CC BY
71
УДК 579.66 : 663.534
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ С ПОМОЩЬЮ ШТАММА SACCHAROMYCES CEREVISIAE ВКПМ Y-1693
© Е.А. Скиба
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН, 659322, Россия, г. Бийск, ул. Социалистическая, 1, [email protected]
Промежуточным продуктом в цепочке превращений целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол является гидролизат. Определять химический состав гидролизатов для оценки их пригодности для биосинтеза биоэтанола - дорогостоящая и сложная процедура. Поэтому для определения биологической доброкачественности сред разработана методика, базирующаяся на двух критериях: морфофизиологическом состоянии культуры на исследуемой среде и выходе биоэтанола. Обоснован выбор тестовой культуры - штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1693. Показано, что методика дает объективные результаты и может использоваться в качестве тестовой для определения пригодности гидролизата для биосинтеза биоэтанола. Установлено, что ферментативный гидролиз технических целлюлоз плодовых оболочек овса и мискантуса позволяет получить биологически доброкачественные глюкозные среды, которые потенциально могут применяться не только для получения биоэтанола, но и для получения широкого спектра веществ микробиологического синтеза.
Ключевые слова: биологическая доброкачественность; штамм; целлюлозосодержащее сырье; гид-ролизат; биоэтанол.
DETERMINATION PROCEDURE FOR BIOLOGICAL GOODNESS OF HYDROLYZATES FROM CELLULOSIC BIOMASS USING SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y-1693 STRAIN
E.A. Skiba
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies SB RAS), 1, Sotsialisticheskaya St., Biysk 659322, Russia; [email protected]
A hydrolyzate is the intermediate in the transformation chain of cellulosic raw materials into bioethanol. Quantification of the chemical composition of hydrolyzates to evaluate their suitability for biosynthesis of bioethanol is a high-cost and complicated process. A procedure has therefore been developed for determination of biological goodness of broths and it is based on two criteria: morphological condition of a culture on a medium under examination, and bioethanol yield. A choice of the test culture, Saccharomyces cerevisiaeY-1693 strain, has been justified. The procedure was shown to provide objective results and can be employed as a hydrolyzate suitability test for bioethanol biosynthesis. Enzymatic hydrolysis of pulps from oat hulls and Mis-canthus was found to afford biologically good quality glucose broths that have the potential to be used to produce not only bioethanol, but also a wide array of substances of microbiological synthesis. The paper includes 4 illustrations, 3 Tables, 17 references. Keywords: biological goodness; strain; cellulosic biomass; hydrolyzate; bioethanol.
ВВЕДЕНИЕ
Переработка целлюлозосодержащей биомассы в биоэтанол в настоящее время является фундаментальным и современным направлением промышленной биотехнологии [17]. Промежуточным продуктом в цепочке превращений целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол является гидролизат, представляющий собой раствор смеси гексоз и пентоз. Сахара с помощью микроорганизмов могут быть превра-
щены не только в биоэтанол, но в широчайший спектр веществ: аминокислоты, антибиотики, белки, витамины, органические кислоты, липиды, ферменты и т.д. [7], в том числе в востребованную на рынке бактериальную целлюлозу [4].
Гидролизаты можно получать химическим или энзиматическим способом. Химический состав гидролизатов варьирует в широких пределах и зависит от вида сырья, его химического состава (обусловленного природно-
климатическими условиями, сортом, агротехническими особенностями возделывания и пр.), способа получения гидролизата, от принятой технологической схемы, режимов работы оборудования и т.д. Гидролизаты, получаемые в результате гидролиза растительного целлюлозосодержащего сырья, представляют собой полидисперсную многокомпонентную систему. Кроме моносахаридов (гексоз и пен-тоз) в гидролизатах содержатся олигосахари-ды, летучие и нелетучие органические кислоты, продукты разложения сахаров (фурфурол, оксиметилфурфурол), побочные продукты гидролиза (метанол, формальдегид, ацетон, лиг-ногуминовые вещества), минеральные вещества, а также вещества, характерные для данного сырья (например, терпены и скипидар для древесного сырья) или для данного способа получения гидролизатов (лигносульфоновые кислоты в сульфитных щелоках). В кислотных гидролизатах древесины содержание сухих веществ (СВ) составляет 3,5-5,0%, из них 2,83,2% сбраживаемых сахаров; в сульфитных щелоках - 9,0-13,0% СВ, из них 1,7-2,6% сбраживаемых сахаров [13]. Известно, что гид-ролизаты являются средами, малопригодными для жизнедеятельности дрожжей, поскольку в них недостаточное содержание азотных и фосфорных соединений, отсутствуют витамины и стимуляторы роста.
Непостоянство химического состава гид-ролизатов объясняет их нестабильные биотехнологические характеристики. Такие вещества как фурфурол, оксиметилфурфурол, летучие кислоты, формальдегид, лигногумино-вые вещества и т.д., образующиеся в процессе кислотного гидролиза целлюлозосодержащего сырья, относят к вредным примесям, снижающим биологическую доброкачественность среды и, соответственно, выход целевого продукта. Образование вредных примесей объясняется совмещением химических (кислота) и физических (давление, температура) воздействий на сырье при кислотном гидролизе [1, 11, 13].
В отличие от кислотных гидролизатов, ферментативные получают в мягких условиях: температурный диапазон - от 30 оС до 60 оС, рН - от 4 до 6 ед. рН, что исключает образование вредных примесей и химические превращения сахаров. Однако целлюлозосодержа-щее сырье не может быть подвергнуто ферментативному гидролизу в нативном виде, так как матрица растения состоит из нескольких полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина, которые в совокупности образуют композиционный материал, более прочный и устойчивый к действию физических и химических факторов, чем отдельные компоненты. Чтобы
ферментные комплексы могли расщепить индивидуальные полимеры, необходимо разрушить композитную матрицу, для чего нативное сырье необходимо подвергнуть химической или физико-химической обработке [9, 14].
В ИПХЭТ СО РАН для гидролиза исследуются разные способы предварительной обработки целлюлозосодержащего сырья: нейтральный гидротропный [5], азотнокислый [2], щелочной, комбинированный [3], гидротермоба-рический [12]. Все способы оптимизируются и модифицируются в зависимости от поставленных задач (химическая или биотехнологическая последующая переработка целлюлозо-содержащего сырья). В качестве сырья нами используются плодовые оболочки овса (ПОО) - многотоннажный отход сельского хозяйства в Алтайском крае - и техническая быстрорастущая злаковая культура мискантус, из-за быстрого прироста биомассы называемая энергетической. Таким образом, биосинтез биоэтанола из целлюлозосодержащего сырья представляет непростую задачу, на каждой технологической стадии (предварительная обработка, ферментативный гидролиз, спиртовое брожение) сложно прогнозировать успешность процесса.
На стадии исследований проблема нестабильности химических и биотехнологических характеристик гидролизатов является особенно острой. Определять химический состав гид-ролизатов для оценки их пригодности для биосинтеза биоэтанола - дорогостоящая и сложная процедура. Поэтому доброкачественность сред принято определять биологическим методом, например, по выходу биомассы или продукта метаболизма, либо по физиологической активности продуцента. Под биологической доброкачественностью понимают показатель, отражающий степень влияния вредных примесей среды на процесс биосинтеза биоэтанола или на процесс выращивания биомассы дрожжей. Доброкачественной считают среду, на которой функция размножения дрожжевых клеток не подавляется, а субстрат расходуется на биосинтез целевого продукта [13].
Дрожжи - один из самых неприхотливых микроорганизмов, обладающий колоссальным потенциалом адаптации к сложным производственным условиям, благодаря чему именно дрожжи очень широко применяются в пищевых производствах (получение хлеба, пива, вина, пищевого спирта), технической микробиологии (биосинтез биомассы, ферментов, витаминов, липидов, пептидов, нуклеотидов, технического биоэтанола), научных исследованиях (генетика эукариот, энзимология, биохимия, микробиология). Если установлено, что среда является
биологически доброкачественной для дрожжей, то высока вероятность, что данная питательная среда может успешно применяться для микробиологических синтезов, проводимых с помощью других, более взыскательных микроорганизмов. Поэтому методика определения доброкачественности гидролизата, полученного из целлюлозосодержащего сырья, имеет важное прикладное значение не только в технологии биоэтанола.
Цель данной работы - разработка методики определения биологической доброкачественности гидролизатов из целлюлозосодержащего сырья с помощью штамма БаооЬа-готуовв оегеч&ае ВКПМ У-1693.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Штамм ЗаооЬаготуовз овгв^^ав ВКПМ У-1693 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Он был выделен из ферментера Котласского ЦБК Архангельской области и использовался для производства спирта на сульфитных щелоках. Особенностью штамма является его устойчивостью к вредным примесям сред. Культивирование штамма во всех опытах проводилось в стандартных условиях: анаэробно, при температуре 28 оС, на стерильной питательной среде. Засевные дрожжи получали культивированием на среде стерильного неохмеленного солодового сусла, инокулят засевался в экспоненциальной фазе развития культуры в дозировке 10-15% по объему. К засевным дрожжам предъявлялись требования, принятые в отрасли: общая численность клеток 100-120 млн КОЕ/мл, доля почкующихся дрожжей - 15-25%; мертвых - 0,5-1,0%; упитанных - 60-70%; клеток физиологически молодых - 20-25%, наличие посторонних микроорганизмов не допускается [8].
Эксперименты проводились в два этапа. На первом этапе изучалась физиологическая активность и способность штамма к синтезу этанола на эталонной среде неохмеленного солодового сусла (8,5% СВ) и на синтетической голодной среде. Состав синтетической голодной среды приведен в табл. 1. Среда содержит все необходимые для сахаромицетов питательные соли и витамины, но не содержит сахаров. На указанных модельных средах штамм У-1693 культивировался в течение 10 сут.
На втором этапе изучение физиологической активности и способности штамма к синтезу этанола проводили на опытных гидролизных средах. Поскольку все остальные условия были стандартными, опыты отличались только составом питательной среды, поэтому различия в результатах обусловлены именно разли-
чиями в биологической доброкачественности сред.
Таблица 1
Состав синтетической голодной среды
Компонент среды Дозировка, г/1000 мл среды
(NH4)2SÜ4 5,00
KH2PO4 0,80
MgSO4*7H2O 0,50
NH4CI 0,50
K2HPO4 0,15
Дрожжевой автолизат 2,00
В примере 1 оценивалась биологическая доброкачественность кислотных гидролизатов, полученных в следующих условиях: сырье обрабатывалось 0,2%-ым раствором соляной кислоты с гидромодулем 1 : 15 при температуре 90-95 оС, в течение 5-6 ч. Эти условия соответствуют предварительной химической обработке и не могут обеспечивать выделение целлюлозы или ее гидролиз. Однако очевидно, что сахара переходят в раствор, а легкогидро-лизуемые вещества (гемицеллюлозы) разлагаются до сахаров. Гидролизат представлял собой янтарно-желтую прозрачную жидкость в случае ПОО и коричневую мутноватую жидкость в случае мискантуса. Концентрация РВ в кислотном гидролизате ПОО составила 22,2 г/л и возможность переработки такого гидролиза-та в продукты микробиологического синтеза может представлять практический интерес. Концентрация РВ в кислотном гидролизате мискантуса составила 9,4 г/л, что свидетельствует о большей прочности полисахаридно-лигнинного каркаса мискантуса и устойчивости его к кислотному гидролизу.
В примере 2 оценивалась биологическая доброкачественность ферментативных гидро-лизатов, полученных из технических целлюлоз ПОО и мискантуса на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН азотнокислым способом, который заключается в варке сырья в разбавленном растворе азотной кислоты при атмосферном давлении, с последующей обработкой разбавленным раствором гидроксида натрия [2]. Ферментативный гидролиз влажных ТЦ проводился в ферментаторе общим объемом 11 л [16] мультиэнзимной композицией, состоящей из доступных на рынке ферментных препаратов: «БрюзаймБСХ», «Целлолюкс-А» и «Рапидаза ЦР» в количестве 0,04 г/г субстрата. Температура ферментативного гидролиза составляла 50 оС, продолжительность - 72 ч. Методика ферментативного гидролиза подробно описана в работе [15]. Особенностью описываемого процесса являлось проведение
его не в ацетатном буфере, а в водной среде при поддержании активной кислотности на уровне 4,7-4,9 ед. рН с помощью ортофосфор-ной кислоты. Ферментативный гидролизат представлял собой соломенно-желтую прозрачную жидкость в случае ПОО и коричнево-желтую, мутноватую жидкость с характерным кисловатым запахом в случае мискантуса. Характеристики используемых ферментативных гидролизатов отражены в табл. 2. Следует отметить, что получены глюкозные гидролизаты, вклад пентоз незначителен - 1,6-1,7 г/л.
Таблица 2 Характеристики ферментативных гидролизатов, полученных из технических целлюлоз плодовых оболочек овса (ПОО) и мискантуса
Общая численность дрожжей определялась с помощью камеры Горяева, морфофи-зиологические характеристики дрожжей - согласно принятым в спиртовой отрасли методикам [8]. Концентрация редуцирующих веществ (РВ) определялась спектрофотометрически с помощью реактива 3,5-динитросалициловой кислоты (спектрофотометр «иМКО» и^2804 США) в пересчете на глюкозу, активная кислотность измерялась потенциометрически. Объемная доля этанола (крепость бражек) определялась ареометром для спирта в дистилляте, полученном после предварительной перегонки спирта из бражки, согласно ГОСТ 5113598-2003. Изменение физико-химических и микробиологических показателей среды контролировались ежесуточно.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изучение морфофизиологической активности штамма. Изменения функционального состояния дрожжей 5. сегеу^'ае Y-1693 в процессе брожения отражены на рис. 1.
Общее количество дрожжей, накапливаемое в процессе брожения, сильно зависело от состава среды. На эталонной среде солодового сусла максимальная численность биомассы достигалась через 4 сут брожения и составляла 380 млн КОЕ/мл, после чего культура выходила на стационарную фазу развития. На голодной синтетической среде максимальная численность биомассы устанавливалась уже через
1 сут культивирования и составляла около 15 млн КОЕ/мл. Низкая численность биомассы объясняется отсутствием питательных веществ (сахаров) в среде.
Функциональное состояние 5. сегеу^'ае Y-1693 на солодовом сусле соответствовало литературным данным: для зрелых производственных дрожжей в спиртовой промышленности количество дрожжевых клеток должно быть не менее 80-100 млн КОЕ/мл, доля почкующихся клеток - 10-15%, упитанных - не менее 70%, мертвых - не более 3-4% [8, 6]. В опыте доля почкующихся клеток была максимальна на 1-2 сут культивирования и составляла 15%, затем постепенно снижалась; доля упитанных
- максимальна в первые двое суток брожения и составляла более 60%, затем резко снижалась и через 5 сут была равна нулю. В начале культивирования в культуре не было мертвых клеток, они появились через 3 сут брожения; через 6 сут их доля максимальна - 43-45%, снижение количества мертвых клеток через 10 сут брожения до 10% объясняется автолизом культуры и использованием питательных веществ мертвых клеток живыми.
На голодной синтетической среде 5. сеге-у'мав Y-1693 продемонстрировали исключительную жизнестойкость. Количество почкующихся клеток на синтетической среде было выше, чем на эталонной (через 3 сут брожения
- 19%), количество упитанных - убывало по кривой гиперболического характера, мертвых клеток в среде не зарегистрировано. Видимо, медленно протекали автолитические процессы, при этом ресурсы умирающих клеток сразу же потреблялись живыми. Можно сделать предположение, что продукты метаболизма дрожжей на полноценной питательной среде оказывают более сильное ингибирующее действие на клетки, чем отсутствие питательных веществ на голодной.
Это предположение согласуется с морфологическим состоянием клеток. На рис. 2 приведена морфология клеток 5. сеге^^'ае Y-1693 после 2 сут культивирования на эталонной питательной среде. Клетки - овальные или круглые, размером 8,5-7,5 х 7,5-7,0 мкм, крупные
- до 8,5 х 10 мкм; клетки имели четко очерченную оболочку, видны почкующиеся клетки; цитоплазма неоднородная, некоторые клетки содержат вакуоли, при окрашивании хорошо видны гранулы гликогена, занимающие от 1/3 до 2/3 клетки.
Через 10 сут брожения морфология клеток изменялась (рис. 3, а). При культивировании на солодовом сусле средний размер клеток уменьшался до 7,5 х 7,5; 5 х 7,5 мкм, клетки съеживались, их клеточные оболочки становились
Субстрат ТЦ ПОО ТЦ мискантуса
Концентрация РВ, г/л 41,7 56,7
Концентрация пентоз, г/л 1,6 1,7
Активная кислотность, ед. рН 4,7-4,8 4,7-4,8
к с о d
Продолжительность брожения, сутки
солодовое сусло -синтетическая среда без глюкозы
Рис. 1. Динамика функционального состояния дрожжей S. сerevisiae Y-1693 в процессе брожения на солодовом сусле и на синтетической голодной среде: а - общее количество дрожжей; б - доля почкующихся; в - доля упитанных; г - доля мертвых клеток
б
а
в
г
Рис. 2. Морфология клеток S. сerevisiae Y-1693 через 2 суток брожения на солодовом сусле (х1000)
толстыми и неоднородными, цитоплазма -зернистой, часто с крупными вакуолями; в поле зрения были видны «обломки» клеточных стенок автолизированных дрожжей.
При культивировании на голодной синтетической среде S. cerevisiae Y-1693 через сутки брожения клетки стали овальными, через 3 сут вытянутых клеток было около 50%. На рис. 3, б представлена морфология клеток через 10 сут брожения. Клетки сильно вытянутые, оболочки толстые, переменной толщины, у некоторых клеток оболочки разрушены. Размеры клеток 10х5 мкм, иногда до 12,5х5 мкм. Цитоплазма зернистая, комковатая, в поле зрения видны «обломки» клеточных стенок автолизированных клеток. Тем не менее, некоторые клетки почковались.
Поведение штамма на голодной синтетической среде свидетельствует о том, что штамм обладает высокой адаптивностью. В силу устойчивости к неблагоприятным факторам среды, таким как отсутствие питательных веществ, наличие продуктов метаболизма, как правило, являющихся ингибиторами для нормального функционирования ферментных систем микроорганизмов, наличие вредных примесей (что регламентировано паспортом) -штамм Y-1693 может использоваться в качестве тестового в определении биологической доброкачественности сред.
Морфофизиологические характеристики штамма можно использовать для оценки доброкачественности гидролизных сред. При отсутствии в гидролизатах вредных веществ функциональное состояние дрожжей должно быть сопоставимо с их состоянием на голодной синтетической среде без глюкозы. Если в среде достаточное количество сбраживаемых сахаров, то функциональное состояние дрожжей будет улучшаться и начнет синтезироваться биоэтанол; если в среде присутствуют вредные вещества, то функциональное состояние клеток будет ухудшаться и, соответственно, выход биоэтанола будет снижаться.
На эталонной среде неохмеленного солодового сусла получен биоэтанол с выходом 90% от концентрации РВ. На голодной синтетической среде биоэтанол не синтезировался.
Предлагаемая методика определения биологической доброкачественности гидролизата, полученного из целлюлозосодержащего сырья, включает следующие этапы:
1) штамм Y-1693 культивируется на эталонной среде неохмеленного солодового сусла при температуре 28 °C в течение 24-36 ч. Дрожжи не должны быть ослаблены, поэтому культура, полученная на солодовом сусле в экспоненциальной фазе развития, как инокулят
вносится в испытуемую среду. Поскольку в испытуемой среде могут быть вредные примеси, то доза инокулята должна быть высокой - 1015%, чтобы обеспечивать на момент внесения в концентрацию клеток в опытной среде 1012 млн КОЕ/мл;
2) гидролизат целлюлозосодержащего сырья подвергается пастеризации или стерилизации для исключения влияния посторонних микроорганизмов на результаты теста;
3) проводится спиртовое сбраживание испытуемой среды в анаэробных условиях при температуре 28 °С в течение 3 сут;
4) регистрируются морфофизиологические показатели У-1693 в процессе брожения и сравниваются с этими характеристиками при культивировании штамма на эталонной среде не-охмеленного солодового сусла (если среда близка к полноценной) или на синтетической голодной среде (если среда бедная);
5) для определения эффективности брожения измеряется фактическая крепость бражки и рассчитывается практический выход биоэтанола от концентрации редуцирующих сахаров по стехиометрическому уравнению брожения.
Таким образом, для оценки доброкачественности применяются два критерия: морфо-физиологическое состояние культуры на исследуемой среде и выход биоэтанола. Методика дает объективные результаты и на бедных и на полноценных средах и может использоваться в качестве тестовой для определения пригодности гидролизата для биосинтеза биоэтанола. Ниже приводятся примеры.
Пример 1. Оценка биологической доброкачественности кислотных гидролиза-тов плодовых оболочек овса (ПОО) и мискантуса. Изменения функционального состояния дрожжей 5. сеге^^'ае У-1693 в процессе брожения на средах кислотных гидролизатов ПОО и мискантуса и на синтетической голодной среде приведены на рис. 4.
Среды кислотных гидролизатов - бедные среды, поэтому функциональное состояние штамма Y-1693 на этих средах в процессе спиртового брожения уместно сравнивать с его функциональным состоянием на синтетической голодной среде. По общей численности дрожжей кислотный гидролизат ПОО сопоставим с синтетической голодной средой (с небольшим преимуществом кислотного гидроли-зата ПОО), что указывает на отсутствие и питательных веществ (видимо, РВ гидролизата представлены пентозами) и технологически вредных примесей (так как численность не снижалась). Данная среда не являлась биологически доброкачественной, так как численность дрожжей в 18 раз ниже, чем на среде
а б
Рис. 3. Морфология клеток S. сerevisiae Y-1693 через 10 суток брожения: а - на солодовом сусле; б - на голодной синтетической среде; х 1000
б
Продолжительностьброжения, сутки
Ш синтетическая голодная среда
ф кислотный гидролизат мискантуса
Рис. 4. Динамика функционального состояния дрожжей S. сerevisiae Y-1693 в процессе брожения на средах кислотных гидролизатов ПОО и мискантуса и на синтетической голодной среде: а - общее количество дрожжей; б - доля почкующихся; в - доля упитанных; г - доля мертвых клеток
а
в
г
солодового сусла (через 3 сут брожения 17,4 млн КОЕ/мл против 312 млн КОЕ/мл); на отсутствие питательных веществ указывала и доля упитанных клеток, по которой среда кислотного гидролизата ПОО также сопоставима с синтетической голодной средой. По доле почкующихся клеток опытная среда уступала синтетической голодной среде (через 3 сут брожения 6,3% против 19%), высокая численность мертвых клеток (через 3 сут брожения - 30%) свидетельствует о наличии ингибиторов метаболизма дрожжей. Таким образом, определив только общее количество дрожжевых клеток, нельзя сделать вывод о наличии технологически вредных веществ в среде, для такого заключения необходимо рассматривать все показатели функционального состояния клеток (доля почкующихся, упитанных и мертвых клеток). Внешний вид клеток на среде кислотного гидролизата ПОО через 3 сут спиртового брожения показал уменьшение клеток в размере до 7,5х7,5; 5х7,5 мкм, их съеживание, оболочка клеток была толстая, цитоплазма сильно зернистая. Концентрация редуцирующих веществ через 3 сут брожения составила 21,9 г/л, биоэтанола в бражке не обнаружено. Это свидетельствует о том, что редуцирующие вещества гидролизата представлены пентозами, так как известно, что сахаромицеты не утилизируют пентозы [11, 13]. Таким образом, заключение о биологической недоброкачественности среды (отсутствие питательных веществ при наличии ингибиторов брожения), сделанное по функциональному состоянию клеток, подтвердилось аналитическими методами.
Кислотный гидролизат мискантуса - еще более неблагоприятная среда, уже через 1 сут спиртового брожения численность дрожжей начинала снижаться, а через 3 сут становилась в 2 раза ниже изначальной (3,5 млн КОЕ/мл против 7,3 млн КОЕ/мл). Следовательно, среда не только не содержала питательных веществ, но и напротив, была насыщена технологически вредными примесями, ингибирующими рост дрожжей и работу их зимазного комплекса. Функциональное состояние клеток подтверждало данный вывод: в процессе брожения клетки становились все мельче, окрашивались в желтый цвет (поэтому определить упитанность было нельзя). В целом, чем старше клетка, тем интенсивнее ее окраска. В поле зрения кроме клеток отчетливо видны взвеси в виде коротких ниток коричневого цвета. Доля мертвых клеток возрастала экспоненциально (до 50%), а доля почкующихся клеток снижалась до 1%. Концентрация редуцирующих веществ через 3 сут брожения составляла 9,2 г/л, биоэтанола в бражке не обнаружено. Следовательно,
заключение о биологической недоброкачественности среды (отсутствие питательных веществ при наличии ингибиторов брожения), сделанное по функциональному состоянию клеток, подтвердилось аналитическими методами.
Пример 2. Оценка биологической доброкачественности ферментативных гид-ролизатов, полученных из технических целлюлоз плодовых оболочек овса (ТЦ ПОО) и мискантуса.
Изменения функционального состояния дрожжей S. cerevisiae Y-1693 в процессе брожения на средах ферментативных гидролиза-тов, полученных из технических целлюлоз ПОО и мискантуса и на среде солодового сусла, приведены в табл.3.
На среде ферментативного гидролизата из ТЦ ПОО размеры клеток дрожжей варьировали от 10,0х7,5 мкм до 5,0х5,0 мкм, т.е. в целом соответствовали норме; по общей численности дрожжей, доле почкующихся и мертвых клеток функциональное состояние дрожжей соответствовало требованиям, регламентируемым в отрасли [8]. Несоответствие отмечалось только по доле упитанных клеток (ниже нормы в 14 раз), что связано с низкой концентрацией редуцирующих веществ в среде в начальный момент времени и с нехваткой азот-но-фосфорного питания. В конце брожения концентрация редуцирующих веществ составляла 10,0 г/л, из них концентрация пентоз -1,6 г/л, т.е. отброд был практически полным.
На среде ферментативного гидролизата из ТЦ мискантуса размеры клеток дрожжей варьировались от 7,5х5,0 мкм до 5,0х5,0 мкм, т.е. были немного мельче нормальных; по общей численности дрожжей и доле мертвых клеток функциональное состояние дрожжей соответствовало требованиям, регламентируемым в отрасли. По доле почкующихся клеток опытные показатели в 1,6-2 раза ниже нормы, а по доле упитанных клеток - в 46 раз ниже нормы, что также связано и с низкой концентрацией редуцирующих веществ в среде в начальный момент времени и с нехваткой азотно-фосфорного питания. Кроме того, можно предположить наличие каких-то ингибиторов в среде ферментативного гидролизата из ТЦ мискантуса, снижающих их генеративную активность. В конце брожения концентрация редуцирующих веществ составила 5,5 г/л, из них концентрация пентоз - 1,7 г/л, т.е. отброд был полным.
Наряду с первым критерием морфофизио-логического состояния культуры на исследуемой среде, вторым критерием оценки доброкачественности сред является выход биоэтанола.
Таблица 3
Изменения функционального состояния дрожжей S. сerevisiae Y-1693 в процессе брожения на средах ферментативных гидролизатов, полученных из технических целлюлоз ПОО и мискантуса и на среде солодового сусла
Продолжительность брожения, сут Общая численность дрожжей, млн КОЕ/мл Доля почкующихся клеток, % Доля упитанных клеток, % Доля мертвых клеток, %
Солодовое сусло
0 10,1 15,0 55,0 1,2
1 153,8 14,5 65,1 0,0
2 231,2 11,3 61,6 0,0
3 312,4 9,3 15,2 2,8
Ферментативный гидролизат из ТЦ ПОО
0 13,2 10,1 70,1 1,7
1 23,0 24,2 10,2 1,1
2 81,0 19,8 5,1 1,3
3 38,0 18,5 5,0 1,2
Ферментативный гидролизат из ТЦ мискантуса
0 12,9 18,5 75,0 1,8
1 28,5 6,5 10,1 0,0
2 79,3 6,0 1,5 2,1
3 30,1 5,5 1,2 3,2
Известно, что при действии ингибиторов сначала подавляется генеративная активность дрожжей, их зимазная активность при этом может оставаться на высоком уровне [10].
На среде ферментативного гидролизата из ТЦ ПОО получена бражка с концентрацией биоэтанола 2,4 об.%, что по стехиометриче-скому уравнению брожения соответствует выходу 88,9% от концентрации редуцирующих веществ. На гидролизных заводах выход спирта составляет 55-58 л из 100 кг сбраживаемых сахаров [11] или 85-90% от теоретического. Таким образом, для ферментативного гидро-лизата из ТЦ ПОО получен выход, соответствующий промышленному. Можно сделать вывод, что среда является биологически доброкачественной и не требует технологических обработок и корректировки состава при спиртовом брожении.
На среде ферментативного гидролизата из ТЦ мискантуса получена бражка с концентрацией биоэтанола 2,3 об.%, что соответствует выходу 62,3%. Можно предположить, что в среде находятся ингибиторы спиртового брожения, которые могут быть удалены путем технологических обработок (удалением летучих примесей, обработкой активированным углем и т.д.). Можно рекомендовать внесение витаминных добавок и/или азотно-фосфорных удобрений для корректировки состава среды [1, 10, 13].
Хорошее морфофизиологическое состояние штамма Y-1693 и приемлемый выход биоэтанола на средах ферментативных гидроли-
затов свидетельствуют о перспективности метода ферментативного гидролиза для получения биологически доброкачественных глюкоз-ных сред, которые потенциально могут применяться не только для получения биоэтанола, но и для промышленных биосинтезов широкого спектра веществ, осуществляемых с помощью более взыскательных, чем сахаромицеты, продуцентов.
ВЫВОДЫ
1. Исследованы физиологическая активность и способность штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1693 к синтезу биоэтанола на эталонной среде неохмеленного солодового сусла и на синтетической голодной среде. Показана высокая адаптивная способность штамма, позволяющая использовать его в качестве тестовой культуры.
2. Разработана методика определения биологической доброкачественности сред с помощью штамма Y-1693.
3. Показано, что методика дает объективные результаты и может использоваться в качестве тестовой для определения пригодности гидролизата для биосинтеза биоэтанола.
Установлено, что ферментативный гидролиз технических целлюлоз плодовых оболочек овса и мискантуса позволяет получить биологически доброкачественные глюкозные среды, которые потенциально могут применяться не только для получения биоэтанола, но и для получения широкого спектра веществ микробиологического синтеза.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Агеев Л.М., Корольков С.И. Химико-тех- нический контроль и учет гидролизного и суль-
фитно-спиртового производства. М.-Л.: ГОСЛЕ-СБУМИЗДАТ, 1953. 403 с.
2. Будаева В.В., Гисматулина Ю.А., Золотухин В.Н., Сакович Г.В., Вепрев С.Г., Шумный В.К. Показатели качества целлюлозы, полученной азотнокислым способом в лабораторных и опытно-промышленных условиях из мискантуса // Ползуновский вестник. 2013. № 3. С. 162-167.
3. Будаева В.В., Митрофанов Р.Ю., Золотухин В.Н. Исследование ферментативного гидролиза отходов переработки злаков // Ползунов-ский вестник. 2008. № 3. С. 322-327.
4. Гладышева Е.К. Обоснование выбора питательной среды для синтеза бактериальной целлюлозы // Вестник алтайской науки. 2014. № 1 (19). С. 307-310.
5. Денисова М.Н., Будаева В.В. Характеристики целлюлозы, полученной гидротропным способом на универсальном термобарическом устройстве // Химия в интересах устойчивого развития. 2013. Т. 21, № 5. С. 545-549.
6. Лихтенберг Л.А., Двадцатова Е.А., Чередниченко В.С. Атлас производственных дрожжей Saccharomycescerevisiae расы XII (для работников спиртовых заводов, перерабатывающих зерно). М.: Пищевая промышленность, 1999. 24 с.
7. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановс-кая Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы. Белок и другие ценные продукты. Минск: Наука и техника,1988. 216 с.
8. Римарева Л.В., Воронцова Н.Н. Микробиологический контроль спиртового и ферментного производств. М.: Россельхозакадемия,
2005. 200 с.
9. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во Московского университета, 1995. 224 с.
10. Технология спирта / В.Л. Яровенко, В.А. Маринченко, В.А. Смирнов и др.; под ред. проф. В.Л. Яровенко. М.: Колос, 1999.464 с.
11. Холькин Ю.И. Технология гидролизных производств: учебник для вузов. М.: Лесная промышленность, 1989. 496 с.
12. Цуканов С.Н., Будаева В.В. Гидротер-мобарический способ получения целлюлозы из отходов злаков // Ползуновский вестник. 2011. № 4-1. С. 236-239.
13. Шарков В.И., Сапотницкий С.А., Дмитриева О.А. Технология гидролизных производств. М.: Лесная промышленность, 1973. 408 с.
14. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lignocellulosic chemistry // Bioenerg. Res. 2012. № 5. P. 1043-1066. Cited 65 times. doi: 10.-1007/s12155-012-9208-0.
15. Makarova E.I. Results of Miscanthus cellulose fermentation in the acetate buffer and in water medium // Chemistry for Sustainable Development. 2013. № 2. Р. 209-214.
16. Pavlov I. N. A Setup for Studying the Bio-catalytic Conversion of Products from the Processing of Nonwood Raw Materials // Catalysis in Industry. 2014. Vol. 6, No. 4. Р. 350-360. doi: 10.1134/S207005041404014X.
17. Somerville C. Feedstocks for lignocellulosic biofuels // Science. 2010. № 329.Р. 790-792. Cited 431 times. doi: 10.1126/science.1189268.
REFERENCES
1. Ageev L.M., Korol'kov S.I. Khimiko-tekhnicheskii kontrol' i uchet gidroliznogo i sul'fitno-spirtovogo proizvodstva [Chemical technical control and accounting of wood-hydrolysis and sulfite alcohol production]. Moscow, Leningrad, Gosles-bumizdat Publ., 1953, 403 p.
2. Budaeva V.V., Gismatulina Yu.A., Zolo-tukhin V.N., Sakovich G.V., Veprev S.G., Shumnyi V.K. Pokazateli kachestva tsellyulozy, poluchennoi azotnokislym sposobom v laboratornykh i opytno-promyshlennykhusloviyakh iz miskantusa [Quality indicators of pulp obtained by dilute nitric-acid method from Miscanthus under laboratory and pilot conditions]. Polzunovskii vestnik - Polzunov Bulletin, 2013, no. 3, pp.162-167.
3. Budaeva V.V., Mitrofanov R.Yu., Zolo-tukhin V.N. Issledovanie fermentativnogo gidroliza otkhodov pererabotki zlakov [Study of enzymatic hydrolysis of crop residues]. Polzunovskii vestnik -Polzunov Bulletin, 2008, no. 3, pp. 322-327.
4. Gladysheva E.K. Obosnovanie vybora pi-tatel'noi sredy dlya sinteza bakterial'noi tsellyulozy
[Justification of nutrient broth choice for bacterial cellulose synthesis]. Vestnik altaiskoi nauki - Bulletin of Altai Science, 2014, vol. 19, no. 1, pp. 307310.
5. Denisova M.N., Budaeva V.V. Kharakteris-tiki tsellyulozy, poluchennoi gidrotropnym sposobom na universal'nom termobaricheskom ustroi-stve [Characteristics of pulp obtained by hydro-tropic method in thermobaric apparatus]. Khimiya v interesakh ustoichivogo razvitiya - Chemistry for Sustainable Development, 2013, vol. 21, no. 5, pp. 545-549.
6. Likhtenberg L.A., Dvadtsatova E.A., Cherednichenko V.S. Atlas proizvodstvennykhd rozhzhei Saccharomyces serevisiae rasy XII (dlya rabotnikov spirtovykh zavodov, pererabatyvayush-chikh zerno) [Atlas of industrial Saccharomyces cerevisiae yeast of the XII race (for employers at alcohol plants that process grain)]. Moscow, Pishchevayapromyshlennost' Publ., 1999, 24 p.
7. Lobanok A.G., Babitskaya V.G., Bog-danovskaya Zh.N. Mikrobnyi sintez na osnove tsel-
lyulozy. Belok i drugie tsennye produkty [Microbial synthesis based on cellulose. Protein and other valuable products]. Minsk, Nauka i tekhnika Publ., 1988, 216 p.
8. Rimareva L.V., Vorontsova N.N. Mikrobio-logicheskii kontrol' spirtovogo I fermentnogo pro-izvodstv [Microbiological control of alcohol and enzyme productions]. Moscow, Rossel'khoz akad-emiya Publ., 2005, 200 p.
9. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Biokonversiya lignotsellyuloznykh materialov [Bioconversion of lignocellulosic biomass]. Moscow, Izd-vo Moskovskogo universiteta Publ.,1995, 224 p.
10. Yarovenko V.L., Marinchenko V.A. Smirnov V.A. [et al.] Tekhnologiya spirta [Alcohol technology]. Moscow, Kolos Publ., 1999, 464 p.
11. Khol'kin Yu.I. Tekhnologiya gidroliznykh proizvodstv [Technology of wood-hydrolysis productions]. Moscow, Lesnaya promyshlennost' Publ., 1989, 496 p.
12. Tsukanov S.N., Budaeva V.V. Gidroter-mobaricheskii sposob polucheniya tsellyulozy i zot-
khodov zlakov [Hydrothermobaric process for pulp from crop residues]. Polzunovskii vestnik. -Polzunov Bulletin, 2011, no. 4-1, pp. 236-239.
13. Sharkov V.I., Sapotnitskii S.A., Dmitrieva O.A. Tekhnologiya gidroliznykh proizvodstv [Technology of wood-hydrolysis productions]. Moscow, Lesnaya promyshlennost' Publ., 1973, 408 p.
14. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lignocellulosic chemistry (2012) Bioenergy Research, no. 5, pp 1043-1066. Cited 65 times. doi: 10.1007/s12155-012-9208-0
15. Makarova E.I. Results of Miscanthus cellulose fermentation in the acetate buffer and in water medium. Chemistry for Sustainable Development, 2013, no. 2, pp. 209-214.
16. Pavlov I. N. A Setup for Studying the Bio-catalytic Conversion of Products from the Processing of Nonwood Raw Materials (2014) Catalysis in Industry, vol. 6, no. 4, pp 350-360. doi: 10.1134/S207005041404014X.
17. Somerville C. Feedstocks for lignocellulosic biofuels. Science, 2010, no. 329, pp. 790-792. Cited 431 times. doi: 10.1126/science.1189268.
Статья поступила в редакцию 09.12.2015 г.
УДК 504.064. 3:573.6. 504.064.2:574.21(282.256.341)
ПОИСК ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ (РЕСТРИКТАЗ) СРЕДИ МИКРООРГАНИЗМОВ оз. БАЙКАЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЭКОЛОГИЧЕСКИХ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
1 9 9 ^
© Е.В. Верхозина1, В.А. Верхозина2, В.В. Верхотуров2, Е.В. Анганова3'4, Е.Д. Савилов3'4
1
Институт земной коры СО РАН,
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова 128, [email protected]
2 Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова 83, [email protected]
3 Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, 664049, г. Иркутск, м/р Юбилейный,100
4 Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека, 664003, Россия, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3, [email protected]
Работа посвящена анализу многолетних исследований по поиску штаммов микроорганизмов-продуцентов ферментов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) (рестриктаз), выделенных из экосистемы оз. Байкал. Полученные результаты свидетельствуют, что бактерии-продуценты ферментов ЭР, известных ранее лишь теоретически, обнаруживаются в штаммах бактерий, выделенных из проб воды, взятых в антропогенных районах. В штаммах бактерий, выделенных из чистых участков озера, все обнаруженные нами рестриктазы являются хорошо известными. Акцентировано внимание на изучении спектра ферментов рестрикции при достаточной продуктивности и доступности для
