CC BY
94
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY Оригинальная статья / Original article УДК 612.015.161
DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-2-51 -56
ХИМИКО-ЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ КОНВЕРСИЯ В БИОЭТАНОЛ ОТХОДОВ ЗЛАКОВЫХ КУЛЬТУР
© О.В. Байбакова
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН
Целлюлозосодержащая биомасса является перспективным альтернативным сырьем для получения биоэтанола. Данная работа посвящена исследованию процесса получения биоэтанола из отходов сельскохозяйственной переработки - плодовых оболочек овса. Проведена химическая предварительная обработка плодовых оболочек овса с помощью разбавленных растворов кислот и щелочей, получены четыре вида субстратов, характеризующиеся высоким выходом редуцирующих веществ от массы субстрата. Исследован ферментативный гидролиз в водной среде с использованием про-мышленно доступных биокатализаторов. Получен биоэтанол с высоким выходом с помощью штамма дрожжей Saccharomyces св^Шае ВКПМ Y-1693 на средах ферментативных водных гидролиза-тов из плодовых оболочек овса. Изучена зависимость выхода биоэтанола от способа его химической предварительной обработки. Проведен качественный и количественный анализ полученных образцов биоэтанола.
Ключевые слова: плодовые оболочки овса, предварительная химическая обработка сырья, субстрат, ферментативный гидролиз, спиртовое брожение.
Формат цитирования: Байбакова О.В. Химико-энзиматическая конверсия в биоэтанол отходов злаковых культур // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2016. Т. 6, N 2. С. 51-56. DOI: 10.21285/22272925-2016-6-2-51-56
CHEMICOENZYMATIC CONVERSION OF CEREAL CROP RESIDUES INTO BIOETHANOL
O.V. Baibakova
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies SB RAS
Cellulosic biomass is a promising alternative source of energy to produce bioethanol. This work investigates a process for bioethanol synthesized from agricultural residues, oat hulls. Chemical pretreatment of oat hulls was performed with eco-benign reagents to obtain four substrates that had a high yield of reducing sugars of the substrate weight. Enzymatic hydrolysis in an aqueous medium was studied with the use of commercially available biocatalysts. Bioethanol was synthesized in a high yield on aqueous enzymatic hydrolyzates from oat hulls by employing the yeast strain Saccharomyces сerevisiae Y-1693. The bioethanol yield as a function of its chemical pretreatment was studied. The resultant bioethanol samples were qualitatively and quantitatively analyzed.
Keywords: oat hulls, substrates, enzymatic hydrolysis, strain, alcoholic fermentation
For citation: Baibakova O.V. Chemicoenzymatic conversion of cereal cop residues into bioethanol. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2016, vol. 6, no 2, pp. 51-56. DOI: 10.21285/2227-2925-2016-6-2-51-56 (in Russian)
ВВЕДЕНИЕ
Целлюлозосодержащее сырье привлекает все большее внимание исследователей. Это связано и с бесконечностью объемов данного ресурса, и с доступностью во всех регионах мира, и с универсальностью использования
этого вида сырья для превращения в различные продукты микробиологической трансформации [10, 11]. Получение биоэтанола из быст-ровозобновляемого целлюлозосодержащего непищевого сырья является не решенной, но активно исследуемой во всем мире фундамен-
тальной проблемой. Россия является богатейшей страной древесного и недревесного сырья, особенно быстровозобновляемого, к которому относятся отходы сельского хозяйства. Российскими учеными в 1975-1985 гг. был исследован ферментативный гидролиз целлюлозных субстратов [5], тем не менее, в России отсутствовали заводы по переработке быстровозобновляемого недревесного сырья. Переход на данное сырье в качестве субстрата сопровождается сложностями сохранения чистоты микробиологического процесса и требует особого технологического контроля [8]. Поэтому необходимо исследовать способ получения биоэтанола из общедоступных отходов злаковых культур, к которым относятся, например, плодовые оболочки овса (ПОО). Они составляют 28% от массы зерна, поэтому для перерабатывающих заводов со средней производительностью 1400 т овса в месяц отсутствие схемы их утилизации является нерешенной проблемой. Высокое содержание целлюлозы (до 35%) и размещение ПОО непосредственно в промышленных районах, позволяет позиционировать их как потенциальный источник недревесной целлюлозы. Ферментативный гидролиз нативного целлюлозосодержащего сырья невозможен, поскольку матрица растения состоит из нескольких полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина, которые в совокупности образуют композиционный материал, более прочный и устойчивый к действию физических и химических факторов, чем отдельные компоненты. Для того чтобы ферментные комплексы могли расщепить индивидуальные полимеры, необходимо разрушить композитную матрицу, для чего нативное сырье надо подвергнуть химической или физико-химической обработке [9]. Способ предварительной обработки сырья определяет не только химический состав получаемого субстрата, но и его реакционную способность к ферментативному гидролизу, и химический состав получаемого ферментативного гидролизата, а значит и выход биоэтанола. Целью данной работы являлось исследование зависимости выхода биоэтанола на гидролизных средах от способа химической предварительной обработки плодовых оболочек овса.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Субстраты для ферментативного гидролиза получены на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН согласно действующей нормативной документации. В качестве субстратов для ферментативного гидролиза использовалась техническая целлюлоза (ТЦ) из плодовых оболочек овса, полученная двумя способами на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН химической предобработкой сырья в две стадии:
- азотнокислый способ (АС) включает в себя обработку на первой стадии разбавленным раствором азотной кислоты, а на второй стадии разбавленным раствором гидроксида натрия при температуре 90-96 оС;
- при комбинированном способе (КС) получения использовались те же реактивы, но обработка ими проводилась в обратном порядке при температуре 90-96 оС.
Для упрощения стадий химической предварительной обработки сырья была проведена обработка плодовых оболочек овса в одну стадию. При обработке разбавленным раствором азотной кислоты при температуре 90-96 оС был получен продукт, названный лигноцеллюлозным субстратом (ЛЦС), так как обработка в одну стадию позволяет удалить из сырья значительную часть гемицеллюлоз, но не удаляет полностью лигнин. Обработка в одну стадию разбавленным раствором гидроксида натрия при температуре 90-96 оС позволяет провести делигнификацию сырья, но не удаляет гемицеллюлозы, а продукт имеет волокнистую рыхлую структуру, поэтому полученный субстрат был назван волокнистым продуктом (ВП).
В качестве биокатализаторов для ферментативного гидролиза были использованы препараты «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США) и «ЦеллоЛюкс-А» (производитель ООО ПО «Сиб-биофарм», Россия, г. Бердск), вносимые каждый в количестве 0,04 г фермента /г субстрата.
Ферментативный гидролиз проводили в колбах Эрленмейера объемом 1 л на шейкер-инкубаторе «UNIMAX 10101» в водной среде при температуре (45 ± 2) оС в течение 72 ч с концентрацией субстрата 60 г/л. В качестве продуцента использовали штамм Saccharomy-ces cerevisiae Y-1693 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (г. Москва). Инокулят дрожжей в экспоненциальной фазе роста вносили в ферментативные водные гид-ролизаты в количестве 10% к объему среды. Брожение осуществлялось в анаэробных условиях при температуре 28 °С, активной кислотности 4,5 ед. рН, в течение 3 сут. Определение основных характеристик субстратов (массовой доли целлюлозы по Кюршнеру, пентозанов, кис-лотонерастворимого лигнина, золы) проводили по стандартным методикам [4]. Концентрацию редуцирующих веществ определяли спектрофо-тометрическим методом на «UNICO UV-2804» (США) с использованием динитросалицилового реактива [3]. Выход редуцирующих веществ (отношение массы редуцирующих веществ к массе субстрата) рассчитан с учетом коэффициента, обусловленного присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате гидро-
лиза. Объемную долю спирта в бражках определяли ареометром в дистилляте, полученном перегонкой спирта из бражки согласно [1]. Биоэтанол из бражки сконцентрирован методом простой перегонки и дополнительной очистке не подвергался. Анализ биоэтанола выполнен методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) [2] на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором «Кристалл-2000М» фирмы «СКБ Хроматэк».
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Характеристики сырья и полученных субстратов представлены в табл. 1 в пересчете на абсолютно сухое сырье.
Необходимо учитывать, что проведение ферментативного гидролиза лигноцеллюлозно-го субстрата и волокнистого продукта плодовых оболочек овса представляется более сложной задачей, чем ферментативный гидролиз целлюлозы, так как одностадийная обработка позволяет лишь частично освободить субстрат от негидролизуемых целлюлазами примесей. Полученные результаты показали, что через 72 ч ферментативного гидролиза самая низкая концентрация РВ наблюдается для нативных ПОО - 4,5 г/л.
Субстраты, полученные после предварительной химической обработки, независимо от способа ее проведения, обладают высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу: все значения концентрации редуцирующих веществ варьируют в пределах от
41,7 г/л до 48,8 г/л.
Это можно объяснить химическим составом полученных субстратов, так как сумма гидроли-зуемых компонентов примерно равна (табл. 1). При этом достаточно высокая массовая доля лигнина в лигноцеллюлозном субстрате (13,8%) не привела к ингибированию ферментативного гидролиза. Неполный ферментативный гидролиз субстратов, полученных из плодовых оболочек овса, может объясняться как несогласованностью действия индивидуальных ферментов, входящих в состав ферментной композиции (известно, что препараты, синтезированные продуцентами рода Trichoderma, обеднены целлобиазой) [5], так и явлениями субстратного ингибирования и адсорбции ферментов на субстрате. Учитывая низкую концентрацию РВ в ферментативном гидролизате из необработанных плодовых оболочек овса, было принято решение не проводить биосинтез биоэтанола на данной питательной среде.
Главным показателем эффективности брожения является выход этанола. Результаты спиртового брожения ферментативных водных гидролизатов субстратов, полученных после предварительной химической обработки в одну или две стадии из плодовых оболочек овса, представлены в табл. 2.
Зависимости концентрации редуцирующих веществ от способа предварительной химической обработки плодовых оболочек овса представлены на рисунке.
Полученные крепости бражек превышают
Таблица 1
Характеристики ПОО и полученных субстратов
Характеристики Массовая доля, %
ПОО ЛЦС ВП ТЦ (АС) ТЦ (КС)
Целлюлоза по Кюршнеру 44,7 79,2 - - -
а-Целлюлоза - - 89,0 94,2 88,4
Кислотонерастворимый лигнин 18,1 13,8 5,8 1,8 0,4
Пентозаны 34,8 9,2 4,5 3,2 11,0
Зольность 4,6 8,2 0,63 1,36 0,16
Сумма гидролизуемых компонентов, % 79,5 88,4 93,5 97,4 99,4
Таблица 2
Результаты спиртового брожения ферментативных водных гидролизатов субстратов из плодовых оболочек овса
Показатель ЛЦС ТЦ (АС) ВП ТЦ (КС)
Концентрация субстрата, г/л 60,0 60,0 60,0 60,0
Максимальная концентрация редуцирующих веществ 48,8 41,7 45,9 48,6
на стадии ферментативного гидролиза, г/л
Выход редуцирующих веществ, % от массы субстрата 73,2 62,5 67,6 75,0
Крепость бражки, об.% 2,6 2,4 2,1 2,4
Остаточная концентрация редуцирующих веществ в 9,3 10,0 8,9 14,8
бражке, г/л
Выход биоэтанола, 82,3 88,9 70,7 75,0
% от концентрации редуцирующих веществ
Выход биоэтанола, дал/т 22,6 12,2 17,2 18,3
3
2
>
о.
§5
> с
о? т" О. ь
о
к <и
4
та
о
60 50 40 30
¡0 20
10
0
0 12 24 36 48 60 72
Продолжительность ферментативного гидролиза, ч
Лигноцеллюлозный субстрат Волокнистый продукт
■ Техническая целлюлоза (азотнокислый способ) Ж Техническая целлюлоза (комбинированный способ)
■ Плодовые оболочки овса
Зависимость концентрации редуцирующих веществ в ферментативных гидролизатах от продолжительности процесса
крепости бражек, получаемых в результате сбраживания химических гидролизатов древесины: 2,1-2,6 об.% против 1,0-1,5 об.% [7]. На стадии спиртового брожения более высокие результаты по выходу биоэтанола получены для технической целлюлозы (азотнокислый способ) из плодовых оболочек овса и лигноцеллюлозного субстрата (88,9% и 82,3% соответственно).
Для волокнистого продукта и технической целлюлозы, полученной комбинированным способом, выход биоэтанола от концентрации редуцирующих веществ снижается и составляет 70,7% и 75,0% соответственно. Для технической целлюлозы, независимо от способа получения (химическая предварительная обработка в две стадии), крепости опытных бражек совпадают и составляют 2,4 об.%. При химической предварительной обработке в одну стадию крепость бражек для лигноцеллюлозного субстрата выше в 1,2 раза по сравнению с волокнистым продуктом (2,6 об.% против 2,1 об.%). Наибольший выход биоэтанола из 1 т плодовых оболочек овса достигнут при сбраживании ферментативного гид-
ролизата из лигноцеллюлозного субстрата, он составляет 22,6 дал/т. Полноту сбраживания характеризует остаточная концентрация редуцирующих веществ в бражках, для всех гидролизатов этот показатель невелик, что свидетельствует о биологической доброкачественности среды. Полученные опытные образцы биоэтанола были сконцентрированы методом простой перегонки, проанализированы методом газожидкостной хроматографии. Результаты анализа, выполненного методом ГЖХ, представлены в табл. 3.
При хроматографировании опытных образцов биоэтанола было выявлено, что последовательность выхода обнаруженных веществ соответствует действующей нормативной документации [2]. Присутствие в следовых количествах ацетона, 2-бутанола и кротональдегида идентифицирует этанол как непищевой [2]. Довольно высокая концентрация альдегидов в опытных образцах биоэтанола 1000-3800 мг/дм3 из плодовых оболочек овса связана с природой сырья и не обусловлена технологией получения, поскольку исключено накопление фракции альдегидов (фур-
Таблица 3
Содержание примесей в опытных образцах биоэтанола, полученных при одновременном и последовательном осахаривании-сбраживании
Показатель
ЛЦС
ТЦ (АС)
ВП
Массовая концентрация альдегидов, в пересчете на безводный спирт, мг/дм3 Массовая концентрация эфиров, в пересчете на безводный спирт, мг/дм3 Массовая концентрация сивушного масла, в пересчете на безводный спирт, мг/дм3 Массовая доля метанола в пересчете на безводный спирт, об. %
3800 90
1700 0,005
1000 150 2000 0,002
1170 220 2400 0,026
2500 150 2100 0,002
фурола и оксиметилфурфурола) в процессе ферментативного гидролиза, так как процесс проводился при температуре (45 ± 2) °С и рН 4,7.
Массовая концентрация сивушного масла в опытных образцах невысокая, что можно объяснить отсутствием белков и пептидов в опытных гидролизатах. Концентрация эфи-ров в опытных образцах низка: от 90 до 220 мг/дм3.
Поскольку очистка опытных образцов не производилась, то косвенно это может указывать на чистоту культуры дрожжей при брожении и благоприятные условия для биосинтеза этанола [8]. Также важно отметить, что во всех образцах объемная доля метанола крайне мала - 0,002-0,026 об.%. Поскольку опытные образцы биоэтанола не подвергались никакой очистке, приведенные в табл. 3 результаты анализа примесей спиртов, полученных из плодовых оболочек овса после предобработки в одну или две стадии, дают основания предположить, что после ректификации данных спиртов будет получен биоэтанол высокого качества.
ВЫВОДЫ
По результатам данной работы выявлено, что химическая предварительная обработка плодовых оболочек овса в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты позволяет получать субстрат с наибольшей реакционной способностью к ферментативному гидролизу. Показано, что ферментативным гидролизом в водной среде при использовании промышленно доступных ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Брю-займ BGX» можно получить доброкачественные гидролизаты для дальнейшего микробиологического синтеза в биоэтанол. Получены образцы биоэтанола с выходом от 70,7% до 88,9% от концентрации редуцирующих веществ. Выявлено, что опытные образцы биоэтанола характеризуются низким содержанием метанола -0,002-0,026 об.%. Выход биоэтанола в расчете на единицу сырья составил 22,6 дал/т для лигноцеллюлозного субстрата, для технической целлюлозы (азотнокислый способ) - 12,2 дал/т, для волокнистого продукта 17,2 дал/т и для технической целлюлозы (комбинированный способ) - 18,3 дал/т.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-38-00275.
1. ГОСТ Р 51135-2003. Изделия ликерово-дочные. Правила приемки и методы анализа. Технические требования. Введ. 1998-03-02. М.: ИУС, 2003. 116 с.
2. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографиче-ский метод определения подлинности. М.: Изд-во стандартов, 2001. 8 с.
3. Макарова Е.И., Будаева В.В. Определение глюкозы на спектрофотометре UNICO UV-2804 // Технология и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности: материалы 3-й Всероссийской науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием (28-30 апреля 2010 г., г. Бийск). Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2010. С. 215-218.
4. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леоно-вич А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учеб. пособие для вузов. М.: Экология, 1991. 320 с.
5. Синицын А.П. Новые препараты целлю-лаз для высокоэффективного осахаривания лиг-
КИЙ СПИСОК
ноцеллюлозных материалов / А.П. Синицын [и др.] // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова.
2010. Т. 6, № 2. С. 11-15.
6. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во Московского университета, 1995. 224 с.
7. Холькин Ю.И. Технология гидролизных производств: учебник для вузов. М.: Лесная промышленность, 1989. 496 с.
8. Яровенко В.Л., Маринченко В.А., Смирнов В.А. Технология спирта. М.: Колос, 1999. 464 с.
9. Hu Z., Ragauskas A.J. Hydrothermal pre-treatment of switchgrass // Ind. Eng. Chem. Res.
2011. V. 50. P. 4225-4230.
10. Jordan D.B., Bowman M.J., Braker J.D., Dien B.S., Hector R.E., Lee C.C., Mertens J.A., Wagschal K. Plant cell walls to ethanol // Biochem. J. 2012. № 442. P. 241-252. DOI: 10.1042/BJ20111 922.
11. Somerville C. Feedstocks for lignocellulo-sic biofuels // Science. 2010. № 329. Р. 790-792.
REFERENCES
1. GOST R 51135-2003. Izdeliya likerovodo-chnye. Pravila priemki i metody analiza. Tekhniches-kie trebovaniya [State Standart 51135-2003. Liqueurs and spirits. Acceptance rules and analytical methods]. Issued 1998-03-02. M.: IUS, 2003, 116 p.
2. GOST R 51786-2001. Vodka i spirt etilovyi
iz pishchevogo syr'ya. Gazokhromatograficheskii metod opredeleniya podlinnosti [State Standart 51786-2001. Vodka and ethyl alcohol from food-grade raw materials. Gas-chromatographic method for authenticity]. Moscow, Izdatel'stvo Standartov Publ., 2001, 8 p.
3. Makarova E.I., Budaeva V.V. Opredelenie glyukozy na spektrofotometre UNICO UV-2804 [Glucose identification on UNICO UV-2804 spectrophotometer]. Materialy 3 Vserossiiskoi nauchno-prakticheskoi konferentsii studentov, aspirantov i molodykh uchenykh s mezhdunarodnym uchastiem "Tekhnologiya i oborudovanie khimicheskoi, bio-tekhnologicheskoi i pishchevoi promyshlennosti" [Proc. All-Russian Workshop for Students, Postgraduates and Young Scientists on Technology and Equipment of Chemical, Biotechnological, and Food Industries]. Biysk, 2010, pp. 215-218.
4. Obolenskaya A.V., El'nitskaya Z.P., Leonovich A.A. Laboratornye raboty po khimii drevesiny i tsellyulozy: Uchebnoe posobie dlya vuzov [Laboratory Works on Wood and Pulp Chemistry], Moscow, Ekologiya Publ., 1991, 320 p.
5. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Skomarovskii A.A., Kondrat'eva E.G., Osipov D.O., Pravil'nikov A.G., Andrianov R.M., Okunev O.N., Bekkarevich A.O., Matys V.V., Koshelev A.V., Bubnova T.V., Berlin A.Kh. Novye preparaty tsellyulaz dlya vysokoeffek-tivnogo osakharivaniya lignotsellyuloznykh materi-alov [New cellulase preparations for high-performance saccharification of lignocellulosics]. Vestnik biotekhnologii i fiziko-khimicheskoi biologii imeni
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Ольга В. Байбакова
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН
659322, Россия, г. Бийск, ул. Социалистическая, 1
Аспирант
Поступила 26.02.2016
Yu.A. Ovchinnikova - Yu.A. Ovchinnikov Bulletin of Biotechnology and Physicochemical Biology, 2010, vol. 6, no. 2, pp. 11-15.
6. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Biokonversiya lignotsellyuloznykh materialov [Bioconversion of Lignocellulosics]. Moscow, MGU Publ., 1995, 224 p.
7. Khol'kin Yu.I. Tekhnologiya gidroliznykh pro-izvodstv [Technology of wood-hydrolysis alcohol productions]. Moscow, Lesnaya promyshlennost', 1989, 496 p.
8. Yarovenko V.L., Marinchenko V.A., Smirnov V.A. Tekhnologiya spirta. [Alcohol technology]. Moscow, Kolos Publ., 1999, 464 p.
9. Hu Z., Ragauskas A.J. Hydrothermal pre-treatment of switchgrass. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2011, no. 50, pp. 4225-4230. doi: 10.1021/ie101886d.
10. Jordan D.B., Bowman M.J., Braker J.D., Dien B.S., Hector R.E., Lee C.C., Mertens J.A., Wagschal K. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal, 2012, no. 442, pp. 241-252. doi:10.1042/-BJ20111922.
11. Somerville C. Feedstocks for lignocellulo-sic biofuels. Science, 2010, no. 329, pp. 790-792. doi: 10.1126/science.1189268.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Olga V. Baibakova
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies SB RAS 1, Sotsialisticheskaya St., Biysk, 659322, Russia Postgraduate student [email protected]
Received 26.02.2016
