CC BY
438
______________ УДК 616-006:576.5.085:615.324:59
Л.М. Михайлова И.Б. Меркулова, Н.П. Ермакова, А.И. Мишин, Н.Ю. Кульбачевская, В.М. Бухман МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
К ИССЛЕДОВАНИЮ ТУМОРОГЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ
И БИОПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ
ПРИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ БЕЗОПАСНОСТИ
РОнЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Меркулова Ирина Борисовна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории фармакологии и токсикологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел.: +7(495)324-18-19 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 26.06.2010, принята к печати 01.04.2010.
Резюме
В связи с внедрением в клиническую практику методов клеточной терапии, основанных на трансплантации культивируемых клеток и биопрепаратов на их основе, имеется риск развития опухолей у реципиентов. Это связано с возможной трансформацией нормальных клеток в опухолевые в культуре, а также реактивацией опухолевых клеток, вводимых в организм пациента в составе цельноклеточной противоопухолевой вакцины. Поэтому тестирование туморогенности - необходимый этап доклинического исследования безопасности применения клеточных линий и клеточных биопрепаратов, предназначенных для трансплантации. В обзоре представлены используемые в настоящее время подходы, модели и методы исследования туморогенности in vivo и in vitro. Рассмотрены методы тестирования на животных (иммунодефицитные мыши линий Nude и SCID, бестимусные крысы, животные с искусственно созданной иммуносупрессией), модели на основе органных культур и критерии оценки туморогенности.
Ключевые слова: клеточные линии, биопрепараты, безопасность, туморогенность, иммунодефицитные животные, опухоль.
L.M. Mikhaylovd, I.B. Merkulova, N.P. Ermakova, A.I. Mishin, N. Yu. Kulbachevskaya, V.M. Bukhman
METHODICAL APPROACHES
ON THE INVESTIGATION OF CELL LINES
AND CELLULAR BIOLOGICAL PRODUCTS TUMORIGENICITY
AT THEIR PRECLINICAL SAFETY ASSESSMENT
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
The risk of tumor formation in recipients is rising with the development of the cellular therapy methods based on transplantation of cultivated cells and cell-based biological products. This is linked with possible malignant transformation of normal cells in culture as well as reactivation of tumor cells which are administered as a whole-cell anticancer vaccine. Therefore tumorigenicity testing is the necessary step for preclinical safety assessment of cell lines and cellular biologicals designed for transplantation. In this review we discuss currently used approaches, models and methods of research of tumorigenicity in vitro and in vivo. The testing methods on the animals (immunodeficient mouse strains Nude and SCID, athymic rats, animals with artificial immunosuppression), organ culture models, and tumorigenicity evaluation criteria are considered.
Key words: cell lines, biological products, safety, tumorigenicity, tumor, immunodeficient animals.
Введение
Внедрение клеточных технологий в клиническую практику ставит перед исследователями ряд вопросов, связанных с безопасностью применения клеточного материала с лечебной целью. В первую очередь это касается риска развития опухолей.
Феномен спонтанной опухолевой трансформации различных клеточных линий человека и животных в культуре выявлен давно и наблюдается довольно часто [4; 6; 9; 15; 19; 34]. Данное явление наблюдается, как правило, при длительном культивировании клеток и сопряжено с процессом клеточного старения. Основной причиной злокачественной трансформации, ассоциированной со старением, принято считать мутации, затрагивающие протоонкогены и гены-супрессоры опухолевого роста [14; 54].Имеются также наблюдения аналогичного процесса при относи-
тельно коротких сроках культивирования и небольшом количестве пассажей. Так, у культивируемых мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека наблюдалась утрата контактного торможения роста уже на третьем пассаже, а появление первых хромосомных аномалий - на пятом [51]. Причины такой «ранней» трансформации пока не установлены. С развитием регенеративной медицины стали появляться сообщения о спонтанной злокачественной трансформации при длительном культивировании зрелых человеческих стволовых клеток [42]. Имеются наблюдения возникновения хромосомных аберраций при длительном культивировании эмбриональных стволовых клеток человека [26; 33]. Показана способность трансформированных in vitro человеческих [42; 46; 51] и мышиных [49] МСК формировать злокачественные опухоли при введении экспериментальным животным.
Описанные случаи спонтанной опухолевой трансформации стволовых клеток могут служить косвенным подтверждением гипотезы развития рака из мутировавших нормальных стволовых и прогениторных клеток - «стволовых клеток опухоли» [22; 23].
Поскольку технология получения и наработки клеточного материала для клинического применения почти всегда связана с культивированием, все сказанное выше имеет прямое отношение к методам соматической клеточной и генной терапии. При этом следует также иметь в виду возможное негативное влияние на клетки некоторых манипуляций ex vivo, таких как направленная дифферен-цировка и трансфекция различными генами.
Кроме линий нормальных соматических клеток в качестве основы для производства клеточных биопрепаратов в последнее время стали использоваться опухолевые клеточные линии. Опухолевые линии, прежде всего - человеческие, могут использоваться для получения биопрепаратов для иммунотерапии опухолей под названием «терапевтические противоопухолевые вакцины» [5; 7; 8; 24; 27; 36; 37; 44]. Цельноклеточные противоопухолевые вакцины могут быть получены как из клеток определенной опухолевой линии, так и из аутологичного опухолевого материала. Генетически модифицированные противоопухолевые вакцины получают путем трансфекции опухолевых клеток генами различных цитокинов - ИЛ-2, ФНО, ГМ-КСФ и других. Поскольку эти клетки сами могут явиться источником нового опухолевого очага, перед введением пациенту производится их инактивация, чаще всего путем облучения. Так как радиочувствительность различных опухолевых штаммов варьирует в широких пределах и всегда есть вероятность восстановления пролиферативной активности облученных клеток, представляется необходимым исследовать их на способность к опухолевому росту in vivo при подборе дозы облучения. Для аллоген-ных вакцин это не менее актуально, чем для аутологичных, поскольку экспрессия трансплантационных антигенов клетками опухоли может быть низкой или отсутствовать.
Таким образом, реальную угрозу представляет собой риск возникновения новообразований у человека при применении клеточных линий и биопрепаратов на их основе. Поэтому оценка туморо-генности должна быть включена в комплекс доклинических исследований клеточных линий и биопрепаратов для соматической клеточной терапии и тканевой инженерии.
Туморогенность
Согласно определению A.M. Lewis [32], ту-морогенность - это способность неопластических клеток, растущих в культуре, формировать опухоли при инокуляции животным. В более широком смысле под туморогенностью следует понимать способность злокачественно трансформированных (спонтанно или искусственно) клеток к пролиферации и формированию истинной опухоли в организме иммунологически толерантного реципиента. По отношению к реципиенту клетки могут быть аутогенными (в случае аутотрансплантации), аллоген-ными или ксеногенными. Туморогенность необходимо отличать от онкогенности, под которой подразумевается способность инокулируемых клеток или другого ДНК-содержащего материала вызывать опухолевую трансформацию клеток реципиента вследствие переноса онкогенов.
В нашей стране пока отсутствуют единые методические требования к доклиническому исследованию туморогенности клеточных линий и биопрепаратов на их основе, хотя необходимость таких требований не вызывает сомнений. В отечественной практике тест на формирование опухолей in vivo иногда проводится в рамках исследований канцеро-генности - для оценки трансформирующего воздействия вещества на клеточные линии грызунов (в качестве модели используются сингенные животные [1]). Также некоторые методы исследования туморо-генности (онкогенных потенций) отражены в методических указаниях [18]. Однако они полностью не удовлетворяют современным задачам, так как ориентированы на исследование перевиваемых, заведомо туморогенных клеточных линий.
В основе представленных подходов к исследованию туморогенности лежит опыт экспериментальных исследований, проведенных в РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН, а также международные и отечественные рекомендации по доклиническому изучению клеточных линий и биопрепаратов [1; 8; 13; 18; 30; 32; 41].
Общие подходы
к исследованию туморогенности
Тестирование туморогенности клеточных биопрепаратов должно быть неотъемлемым этапом исследования их безопасности, стандартизации и контроля качества. Это особенно важно в тех случаях, когда клетки, входящие в состав биопрепарата, подвергались генетической модификации и другим манипуляциям в культуре [30]
Если клетки, входящие в состав биопрепарата, не подвергались манипуляциям ex vivo либо подвергались им в минимальной степени, то исследование туморогенности можно считать необязательным. К таким биопрепаратам относятся, среди прочих, костный мозг и отдельные его фракции, не подвергавшиеся экспансии в культуре; гемопоэтические стволовые клетки периферической крови, ЛАК.
Для передачи клеточного материала на исследование туморогенности необходимы следующие сведения:
1) история клеточной линии, которая должна включать данные о доноре (для клеточных линий человека - медицинский анамнез донора), методы, применяемые для выделения ткани, используемые питательные среды, реактивы и антибиотики, а также число пассажей и удвоений клеточной популяции,
2) морфологическая характеристика клеточной линии и данные цитогенетического исследования,
3) используемая система банка хранения клеточной линии,
4) подтверждение об отсутствии контаминации клеточной линии бактериями, грибами, вирусами (для человеческих линий - ВИЧ, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирусы гепатитов B и C), микоплазмой,
5) для генетически модифицированных клеток - используемый вектор, метод трансфекции, стабильность трансфекции и процент трансфицированных клеток,
6) доза ионизирующей радиации, применявшаяся для инактивации опухолевых клеток (для противоопухолевых цельноклеточных вакцин).
При тестировании туморогенности клеточных линий и биопрепаратов для клеточной и генной терапии на животных необходимо учитывать:
— чувствительность модели; данные о прививаемости конкретных опухолей на определенной линии животных и при определенных условиях,
— число вводимых клеток (ТПД - туморогенная прививочная доза),
— известный латентный период роста контрольной опухолевой клеточной линии,
— доступность животных и наличие необходимых условий для проведения исследования.
Исследование туморогенности in vivo
Виды животных и методы исследования
Выбор животного определяется видовой принадлежностью клеточного материала. Для исследования туморогенности клеточных линий и биопрепаратов, полученных на их основе от грызунов, можно использовать здоровых сингенных животных. Для исследования всех остальных, в том числе - человеческих клеточных линий рекомендуется использовать иммунодефицитных животных. Наиболее предпочтительными моделями являются стандартные сертифицированные животные с генетически обусловленным иммунодефицитом:
1. Бестимусные мыши (голые мыши, Nude). Эти животные являются носителями аутосомно-рецессивной мутации, которая в гомозиготном состоянии приводит к отсутствию внутриутробной закладки тимуса и волосяных луковиц, в результате чего они дефицитны по Т-лимфоцитам и лишены шерстного покрова. Используются как новорожденные, так и взрослые гомозиготные особи (Nu/Nu) [28; 29; 31; 32; 41]. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина, с 1976 г. используются бестимусные мыши линии Balb|/c-nude собственного разведения с целью исследования трансплантации и получения штаммов и линий опухолей человека для противоопухолевой терапии, изучается эффективность новых противоопухолевых препаратов и противоопухолевых воздействий на моделях опухолей человека [2; 3; 10-12; 17]. Проведены успешные исследования туморо-генности на мышах этой линии [8; 16].
2. Бестимусные крысы (Nude rats) - крысы с идентичной генетической аномалией [32];
3. Мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом - SCID (Severe Combined Immune Deficiency). Это заболевание также наследуется по аутосомно-рецессивному типу и выражается в нарушении дифференцировки и созревания лимфоцитов, приводящему к несостоятельности гуморального и клеточного звеньев иммунитета. Результаты исследований последних лет продемонстрировали высокую прививаемость ксенотранс-планта-тов и опухолей на мышах линии SCID [13; 21; 38; 43; 45; 46; 51; 53].
Кроме стандартных линий животных с наследственным иммунодефицитом, в качестве моделей для изучения туморогенности давно используются животные с искусственно созданной иммуносупрессией. Такими моделями являются новорожденные и взрослые мыши, крысы или хомячки, обработанные ЛЛС или ЛТГ [39-41; 47; 50]. ЛЛС получают путем иммунизации кроликов суспензией клеток тимуса того вида
животных, на котором планируется проводить исследование - мыши, крысы или хомячка [40; 47; 50].
При исследовании туморогенности на новорожденных животных не позднее, чем через 24 ч после рождения, производят инокуляцию тестируемых клеток и в тот же день вводят подкожно 0,1 мл АЛС. Далее АЛС вводят в той же дозе на 2; 7 и 14 дни после рождения животного. Подход, основанный на применении антилимфоцитарной сыворотки у взрослых мышей, предусматривает введение АЛС в дозе 0,25 мл на животное в день введения исследуемых клеток, затем в 1; 3 дни и далее 2 раза в неделю до окончания эксперимента [47]. Применение АЛС позволяет добиться глубокой иммуносупрессии, достаточной для развития опухолей из ксеногенного материала. Однако в случае отсутствия стандартных коммерческих АЛС и АТГ исследования становятся трудоемкими и страдает воспроизводимость результатов.
Нельзя не упомянуть такой метод иммуносупрессии, как тимэктомия в сочетании с ТОТ и ТКМ от здорового сингенного донора, который широко использовался ранее [47]. Однако этот метод очень трудоемок и сопровождается значительной гибелью животных, поэтому в настоящее время он неактуален.
Условия постановки опыта
Для исследования туморогенности клеточных линий и клеточных биопрепаратов рекомендуется использовать по 10 животных в основной и контрольной группах [32; 41].
Известно, что при трансплантации бести-мусным мышам опухолевых клеток из культуры подкожные опухоли возникают чаще и быстрее, чем при перевивке клеточной взвеси из операционного материала [31], поэтому оптимальным является использование культуры клеток.
При использовании любой тест-системы число исследуемых и контрольных клеток должно быть равным той дозе опухолевых клеток, при которой наблюдается прогрессивный рост опухолей не менее чем у 90 % животных. Согласно международным рекомендациям, эта доза составляет 1*107 клеток на животное [32; 41]. Клетки в указанной дозе не более чем за 2 ч до введения должны быть суспендированы в 0,2 мл питательной среды без сыворотки.
Рекомендуется подкожное введение, так как при этом достигаются оптимальные условия для регистрации размеров и определения границ опухоли. При п/к введении клеточного материала наиболее предпочтительной анатомической областью, на наш взгляд, является боковая поверхность туловища по средней или задней аксиллярной линии, ближе к подмышечной впадине. Следует избегать введения клеточной суспензии под кожу спины или в подмышечную впадину. В первом случае может наблюдаться замедленный рост опухоли из-за худшего кровоснабжения, в последнем опухоль труднее поддается измерению и часто инфильтрирует прилежащие лимфатические узлы, что затрудняет оценку характера метастазирования.
В качестве позитивного контроля используется суспензия клеток опухолевой линии одинаковой видовой принадлежности с тестируемой клеточной линией, которая вводится животным в той же дозе и тем же путем. Опухолевая клеточная линия должна быть высокотуморогенной, т. е. вызывать прогрессивный рост опухолей у 90-100 % животных при введении в дозе 1х107 клеток на животное. При выборе позитивного контроля следует соблюдать принцип гистогене-тического сходства между контрольной линией и исследуемыми клетками.
Длительность наблюдения при исследовании туморогенности составляет 12 нед с момента инокуляции клеточного материала [32; 41]. Срок наблюдения, равный 21 дню [18], недостаточен для оценки туморогенности, поскольку латентный период образования опухолей для многих клеточных линий может быть более продолжительным. Так, например, для некоторых человеческих опухолевых линий (фибросаркома, липосаркома, хондросарко-ма, РМЖ) латентный период опухолевого роста на бестимусных мышах составляет 22-38 дней [29], а отдельные линии трансформированных мышиных фибробластов при сингенной трансплантации могут иметь латентный период до 3-5 месяцев [19].
При исследовании туморогенности животных регулярно осматривают и пальпируют место введения клеточного материала с периодичностью, необходимой для регистрации роста опухоли: в первые 3 нед. от начала опыта - 1 раз в 3 дня, далее 1 раз в нед. В случае гибели животного следует в максимально короткий срок во избежание аутолиза произвести вскрытие и забор органов и тканей с места инокуляции клеток для патоморфологического исследования. В случае выраженного ухудшения состояния животного с высокой вероятностью смертельного исхода, оно подвергается внеплановому умерщвлению и патоморфологическому исследованию. Животные, у которых наблюдается регрессия новообразований, должны быть умерщвлены до того момента, когда новообразования перестанут определяться пальпатор-но. Сформировавшиеся опухоли (узелки) измеряют в 3 плоскостях для определения объема. Всех животных с прогрессивно увеличивающимися узлами в контрольной и основной группах следует наблюдать в течение 2-3 нед., после чего животных выводят из опыта. Для основной группы рекомендуется двухэтапное выведение из опыта: половина животных без признаков опухолевого роста наблюдается в течение 3 нед, другая половина - в течение 12 нед [32; 41]. Умерщвление
- ингаляции С02 или диэтилового эфира.
Патоморфологическое исследование
Все животные подвергаются аутопсии и тщательному макроскопическому исследованию внутренних органов и места инокуляции клеток или биопрепарата. Для гистологического исследования опухоли, возникшие на месте инокуляции клеток или биопрепарата, вырезают в пределах окружающих нормальных тканей. При отсутствии опухолевого узла вырезают участки кожи с подлежащими тканями (подкожная клетчатка, фасция, мышечная ткань), а также регионарные лимфатические узлы, селезенку, печень, почки, легкие, головной мозг и все макроскопически измененные ткани. Для обнаружения метастазов во внутренних органах делают послойные разрезы бритвой. Участки органов и тканей фиксируют в 10 %-ном нейтральном формалине и подвергают общепринятой гистологической обработке с обезвоживанием в спиртах, хлороформе, с заливкой в парафин, окраской срезов толщиной 5 мкм гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону.
При необходимости для верификации опухолевых и неопухолевых поражений могут быть применены и другие методики окраски гистологических срезов, ИГХ.
Критерии оценки
Туморогенность:
1) частота развития опухолей - отношение числа животных с развившимися опухолями к общему числу животных [32];
2) латентный период роста опухоли - время от момента инокуляции клеток до момента появления макроскопически определяемой опухоли (дни, недели) [32];
3) V и m опухолевого узла; n узлов [32];
4) наличие метастазов, подтвержденных гистологическим исследованием;
5) гистологическая структура опухолевого узла в зоне инокуляции клеток (при наличии), признаки инвазивного роста.
Результаты исследования считают достоверными, если наблюдается прогрессивный рост опухоли не менее чем у 9 из 10 животных контрольной группы [32].
Дополнительные методы исследования
туморогенности (тест-системы in vitro)
В дополнение к тест-системам in vivo для исследования туморогенного потенциала клеточных линий были предложены тест-системы in vitro, основанные на характерных особенностях роста и миграции злокачественно трансформированных клеток в культуре.
В частности, было установлено, что отсутствие контактного торможения роста [20; 52] и способность клеток к делению в неприкрепленном состоянии [25; 28] коррелируют с их способностью к опухолевому росту при инокуляции животным. Вместе с тем, как было показано позднее, такая корреляция не является универсальной для всех клеточных линий [48]. Поэтому на основании только анализа культуральных характеристик клеток невозможно делать однозначных выводов об их туморогенности.
Еще одним отличительным признаком неопластических клеток является способность к инвазивному росту, которая легко воспроизводится в органных культурах. На этом основаны методы исследования туморогенности с применением культур различных тканей и органов, как моделей, имитирующих опухолевый рост in vivo.
Чаще всего используется кожа куриного эмбриона как наиболее чувствительный, недорогой и достаточно быстрый метод исследования туморо-генности in vitro [35].
Фрагмент ткани получают иссечением кожи дорсальной поверхности 9-дневного куриного эмбриона и помещают эпидермальной поверхностью вниз на модифицированный агар Вольфа, состоящий из 10 частей 1 %-ного агара (Bacto-агар) в сбалансированном солевом растворе Эрла без гидрокарбоната натрия, 4 частей фетальной телячьей сыворотки и 4 частей куриного эмбрионального экстракта. Эмбриональный экстракт получают путем измельчения куриного эмбриона и инкубацией полученного материала в сбалансированном солевом растворе Эрла без гидрокарбоната натрия при +4 °С в течение 12 ч с последующей очисткой центрифугированием в течение 10 мин при 2000 g.
Тестируемые в опыте клетки в количестве 1 х 105 суспендируют в 0,025 мл среды MEM и наносят на свободную (дермальную) поверхность кожного фрагмента, после чего органную культуру инкубируют в течение 3 суток при + 37 °С и повышенной влажности.
Затем ткань фиксируют и проводят стандартное гистологическое исследование с окраской срезов гематоксилином и эозином. Данный метод с незначительными изменениями применяется в отечественной практике [18].
В качестве другой модели рекомендуется использовать культуру мышечной ткани человека [39]. Для ее приготовления используются образцы здоровой жизнеспособной мышечной ткани, полученные в ходе хирургических вмешательств, выполненных по медицинским показаниям у пациентов, не страдающих онкологическими заболеваниями. Ткань измельчается на фрагменты размерами 2*2*3 мм, которые до начала исследования хранят в культуральной среде MAB 87/3 с гентамицином 0,05 мг/мл, содержащей 10% ФТС, при +4 °С. Изготавливаются агаровые блоки диаметром 15 мм и высотой 6 мм, с центральными лунками диаметром 4 мм и глубиной 3 мм. Фрагменты мышечной ткани помещаются на дно лунок в агаровых блоках, которые предварительно были помещены в центр культуральных чашек диаметром 35 мм и глубиной 15 мм. Исследуемые клетки в количестве от 1*105 до 5*105 суспендируют в 0,02 мл среды MAB 87/3 и наносят на свободную поверхность мышечной ткани. Около 4 мл той же среды наливают в культуральную чашку, так чтобы она омывала агаровый блок. Материал инкубируют в течение 7 дней при 37 °С в увлажненной атмосфере, состоящей из 96 % воздуха и 4 % СО2, после чего ткань фиксируют и проводят стандартное гистологическое исследование с окраской гематоксилином и эозином. Критерием туморогенности в последних двух тест-системах является наличие инвазии исследуемых клеток в подлежащую ткань.
Несмотря на простоту и доступность, тест-системы in vitro пока не могут служить альтернативой исследованиям in vivo, так как не воспроизводят всех условий, необходимых для развития опухоли. Они могут применяться в качестве дополнительных методов, в том числе при оценке динамики трансформации длительно культивируемых линий, не обладающих туморогенностью на ранних пассажах [41].
Заключение
Оценка туморогенности является необходимым этапом доклинического исследования безопасности, стандартизации и контроля качества клеточных биопрепаратов.
Существует ряд методов исследования туморогенности in vivo и in vitro, однако наиболее простыми и объективными следует считать методы с использованием иммунодефицитных животных
- мышей линий Nude и SCID, а также бестимусных крыс. Использование иммунодефицитных животных позволяет тестировать на туморогенность любые по отношению к реципиенту клеточные линии - аутологичные, аллогенные и ксеногенные, а также биопрепараты на их основе, что крайне важно для оценки их безопасности для человека.
Тестирование туморогенности включает ряд простых методических подходов, касающихся количественного состава групп животных, дозы вводимых клеток, сроков наблюдения, стандартных процедур инокуляции клеток, измерения опухоли и патоморфологического исследования.
Критерии оценки туморогенности in vivo включают: частоту развития опухолей, латентный период роста опухоли, объем, массу и число опухолевых очагов; гистологическую структуру опухолевого узла или ткани в месте инокуляции клеточного материала; наличие инвазивного роста и метастазов.
Методы, предусматривающие использование животных с искусственно созданной иммуносупрессией, как правило, более трудоемки и могут давать высокий процент гибели животных. Методы исследования туморогенности на органных культурах in vitro могут быть использованы лишь как дополнение к методу in vivo или как предварительные
- для ориентировки в отношении туморогенности.
Литература
1. Белицкий Г.А., Ревазова Ю.А., Абелев С.К. и др. Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ. Методические указания по оценке канцерогенности фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах. - М., 2005. - С. 131-70.
2. Бухарова И.К., Ревазова Е.С., Мороз Л.В. Эффективность некоторых новых противоопухолевых препаратов на моделях опухолей человека // Вестн. Всесоюзн. Онкол. Научн. Центра АМН СССР. - 1990. - № 1. - С. 8-11.
3. Бухарова И.К., Ревазова Е.С., Мороз Л.В. Чувствительность к противоопухолевым препаратам штаммов опухолей у иммунодефицитных мышей // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1994. - Т. 118; № 9. - С. 298-99.
4. Гувакова МА. Особенности изменения ростовых свойств клеток в процессе их спонтанной неопластической трансформации: Дисс. ... канд. биол. наук. СО РАН. Ин-т цитологии и генетики. - Новосибирск, 1992. - 16 с.
5. Коростелев С.А. Противоопухолевые вакцины // Совр. Онкол. -2003. - № 4. - С. 15-9.
6. Кузьмина С.В., Куликова К.С. Цитологическая и цитохимическая характеристика эмбриональных мышиных фибробластов в условиях длительного культивирования, приводящего к малигнизации // Проблема профилактики кори и противовирусные препараты. Материалы VII научной конференции 8-10 июня 1966 г. - М., 1966. - С. 157-9.
7. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
8. Михайлова Л.М., Ермакова Н.П., Меркулова И.Б. и др. Исследование туморогенности противоопухолевой вакцины «Мелавак» // Тез. докл. III съезда токсикологов России, 2-5 декабря 2008 г. - М., 2008. - С. 514-5.
9. Пан Е. Изменение штаммов нормальных эмбриональных клеток человека после длительного культивирования и сравнение их со штаммами опухолевых клеток // Тез. докл. УШ международного противоракового конгресса. - М., 1962. - С. 122.
10. Ревазова Е. С. Рост опухолей человека у бестимусных мышей, получение штаммов опухолей человека, их характеристика и использование в химиотерапии: Дис. ... д-ра мед. наук. - М.,1981.
11. Ревазова Е.С., Брызгалов И., Сорокина Ю., Иванов А.И др. Низкосиловое лазерное облучение, стимулирующее рост человеческой опухоли // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2001. - Т. 132; № 8. - С. 195-6.
12. Ревазова Е.С., Соловьев Ю.Н., Пучкова Г.П., Юдичева Т.В. Трансплантация опухолей человека бестимус-ным мышам // Вестн. АМН СССР. - 1978. - С. 42-6.
13. Ржанинова АА., Ермакова Н.П., Меркулова И.Б. и др. Исследование туморогенности культивированных хондроб-ластов человека // Тез. докл. III съезда токсикологов России, 2-5 декабря 2008 г. - М., 2008. - С. 238-9.
14. Романчиков Ю.М. Старение и иммортализация клеток животных: ключевая роль ядерных протоонкогенов // Изв. Рос. АН. Сер. биол. - 1992. - № 4. - С. 643-5.
15. Тимофеевский А.Д. Культура тканей вне организма и проблема опухолей // Природа. - 1956. - .№6 . - С. 13-22.
16. Трещалина Е.М., Андронова Н.Т., Райхлин Н.Т. Изучение онкогенных потенций различных иммунобиологических препаратов на иммунодефицитных мышах // РБЖ. - 2009. - №1. - С. 38-9.
17. Хохлов А.П., Трещалина Е.М., Доценко А.Н. и др. Действие нового производного сквалена Севит-Ф на опухоли человека у мышей Nude // рБж. - 2004. - №1. - С. 22-3.
18. Шалунова Н.В., Ломанова Г.А. Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Методические указания. / ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. - М., 1989.
19. Юрченко ЮА. Закономерности спонтанной опухолевой трансформации фибробластов мышей и крыс: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. АН СССР. Сиб. отд-ние. Ин-т цитологии и генетики. - Новосибирск, 1988 . - 16 с.
20. Aaronson S.A., Todaro G.J. Basis for the Acquaisition of Malignant Potential by Mouse Cells Cultivated in vitro // Science. - 1968. - 162. - P. 1024-6.
21. Bensidhoum M., Chapel A., Francois S. et al. Homing of in vitro expanded Stro-1- or Stro-1+ human mesenchymal stem cells into the NOD/SCID mouse and their role in supporting human CD34 cell engraftment // Blood. - 2004. - 103. - P. 3313-9.
22. Clarke M., Dick J., Dirks P. et al. Cancer Stem Cells - Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells // Cancer Res. - 2006. - 66. - P. 9339-44.
23. DalerbaP., ChoR.W., ClarkeM.F. Cancer Stem Cells: Model and Concepts//Annu. Rev. Med. - 2007. - 58. - P. 267-84.
24. Davis I.D., JeffordM., et al. Rational approaches to human cancer immunotherapy // Leukoc. Biol. - 2003. - 73. - P. 3-29.
25. DiMayorca G., Greenblatt M., Trauthen T. et al. Malignant transformation of BHK21 clone 13 cells in vitro by nitrosamines - a conditional state // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1973. - 70. - P. 46-9.
26. Draper J.S., Smith K., Gokhale P. et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells // Nat. Biotechnol. - 2004. - 22. - P. 53-4.
27. Espinoza-DelgadoI. Cancer Vaccines // The Oncologist. - 2002. - 7. - P. 20-33.
28. Freedman V.H., Shin S. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth in semi-solid medium // Cell. - 1974. - 3. - P. 355-9.
29. Giovanella B.C., Stehlin J.S. Jr, Williams L.J. et al. Heterotransplantation of human cancers into nude mice: a model system for human cancer chemotherapy // Cancer. - 1978. - 42. - P. 2269-81.
30. Guidelines for the clinical translation of stem cells / International Society for Stem Cell Research. - 2008. -http://www.isscr.org
31. Hajdu S., Fogh J. The nude mouse as a diagnostic tool in human tumor cell research. In: Fogh J., Giovanella B. C. eds. The nude mouse in experimental and clinical research. - New York: Academic Press, 1978. - P. 502-4.
32. Lewis A.M.Jr. Regulatory implications of neoplastic cell substrate tumorigenicity / U. S. Food and Drug Administration. - 2005. - 31 p.
33. Maitra A., Arking D.E., Shivapurkar N. et al. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells // Nature Genetics. - 2005. - 37. - P. 1099-103.
34. Moore A.E. Tumor formation by cultured cells derived from normal and cancerous tissues // Special Publ. New York Acad. Sci. - 1957. - 5. - P. 321-9.
35. Noguchi P.D., Johnson J.B, O'Donnell R., Petricciani J.C. Chick embryonic skin as a rapid organ culture assay for cellular neoplasia // Science. - 1978. - 199. - P. 980-3.
36. Ostrand-Rosenberg S. Tumor immunotherapy: the tumor cell as an antigen-presenting cell//Curr. Opin. Immun. - 1994. -6. - P. 722-7.
37. Ostrand-Rosenberg S., Pulaski B.A., Clements V.K. et al. Cell-based vaccines for the stimulation of immunity to metastatic cancer // Immunol. Rev. - 1999. - 170. - P.101-14.
38. Petricciani J.C., LevenbookI., Locke R. Human muscle: a model for the study of human neoplasia // Invest. New Drugs. - 1983. - 1. - P. 297-302.
39. Philips B., Gazet J.C. Effect of antilymphocyte serum on the growth of Hep 2 and HeLa cells in mice // Nature. -1968. - 220. - P. 1140-1.
40. Points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologicals / U. S. Food and Drug Administration. - 1993. - 40 p.
41. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation // Cancer Res. -2005. - 65. - P. 3035-9.
42. Schumacher U., Adam E. Immunohistochemical detection of the MUC1 gene product in human cancers grown in scid mice // J Histochem Cytochem. - 1998. - 46. - P. 127-34.
43. Schadendorf D., Belardelli F., et al. Conference on cancer vaccines//Cancer Immunol. Immunother. - 2000. - 49. - P. 281-4.
44. Schumacher U., Mitchell B.S. Use of clinically relevant human-scid-mouse models in metastasis research // Trends Biotechnol. - 1997. - 15. - P. 239-41.
45. Serakinci N., Guldberg P., Burns J. et al. Adult human mesenchymal stem cell as a target for neoplastic transformation // Oncogene. - 2004. - 23. - P. 5095-8.
46. Stanbridge E.J., Boulger L.R., Franks C.R. et al. Optimal conditions for the growth of malignant human and animal cell populations in immunosupressed mice // Cancer Res. - 1975. - 35. - P. 2203-12.
47. Stiles C.D., Desmond W., Chuman L.M. et al. Relationship of cell growth behavior in vitro to tumorigenicity in athymic nude mice // Cancer Res. - 1976. - 36. - P. 3300-5.
48. Tolar J., Nauta A.J., et al. Sarcoma derived from cultured mesenchymal stem cells//Stem Cells. - 2007. - 25. - P. 371-9.
49. Wallace R., Vasington P.J., Petricciani J.C. Heterotransplantation of cultured cell lines in newborn harmsters treated with antilymphocyte serum // Nature. - 1971. - 230. - P. 454-5.
50. Wang Y., Huso D.L., Harrington J. et al. Outgrowth of a transformed cell population derived from normal human BM mesenchymal stem cell culture // Cytotherapy. - 2005. - 7. - P. 509-19.
51. Weiss R.A., Vesely P., Sinderlarova J. Growth regulation and tumour formation of normal and neoplastic rat cells // Cancer. - 1973. - 11. - P. 77-89.
52. Xiao-Nan L., Qin S., et al. Valproic acid induces growth arrest, apoptosis, and senescence in medulloblastomas by increasing histone hyperacetylation and regulating expression of p21Cip1, CDK4, and CMYC//Mol. Canc. Ther. - 2005. - 4. - P. 1912-22.
53. Yeager T.R., et al. Overcoming cellular senescence in human cancer pathogenesis//Genes & Dev. - 1998. - 12. - P. 163-74.
