CC BY
51
М!Ж«Ш1МШЕШТ»
Метаболит афобазола М-11 ингибирует хинон-редуктазу-2
Кадников И.А., Воронин М.В., Середенин С.Б.
ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Резюме. Актуальность. Ингибирование хинон-редуктазы-2 (NQO2) является перспективным для достижения нейропротек-торного действия. Анксиолитик афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид) и его метаболит М-11 (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)-этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид) взаимодействуют с регуляторным мелато-нин-зависимым сайтом NQO2. Ранее нами показано, что афобазол ингибирует фермент. Влияние М-11 на NQO2 не изучено. Цель. Изучить действие метаболита афобазола М-11 на активность NQO2. Методы. Влияние М-11 на активность человеческого реком-бинантного фермента хинон-редуктаза-2 (hNQO2) исследовали методом флуоресцентной спектроскопии. Результаты. Установлено, что М-11 ингибирует hNQO2 в концентрациях 0,5 и 1,0 мМ, снижая скорость реакции на 12 и 24 % соответственно. В этих же концентрациях соединение М-11 уступает действию афобазола. Заключение. Соединение М-11 ингибирует NQO2 и может использоваться для изучения фармакологических эффектов афобазола, обусловленных взаимодействием с регуляторным сайтом фермента.
Ключевые слова: метаболит афобазола; хинон-редуктаза-2; МТЗ-рецептор
Для цитирования:
Кадников И.А., Воронин М.В., Середенин С.Б. Метаболит афобазола М-11 ингибирует хинон-редуктазу-2 // Фармакокине-
тика и фармакодинамика. - 2018. - №3. - С.27-30. DOI: 10.24411/2587-7836-2018-10020.
Afobazole metabolite M-11 inhibits quinone reductase 2
Kadnikov I.A., Voronin M.V., Seredenin S.B.
FSBI «Zakusov institute of Pharmacology», Moscow
Resume. Objective. Inhibition of quinone reductase 2 (NQO2) is a perspective target to achieve neuroprotective effect. Anxiolytic drug afobazole (5-Ethoxy-2-[2-(morpholino)-ethylthio]benzimidazole dihidrochloride) and its main metabolite M-11 (2-[2-(3-oxomorpholin-4-il)-ethylthio]-5-ethoxybenzimidazole hydrochloride) can interact with melatonin dependent regulatory site of NQO2. Previously we have figured that afobazole inhibits NQO2. However, the role of interaction between M-11 and NQO2 is unclear. Aim. To study the effect of M-11 on activity of NQO2. Methods. The influence of M-11 on activity of human recombinant NQO2 (hNQO2) was measured utilizing fluorescent spectroscopy. Results. M-11 inhibits hNQO2 in concentrations of 0.5 and 1.0 mM, decreasing enzymatic reaction velocity on 12 and 24 % respectively. In same concentrations, M-11 is inferior to afobazole. Conclusion. Compound M-11 inhibits NQO2 and can be used to study pharmacological effects of afobazole caused by interaction with regulatory site of enzyme.
Keywords: afobazole metabolite; NQO2; MT3 receptor
For citations:
Kadnikov IA, Voronin MV, Seredenin SB. Afobazole metabolite M-11 inhibits quinone reductase 2. Farmakokinetika ifarmakodinamika.
2018;3:27-30. (In Russ). DOI: 10.24411/2588-0519-2018-10020.
Введение
Фермент является цитозольным флаво-
протеином [1], катализирующим двухэлектронное восстановление пара- и орто-хинонов. Субстратной специфичностью к Мр02 обладают эндогенные и экзогенные хиноны, такие как производные катехола-минов и менадион (витамин К3) [2, 3]. У человека фермент экспрессируется в скелетных мышцах, почках, печени, лёгких, сердце, отделах головного мозга [4, 5]. Установлено, что Мр02 имеет мелатонин-зависимый регуляторный сайт (МТ3 рецептор) [6], а мелатонин ингибирует фермент [7]. Известно, что катализируемое Мр02 восстановление хинонов ведёт к образованию свободно-радикальных продуктов [8], а повышенная
экспрессия фермента коррелирует с развитием болезни Альцгеймера [9] и идиопатической формы болезни Паркинсона [10]. В фармакологических экспериментах показано, что ингибирование Мр02 опосредует нейропротекторное влияние и стимулирует когнитивные функции [11, 12].
В предыдущих опытах установлено, что анксиоли-тик афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид) и его основной метаболит М-11 (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)-этилтио]-5-э-токсибензимидазола гидрохлорид) обладают лиганд-ными свойствами к МТ3-рецептору с 1С50 = 9,9* 10-7 и 4,0*10-7 М соответственно [13]. Выявлено, что афобазол обладает ингибирующим действием на Мр02,
№3.2010
27
{ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФАРМАКОДИНАМИКА
которое реализуется по смешанному типу, а значения K. афобазола и мелатонина сопоставимы [14]. Взаимодействие М-11 с МТ3 рецептором позволяет предположить наличие у данного соединения ингибирующей активности по отношению к NQO2. Поэтому целью данного этапа исследований стало in vitro изучение влияния М-11 на активность рекомбинантного NQO2 человека в сравнении с афобазолом.
ряли по убыванию флуоресценции БМАИ при длине волны возбуждения 370 нм и длине волны испускания 450 нм в условиях постоянной температуры 37 °С. Все измерения проводили в 5 повторениях. Скорость ферментативной реакции определяли по убыванию интенсивности флуоресценции БМАИ на прямом участке кривой и сопоставлением полученных данных с калибровочными значениями.
Материалы и методы
Химические реактивы
Сульфат аммония, 2-метилнафтален-1,4-дион (менадион), метанол, рекомбинантный фермент хи-нон-редуктаза-2 человека (hNQO2), 1xPBS (Sigma-Aldrich, США, Сент-Луис), 1-бензил-1,4-дигидро-никотинамид (BNAH) (US Biological, США, Салем), 5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид (афобазол) и его основной метаболит 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)-этилтио]-5-этоксибен-зимидазола гидрохлорид (М-11) (синтезированы в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»).
Определение скорости реакции катализируемой NQO2
Влияние М-11 на активность NQO2 изучали в диапазоне конечных концентраций 0,1-1,0 мМ методом флуоресцентной спектроскопии на спектрофлу-ориметре Varian Cary Eclipse (США, Санта-Клара). В качестве субстрата NQO2 использовали менадион в конечной концентрации 1,0 мМ. Флуоресцирующим агентом служил косубстрат фермента BNAH в конечной концентрации 0,75 мМ. Как препарат сравнения использовали афобазол в тех же конечных концентрациях, что и М-11 (0,1-1,0 мМ). Матричные растворы менадиона (30 мМ) и BNAH (22,5 мМ) готовили в метаноле и хранили при -20 °С. Матричные растворы М-11 (30 мМ) и афобазола (30 мМ) готовили в ^PBS и хранили при 4 °С. Матричный раствор NQO2 (635 U) готовили в 2,78 М растворе сульфата аммония (1 мг NQO2/1 мл (NH4)2SO4) и хранили при температуре -20 °С. Раствор NQO2 для ферментативной реакции готовили путём доведения 2,8 мкл матричного раствора до 100 мкл 2,78 М сульфатом аммония. Все рабочие растворы готовили в день эксперимента.
Ферментативную реакцию проводили в кювете для флуоресценции объёмом 100 мкл (длина оптического пути 1 см). Инкубационная среда содержала по 2 мкл матричных растворов менадиона, BNAH, афобазола или М-11 и 52 мкл ^PBS. Реакцию инициировали добавлением в инкубационную среду 2 мкл рекомбинантного NQO2 человека для достижения конечной активности 0,1 U. Скорость реакции изме-
Математическая обработка результатов
Полученные экспериментальные данные были нормированы на единицу ферментативной активности. Оценку статистической значимости полученных результатов проводили с применением одностороннего дисперсионного анализа, критерий Холма-Шидака. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. Для статистической обработки результатов и построения графиков использовали программный пакет GraphPad Prism version 5.02 for Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com.
Результаты
В экспериментах показано, что скорость ферментативной реакции составляет 2,96 ± 0,141 мМ/мин. Основной метаболит афобазола М-11 снижает активность hNQO2 в концентрациях 0,5 мМ и 1,0 мМ до 2,6 ± 0,058 мМ/мин (p = 0,02) и 2,26 ± 0,056 мМ/мин (p < 0,001) соответственно (рис. 1). Установлена зависимость ингибирования hNQO2 от концентрации М-11 в инкубационной среде. А именно, М-11 в концентрации 1,0 мМ статистически значимо снижает активность hNQO2 в сравнении с концентрацией 0,5 мМ (p = 0,03) и 0,1 мМ (p = 0,001) (рис. 1). М-11 в концентрации 0,1 мМ не оказывает влияния на скорость реакции hNQO2 (2,86 ± 0,234 мМ/мин) в сравнении с контрольными значениями (р = 0,32) (рис. 1). М-11 уступает афо-базолу в ингибирующем действии на hNQO2. Афобазол в концентрации 0,1 мМ снижает активность фермента до 2,52 ± 0,094 мМ/мин (p = 0,003) (рис. 1), статистически значимо уменьшая скорость реакции в сравнении с М-11 (p = 0,01). В концентрациях 0,5 мМ и 1,0 мМ афобазол снижал активность hNQO2 до 2,29 ± 0,085 (p < 0,001) и 1,73 ± 0,122 мМ/мин (p < 0,001), превосходя действие М-11 на 12 % (p = 0,02) и 24 % (p = 0,001) соответственно (рис. 1). Как и для М-11, для афобазо-ла показана концентрационная зависимость скорости ферментативной реакции hNQO2. Афобазол в концентрации 1,0 мМ обладает большим ингибирующим действием, чем в концентрациях 0,1 мМ (p < 0,001) и 0,5 мМ (p < 0,001) (рис. 1). Влияние 0,5 мМ афобазола на активность hNQO2 статистически не отличается от его действия в концентрации 0,1 мМ (p = 0,06) (рис. 1).
i
s:
л I-
u
° 1 Q. 1
О
i¿
и
JD Ц
О
о.
II
о
#
X
ю о
lo
о
М-11
Афобазол
Рис. 1. Влияние афобазола и его основного метаболита М-11 на активность человеческого рекомбинантного фермента NQO2
Примечания: Данные представлены в виде М ± S.D., n = 5. * - статистически значимые различия по сравнению с контролем (p < 0,05, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc). ** -статистически значимые различия по сравнению с контролем (p < 0,01, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc). # - статистически значимые различия между эффектами афобазола и М-11 в идентичной концентрации (p < 0,05, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc). ## - статистически значимые различия между эффектами афобазола и М-11 в идентичной концентрации (p < 0,01, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc). A - статистически значимые различия по сравнению с действием соединения в концентрации 1,0 мМ (p < 0,05, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc). AA - статистически значимые различия по сравнению с действием соединения в концентрации 1,0 мМ (p < 0,01, ANOVA, Holm-Sidak post-hoc).
Обсуждение
Проведённое исследование подтвердило предположение об ингибирующем влиянии основного метаболита афобазола М-11 на активность hNQO2. Результаты экспериментов согласуются с выявленным ранее ингибированием hNQO2 [14] лигандами МТ3 - рецеп-
торов афобазолом [13] и мелатонином [15] в использованной бесклеточной системе и соответствуют данным научной периодики, полученным для рекомбинантного hNQO2 в других экспериментальных условиях. Так, мелатонин и его производные, проявляющие селективные лигандные свойства к МТ3 рецептору в на-номолярном диапазоне [7], ингибировали активность hNQO2 выделенной из клеток линии CHO-K1/hQR2 в микромолярных концентрациях [15]. В экспериментах in vitro и ex vivo показано ингибирующие действие на фермент других лигандов МТ3 рецептора разных химических групп, а именно флаваноидов ресвератрола [15] и кверцитина [16], производных бензимидазола TBB, TBBz и DMAT [17].
В нашей работе показано, что М-11 уступает в ингибирующей активности hNQO2 афобазолу. Из научной периодики известно, что вещества с более высоким сродством к МТ3 рецептору могут слабее ингибировать hNQO2 [7]. Различия во влиянии М-11 и афобазола на активность hNQO2 может быть связана с типом ингибирования фермента. Например, 2-йодомелатонин - конкурентный ингибитор NQO2 с высоким сродством к МТ3 рецептору слабее ингибирует фермент, чем действующее по бесконкурентному типу соединение S28128 с меньшей аффинностью к МТ3 рецептору [7]. Показано, что афобазол ингибирует hNQO2 по смешанному типу [14], однако полученные в настоящем исследовании результаты не позволяют сделать заключение о типе ингибирования NQO2 соединением М-11, для чего требуется проведение дополнительных кинетических исследований.
М-11 отличается от афобазола по спектру молекулярных мишеней. Если афобазол взаимодействует с о1, МТХ и МТ3 рецепторами и регуляторным сайтом МАО А, то М-11 - только с МТ3 рецептором [13]. Поэтому сочетание афобазола - М-11 можно рекомендовать для оценки вклада МТ3 рецептора в фармакологические эффекты афобазола.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Кадников Илья Андреевич Автор, ответственный за переписку
e-mail: [email protected] ORCID ID: 0000-0001-8202-3967 SPIN-код: 8995-0919
н. с. лаборатории фармакологической генетики, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Kadnikov Ilya Corresponding author
e-mail: [email protected] ORCID ID: 0000-0001-8202-3967 SPIN code: 8995-0919
Research Officer, laboratories of pharmacological genetics, FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Воронин Михаил Владимирович
ORCID ID: 0000-0003-2477-0563 SPIN-код: 6321-4709
к. м. н., с. н. с. лаборатории фармакологической генетики, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Середенин Сергей Борисович
ORCID ID: 0000-0003-4482-9331 SPIN-код: 3896-4655
д. м. н., проф., академик РАН, заведующий лабораторией фармакологической генетики, ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Voronin Mikhail
ORCID ID: 0000-0003-2477-0563 SPIN code: 6321-4709
Candidate of Medical Sciences, Senior Research Officer laboratories of pharmacological genetics, FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Seredenin Sergey
ORCID ID: 0000-0003-4482-9331 SPIN code: 3896-4655
Doctor of Medical Sciences, Prof., academician of RAS, head of the laboratory of pharmacological genetics, FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Литература / References
1. Iskander K, Li J, Han S, et al. NQO1 and NQO2 regulation of humoral immunity and autoimmunity. J Biol Chem. 2006;281(41):30917-30924. DOI: 10.1074/jbc.M605809200
2. Fu Y, Buryanovskyy L, Zhang Z. Quinone reductase 2 is a catechol quinone reductase. J Biol Chem. 2008;283(35):23829- 23835. DOI: 10.1074/ jbc.M801371200
3. Liao S, Dulaney JT, Williams-Ashman HG. Purification and properties of a flavoprotein catalyzing the oxidation of reduced ribosyl nicotinamide. J Biol Chem. 1962;237:2981- 2987.
4. Jaiswal AK. Human NAD (P) H : quinone oxidoreductase2. Gene structure, activity, and tissue-specific expression. J. Biol. Chem. 1994;269(20):14502- 14508.
5. Tissue expression of NQO2. The Human Protein Atlas Web site. https://www.proteinatlas.org/ENSG00000124588-NQO2/tissue.
6. Nosjean O, Ferro M, Coge F, et al. Identification of the melatonin-binding siteMT3 as the quinone reductase 2. J. Biol. Chem. 2000;275(40):31311- 31317. DOI: 10.1074/jbc.M005141200
7. Mailliet F, Ferry G, Vella F, et al. Characterization of the melatoninergic MT3 binding site on the NRH:quinone oxidoreductase 2 enzyme. Biochem Pharmacol. 2005;71(1-2):74- 88. DOI: 10.1016/j. bcp.2005.09.030
8. Reybier K, Perio P, Ferry G, et al. Insights into the redox cycle of human quinone reductase 2. Free Radic Res. 2011;45(10):1184- 1195. DOI: 10.3109/10715762.2011.605788
9. Hashimoto T, Nakai M. Increased hippocampal quinone reductase 2 in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2011;502(1):10- 12. DOI: 10.1016/j.neulet.2011.07.008
10. Wang W, Le WD, Pan T, et al. Association of NRH:quinone
oxidoreductase 2 gene promoter polymorphism with higher gene expression and increased susceptibility to Parkinson's disease. The Journals of Gerontology: Series A. 2008;63(2):127- 134. DOI: 10.1093/gerona/63.2.127
11. Benoit CE, Bastianetto S, Brouillette J, et al. Loss of quinone reductase 2 function selectively facilitates learning behaviors. J Neurosci. 2010;30(38):12690- 12700. DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2808-10.2010
12. Janda E, Parafati M, Aprigliano S, et al. The antidote effect of quinone oxidoreductase 2 inhibitor against paraquat-induced toxicity in vitro and in vivo. Br J Pharmacol. 2013; 168(1):46- 59. DOI: 10.1111/j. 1476-5381.2012.01870.x
13. Середенин СБ, Воронин МВ. Нейропротекторные механизмы действия афобазола // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72. - №1. - С.3-11. [Seredenin SB, Voronin MV. Neuroreceptor mechanisms involved in the action of afobazole. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya. 2009;72(1):3- 11. (In Russ).]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19334502 DOI: https://doi. org/10.30906/0869-2092-2009-72-1-3-11
14. Kadnikov IA, Voronin MV, Seredenin SB. Effect of afobazole on activity of quinone reductase 2. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2014;47(10):514-516 DOI: 10.1007/s11094-014-0993-y
15. Ferry G, Hecht S, Berger S, et al. Old and new inhibitors of quinone reductase 2. Chem Biol Interact. 2010;186(2):103- 109. DOI: 10.1016/j.cbi.2010.04.006
16. Wu K, Knox R, Sun XZ, et al. Catalytic properties of NAD(P) H:quinone oxidoreductase-2 (NQO2), a dihydronicotinamide riboside dependent oxidoreductase. Arch Biochem Biophys. 1997;347(2):221- 228. DOI: 10.1006/abbi.1997.0344
17. Leung KK, Shilton BH. Quinone reductase 2 is an adventitious target ofprotein kinase CK2 inhibitors TBBz (TBI) and DMAT. Biochemistry. 2015;54(1):47- 59. DOI: 10.1021/bi500959t
30
фдьмдШШМВ и ФШЩШМШ
