенно-сти коринебактерий использование одного лишь Elek-теста при определении, токсигенности штамма является, некорректным, требуется, дополнительный, контроль.
Ключевые слова: дифтерийный токсин, коринебактерии, методы определения токсигенности C. diphtheriae
METHODS FOR THE DETECTION OF DIPHTHERIA TOXIN AMONGST ISOLATES OF C. DIPHTHERIAE
G.Ya. Tseneva1, L.A. Krayeva1, S.A. Gabrielyan2, E.E. Shchederkina1
1 Saint-Petersburg Pasteur Institute, Saint-Petersburg
2 National Institute of Health, Yerevan
The comparative estimation, of five phenotypic and genotypic methods for the detection of diphtheria toxin amongst isolates in North-West region of Russia in period, of lifting and reduction of diphtheria epidemic was given.
Methods were compared, for sensibility, specificity, time for preparation, and. conducting of assay, simplicity of method, time and. conditions of diagnostical compositions.
The positive result in PCR requires confirming in phenotypic method. Therefore results of comparison, between phenotypic methods displayed, substantial advantage of immunochromatographical assay and. reaction. of nondirect gemagglutination as a confirm, assay.
Some sensitive and. specific assays for the detection of diphtheria toxin are present now; therefore using of Elek-test only in the definition, toxygenecity of isolates does not correct and. requires complementary control. Key words: diphtheria toxin, corynebacteriae, detection of toxygenecity C. diphtheriae
ВВЕДЕНИЕ
Идентификация возбудителя дифтерии в первую очередь строится на определении способности выделенной культуры к токсинообра-зованию. Известно, что токсигенность С. diphtheriae является ведущим фактором патогенности данного микроорганизма, определяющим развитие дифтерийной инфекции. В связи с этим наиболее важным моментом в микробиологической диагностике дифтерии является определение токсигенности изолированных штаммов. Установлено, что не все изоляты С. diphtheriae способны продуцировать токсин. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) был выявлен ряд штаммов, не экспрессировавших токсин, несущих «молчащий» 1ох-ген. [11, 22]. Было показано, что такие штаммы часто встречались в коллекциях С. diphtheriae, изолированных в Северо-Западном Округе РФ. Так, из 243 культур, выделенных ранее в период подъема заболеваемости, 26,6 % содержали
ген токсина. Значительная часть из них при культивировании по специальной методике возобновляла токсинопродукцию [6].
Установление истинной токсигенности определяет клиническое и эпидемиологическое значение штаммов С. diphtheriae при подтверждении диагноза дифтерии и проведении мероприятий, препятствующих распространению инфекции среди контактных лиц [8, 11 — 13, 15, 18, 21].
Как известно, существует ряд методов для выявления дифтерийного токсина у штаммов кори-небактерий и в клиническом материале. Классический метод нейтрализации, проводимый на животных, весьма трудоемок, сложен в постановке, дорог по материальным затратам и занимает несколько дней [17].
Результаты исследований, проведенных параллельно с помощью кожной пробы на кроликах и в культуре клеток Уего, оказались сопоставимы, вместе с тем реакция нейтрализации на культуре клеток проще, дешевле, доступнее, стандартнее и
нагляднее, чем реакция нейтрализации на животных [19]. Однако результат и в этом тесте также можно получить лишь спустя несколько дней (4 — 7), что ограничивает его применение при проведении исследований в клинической лаборатории, где результат должен быть получен в минимально короткие сроки.
В ходе прошедшей эпидемии был предложен ряд других тестов для выявления дифтерийного токсина: реакция коагглютинации (РКоА) с антигенным диагностикумом [1, 14], иммунофер-ментный анализ (ИФА) с тест-системой на основе специфических моноклональных антител к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы дифтерийного токсина [2, 1], ИФА с тест-системой на основе моноклональных антител к определенному эпитопу молекулы антигена (токсина) [3], иммунопероксидазный метод с моноклональными антителами на эпителиоцитах слизистой ротоглотки [1, 5]. Однако указанные чувствительные тест-системы по ряду причин не были внедрены в широкую практику.
Поэтому в практической лабораторной практике преимущество получили тесты определения токсинопродукции в реакциях агглютинации, преципитации, а также при использовании иммуно-ферментных и генетических тест-систем.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценить эффективность использования иммунологических методов определения токсигенности у C. diphtheriae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Токсинопродукцию и/или наличие tox-гена определяли у штаммов C. diphtheriae, изолированных от больных различными формами дифтерии, подозрительных на инфекцию, лиц с острой патологией ротоглотки, контактных и лиц, обследованных с профилактической целью. За период 1995 — 2001 гг. изучено 209 штаммов, в том числе 86 — изолированы от больных, 123 — от лиц без клинических симптомов. Из них 130 штаммов принадлежали к биовару gravis и 77 — к биовару mitis, выделенных на 6 территориях Северо-Западного Округа РФ1.
В работе использованы референс-штаммы C. diphtheriae № 10356 (tox — ), № 10648 (tox + ) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK).
Первичная идентификация коринебактерий из биологического материала проводилась в бактериологических лабораториях центров госсанэпиднадзора и бактериологических лабораториях инфекционных стационаров Санкт-Петербурга.
Идентификацию C. diphtheriae проводили в соответствии с Методическими указаниями «Ла-
бораторная диагностика дифтерийной инфекции» (МУ 4.2.698-98).
Для определения токсигенности C. diphtheriae были использованы 5 тестов: полимеразная цепня реакция (ПЦР), иммунохроматографический тест (ICS), иммунопреципитация в агаре (Elek-тест), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция агглютинации латекса (РАЛ).
Для постановки ICS-теста использовали диагностический набор, полученный из Diphtheriae Reference Laboratory (CPHL), London, UK. Он включал нитроцеллюлозную мембрану в виде полосок с нанесенными на них лошадиными поликлональными антитоксическими антителами. Специфическую детекцию проводили с помощью меченных коллоидным золотом моноклональных специфических антител к фрагменту А дифтерийного токсина, нанесенных на ICS-полоску. Исследуемые штаммы C. diphtheriae выращивали на кровяном агаре, колонии суспендировали в 0,5 мл Elek-бульона (CPHL) с целью получения бактериальной взвеси, соответствующей стандарту мутности 1 по Мак Фарленду (1 x 108КОЕ/мл). Инкубировали при 37 “С в течение 3 часов. Затем в каждую пробирку вносили по одной ICS-полоске и оценивали результат через 15 минут, сравнивая с результатом контрольных штаммов.
Elek-тест проводили по общепринятой методике, согласно МУ 4.2.698-98 с использованием среды ОТДМ для определения токсигенности дифтерийных микробов производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала, Россия. Для приготовления бумажных дисков применяли «Антитоксин диагностический дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией, сухой» производства НПО «Биомед» г. Пермь.
Для постановки РНГА использовали диагностический набор с эритроцитарным диагностику-мом (производства НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург) согласно инструкции, прилагаемой к набору. Культуры с C. diphtheriae выращивали на сывороточном агаре в течение 24 часов при 37 “С. После чего по 3 колонии каждой культуры засевали в пробирки с 2,0 мл жидкой питательной среды (среда 199 с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота) и инкубировали 16 — 18 часов при 37 “С. С учетом чувствительности диаг-ностикума, равного 0,003 Lf/ml токсина и стандартности препарата токсигенность штаммов определяли также количественно.
Определение токсигенности штаммов C. diph-theriae в РАЛ основано на выявлении дифтерийного токсина в культуральном фильтрате бактерий с помощью гелевого диагностикума. Последний представляет собой латексные частицы, окрашенные в красный цвет, на которых фиксированы антитела к дифтерийному токсину. Для проведения теста необходим диагностический набор «ID-
1 Выражаем благодарность врачам-бактериологам Центров Госсанэпиднадзора Вологодской, Калининградской, Ленин-
градской, Новгородской, Псковской областей, г. Санкт-Петербурга, предоставившим культуры бактерий для изучения.
PaGIA Diphtheria Toxin Test» и оборудование (центрифуга, пластиковые карты, включающие 6 микропробирок с гелем Sephadex) СП Германия — Россия, ГРМИ № 94/256. Выращенные на 5% кровяном агаре культуры смывали ФСБ до плотности биомассы > 5 ЕД по стандарту мутности (ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Москва). Полученные фильтраты исследовали в тесте, для чего в микропробирки с внесенным гелем Sephadex вносили по 25 мкл латексного диагностикума и по 100 мкл фильтрата испытуемых культур C. diphtheriae. После 10 минут инкубации пробирки центрифугировали (10 мин., 1000 об./мин.). При наличии дифтерийного токсина на поверхности геля происходила агглютинация латексных частиц с образованием крупных агглютинатов, выявляемых по окрашиванию латексных частиц — красная полоса в верхнем слое геля. Результат РАЛ оценивали по 4-крестной системе.
Оценку чувствительности и специфичности каждого метода рассчитывали по формулам, приведенным Domeika (1994). Истинно положительным считали положительный результат, полученный при исследовании культуры C. diphtheriae в Elek-тесте и/или двумя другими различными методами.
Чувствительность = ИП / (ИП + ЛО) х 100 %;
Специфичность = ИО / (ИО + ЛП) х 100 %, где ИП — истинно положительный результат;
ИО — истинно отрицательный результат;
ЛП — ложно положительный результат;
ЛО — ложно отрицательный результат.
Сравнительную оценку чувствительности и специфичности использованных методов определения дифтерийного токсина проводили, рассчитывая коэффициент корреляции (r) между классическим культуральным методом и изучаемыми тестами. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В предыдущей публикации были приведены данные по диагностической эффективности ПЦР, ее клинической и эпидемиологической значимости (Г.Я. Ценева, Е.Е. Щедеркина, 2000). В настоящем исследовании ПЦР использовали в качестве дополнительного метода контроля нетоксиген-ных культур и для определения частоты встречаемости штаммов C. diphtheriae с «молчащим» геном, циркулировавших в указанный период изучения.
Всего в ПЦР исследовано 146 штаммов, из них 78 (53,4 %) содержали активный ген токсина (по данным других методов), остальные 68 штаммов по результатам фенотипических методов расценивались как нетоксигенные, хотя 27,9 % из них содержали «молчащий» ген. На 16,1 % чаще «молчащий» ген обнаруживали у бактерионосителей.
Сравнительные результаты чувствительности и специфичности фенотипических методов представлены на рис. 1.
Данные, полученные при использовании Elek-тестa подтвердили результаты других авторов о том, что с его помощью невозможно достигнуть максимальных результатов при установлении токсигенности штаммов. Из 209 исследованных штаммов с помощью Elek-тестa идентифицированы 83,7 % токсигенных и нетоксиген-ных штаммов, при этом специфичность метода составила 96,0 %. В Elek-тесте получали как ложно-отрицательные, так и ложно-положительные ответы.
Максимальной чувствительностью и специфичностью обладал ICS-тест: 96,2 % и 100 % соответственно, высокой — РНГА (96,0 % и 94,5 %). Коэффициент корреляции (r) между результатами ICS- и Elek-тестом составил 0,88 при р < 0,05, а между результатами РНГА и Elek-тестом — 0,82 при р< 0,05. В ICS-тесте не зарегистрировано ложно-положительных результатов, а в РНГА та-
Рис. 1. Оценка диагностической эффективности фенотипических методов определения токсина у С. сИрМЬвпав.
кие ответы получены в единичных случаях. Оба метода просты в исполнении, они не требуют специального оборудования для проведения реакции. Вместе с тем, ICS-тест требует меньше времени как на подготовку проб (3 — 16 часов) по сравнению с РНГА (18 — 20 часов), так и на проведение самой реакции — 15 минут и 2 часа соответственно.
При сравнении результатов определения ток-сигенности C. diphtheriae в РАЛ было выявлено 6 (12,8 %) ложно-положительных результатов. С учетом невысокой специфичности РАЛ, продолжительности подготовки проб в течение 18 — 24 часов, но низкой цены диагностического набора, простоты постановки реакции, срока хранения набора в течение 1 года и быстроты реакции (10—15 мин) РАЛ может быть использована как ориентировочный метод массового контроля токсигенности штаммов. В течение одного часа можно исследовать до 480 фильтратов из культуральных смывов C. diphtheriae.
ВЫВОДЫ:
1. Генотипический метод определения дифтерийного токсина позволяет быстро определиться с дальнейшей тактикой микробиолога: отрицательный результат в ПЦР дает возможность утверждать, что изучаемый штамм нетоксигенный; положительный результат в ПЦР требует дальнейшего изучения токсигенности с помощью фенотипического метода.
2. Одним из рекомендуемых фенотипических методов определения токсигенности может служить ICS-тест или РНГА в зависимости от конкретного случая.
3. Исследование штаммов C. diphtheriae в Elek-тесте целесообразно сопровождать дополнительным контролем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дифтерия у детей / В.В. Иванова, О.В. Родионова, А.А. Аксенов и др. — СПб., 2000. — С. 255.
2. Зимина Л.Г. Методы выделения и идентификации коринебактерий дифтерии в бактериологических лабораториях г. Москвы / Л.Г. Зимина, О.Н. Зайцева // Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики: Мат. докл. Всерос. научн-практич. конф. — Пермь, 1993. — С. 43-44.
3. Использование моноклональных антител к дифтерийному токсину в клинической диагностике и эпидемиологической практике / В.В. Свиридов, Н.Г. Титова, Н.В. Яковлева и др. // Мат. 7-го съезда Всерос. общества эпидеми-ол., микробиол., паразитол.: Тез. докл. — М., 1997. — С. 493 — 494.
4. Полимеразная цепная реакция в диагностике бактериальных инфекций / В.М. Безруков, Г.А. Шипулин, Н.А. Федоров и др. // Журн. микробиол. Приложение. — 1997. — С. 20 — 23.
5. Свиридов В.В. Иммунодиагностика дифтерии при помощи набора «Дифтерия-Монозим» / В.В. Свиридов, Е.М. Зайцев, А.Е. Луговая // Совр. напр. создания мед. диагностикумов: Тез. докл. Всесоюзн. конф. — М., 1993. — С. 43.
6. Ценева Г.Я. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике дифтерийной инфекции / Г.Я. Ценева, Е.Е. Щедеркина // Жур. микробиол. — 2000. — № б. — С. 10—13.
7. Щедеркина Е.Е. Основные патогенные свойства C. diphtheriae и усовершенствование лабораторной диагностики дифтерийной инфекции: Дис. ... канд. мед. наук. — СПб., 2001. — С. 132.
8. Afghani B. Bacterial arthritis caused by Corynebacterium diphtheriae / B. Afghani,
H.R. Stutman // Pediatr. Infect. Dis. — 1993. —J. 12.
— P. 881 —882.
9. Aravena-Roman M. Polymerase chain reaction for the detection of toxigenic Corynebacterium diph-theriae / M. Aravena-Roman, R. Bowman, G. O'Neil // Pathol. — 1995. — Vol. 27. — P. 71—73.
10. Comparision of phenotypic and genotypic methods for the detection of diphtheria toxin amongst isolates of pathogenic corynebacteria / A. Efstratiou, K.H. Engler, C.S. Dawes, D. Sesardic // J. Clin. Microbiol. — 1998. — Vol. 3б. — P. 3173 — 3177.
11. Efstratiou A. Non-toxigenic C. diphtheriae in England / A. Efstratiou, R.G. George, N.T. Begg // Lancet. — 1993. — Vol. 341. — P. 1592—1593.
12. Emergence of related nontoxigenic C. diph-theriae biotype mitis strains in Western Europe / G. Funke, M. Altwegg, L. Frommelt, A. von Graven-itz // Emerg. Infect. Dis. — 1999. — Vol. 5. — P. 477 — 480.
13. Infective endocarditis due to non-toxigenic Corynebacterium diphtheriae: report of seven cases and review / S.M. Tiley, K.R. Kokiuba, L.G. Heron, R. Munro // Clin. Infect. Dis. — 1993. — Vol. 1б. — P. 271 —275.
14. Jalgaokar S.V. Coagglutination for rapid testing of toxin producing Corynebacterium diph-theriae / S.V. Jalgaokar, A.M. Saoji // Indian Journal of Medical Reseach. — 1993. — Jap.: 97. — P. 35 — 3б.
15. Lortolary O. Corynebacterium diphtheriae endocarditis in France / O. Lortolary, A. Buu-Hoe, L. Gutman, J. Acar // Clin. Infect. Dis. — 1995. — Vol. 31. — P. б3 — б5.
16. Nakao N. Development of a direct PCR assay for detection of diphtheria toxin gene / N. Nakao, T. Popovic // J. Clin. Microbiol. — 1997. — Vol. 35.
— P. 1б51 — 1б55.
17. Okabe L. On a method of the standardization of anti-diphtheria serum by the use of tissue cultivation / L. Okabe // Kitasato Archive of Experimental Medicine. — 1933. — Vol. 10. — P. 41—5б.
18. Pallen M.J. Rapid screening for toxigenic Corynebacterium diphtheriae by the polymerase chain reaction / M.J. Pallen // J. Clin. Pathol. — 1991. — Vol. 44. — P. 1025—102б.
19. Placido-Sousa C. The action of diphtheria toxin on tissue cultures and its neutralization by antitoxin / C. Placido-Sousa, D.G. Evans // The British Journal of Experimental Pathology. — 1957. — Vol. 38. — P. 644-650.
20. Polymerase chain reaction for screening clinical isolates of corynebacteria for the production of diphtheria toxin / M.J. Pallen, A.J. Hay, L.H. Puckey, A. Efstratiou // J. Clin. Pathol. — 1994. — Vol. 47. — P. 353 — 356.
21. Septic arthritis due to a nontoxigenic strain of Corynebacterium diphtheriae subspecies mitis / V. Barakett, G. Morel, D. Lesage, J.C. Petit // Clin. Infect. Dis. — 1993. — Vol. 17. — P. 520 — 521.
22. Tseneva G. Pathogenic properties of Corynebacterium diphtheriae and methods of detection / G. Tseneva // Proceeding of the First Intern. meeting of the European Laboratory Working Group of Diphtheria, London, UK. — 1994. — Р. 21.
