CC BY
26
УДК 577.352.332
Л. В. Селина1,2, К. А. Мотовилов1,3, Л. С. Ягужинский1,3, К. И. Агладзе1,А
1 Московский физико-технический институт (государственный университет),
Научно-образовательный центр «Вионанофизика»
2 Московский физико-технический институт (государственный университет) 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского,
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова 4Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, Киото, Япония
Восстановление сократительной активности первичной культуры кардиомиоцитов крысы, подавленной ингибиторами митохондриальной NADH-дегидрогеназы, под влиянием гидрофильных
хинонов
В настоящей работе методом оптического картирования впервые было показано, что сократительная активность первичной культуры неонатальных кардиомиоцитов, подавленная специфическими ингибиторами комплекса I дыхательной цепи митохондрий ротеноном и пиерицидином, может быть восстановлена с помощью дурохинона и менадиона (витамина КЗ). Известно, что NAD(P)H:xhhoh оксидоредуктаза типа I (NQ01, дт-диафораза) является ферментом, экспрессия которого резко возрастает в условиях токсического воздействия на организм. Вплоть до последнего времени, однако, считалось, что в кардиомиоцитах, в связи с особенностями их энергетики, активная экспрессия NQ01 не происходит. В данной работе впервые удалось показать, что путь переноса электронов в дыхательной цепи, активируемый NQ01, помимо прочего, может использоваться для поддержания сократительной активности кардиомиоцитов.
Ключевые слова: первичная культура кардиомиоцитов, ингибиторы дыхательной цепи митохондрий, оптическое картирование, ротенон, пиерицидин, дурохинон, NQ01.
1. Введение
Нормальное функционирование ткани миокарда сопряжено с интенсивным клеточным дыханием, обеспечивающим синтез АТР. Вместе с тем хорошо известно, что сердечная мышца, в отличие от обычной мышечной ткани, обладает способностью интенсивно окислять весьма широкий спектр органических субстратов [1]. Причем метаболизм сердца в зависимости от условий может претерпевать значительные изменения. Благодаря классическим исследованиям Рэндла и соавторов [2, 3] мы имеем достаточно ясное представление о том, какие типы органических субстратов наиболее предпочтительны для миокарда. Преимущество имеют жирные кислоты, которые сердечной мышцей окисляются более охотно, чем глюкоза.
Другой специфической особенностью кардиомиоцитов, затрагивающей их энергетику, является низкий уровень экспрессии ферментов семейства ARE, отвечающих за борьбу клетки с окислительным стрессом. К этому классу ферментов относится NAD(P)H:xhhoh оксидоредуктаза типа I (NQ01), обладающая широким спектром различных активностей, которые затрагивают как утилизацию ксенобиотиков, так и стабилизацию проапоптотиче-ского фактора р53 [4, 5].
В ряде исследований 2000-х годов [6-11] было показано, что NQ01 в кардиомиоцитах экспрессируется в ответ на окислительный стресс и введение в среду ксенобиотиков. Поскольку стало понятно, что окислительный стресс является важнейшей причиной развития заболеваний сердца, было предложено две основных стратегии борьбы с ним. Первая предполагает использование экзогенных антиоксидантов, а вторая связана с активацией
экспрессии ферментов, отвечающих за антиоксидантную защиту клетки, и поддержанием высокой концентрации эндогенных антиоксидантов, таких как глутатион. В семейство таких ферментов (так называемые ARE-ферменты) традиционно включают каталазу, су-пероксиддисмутазу, глутатионредуктазу, глататионтрансферазу и NQ01.
В связи с тем, что в нашей лаборатории давно ведется изучение влияния активации работы NQ01 на цепь основных реакций окислительного фосфорилирования в митохондриях [12-15] печени, сердца и мозга, а также освоен метод оптического картирования возбуждения монослоя кардиомиоцитов [16], мы решили пронаблюдать, как именно активация работы NQ01 влияет на характерные динамические электрофизиологические параметры первичной культуры кардиомиоцитов крысы. По нашим данным, до настоящего момента исследований реальной динамики возбуждения клеток, то есть их базовой сократительной функции, имеющей кардинальное значение для функционирования миокарда, в этих условиях не проводилось. Этот пробел мы и намерены были восполнить данным исследованием.
2. Материалы и методы
2.1. Выделение неонатальных кардиомиоцитов
Цикл операций по выделению неонатальных кардиомиоцитов требует два дня. В первый день проводится хирургическая изоляция сердец и приготовление взвеси сердечной ткани для трипсинизации. Трипсинизация происходит в течение ночи при температуре +4 °С. Операции проводятся в ламинарном шкафу. Манипуляции с образцами ткани проводятся на льду. Обычно для выделения кардиомиоцитов берутся 8-10 однодневных крысят (от одной крысы) линии Вистар, средним весом по 11 г. Каждый крысенок помещался в 50 миллилитровую полипропиленовую пробирку, на дне которой находилась салфетка, пропитанная изофлураном — веществом, обеспечивающим ингаляционный наркоз. Через 1-1,5 минуты крысенок погружается в состояние глубокого наркоза, после чего вынимается из пробирки, зажимается специальным движением в руке и протирается ваткой, смоченной 70% спиртом. Большими хирургическими ножницами производится декапитация. Затем маленькими хирургическими ножницами с загнутыми лезвиями грудная клетка разрезается так, чтобы разрез в конце был слегка смещен вправо. Легким сжимающим движением сердце выталкивалось из разреза и быстро помещалось в 50 мл пробирку со специальным раствором CMF HBSS (CMF Hank’s buffered salt solution — солевой буфер Хэнкса без кальция и магния), стоящую в емкости со льдом. Сердца, собранные в пробирке, несколько раз промываются свежим раствором CMF HBSS при помощи одноразовых пластиковых пипеток и помещаются в чашку Петри с небольшим количеством этого же раствора (каждое сердце в большой капле раствора). Они должны быть максимально очищены от излишков соединительной ткани и быстро измельчены специальными глазными хирургическими ножницами. Полученная масса промывается 2 раза рабочим раствором CMF HBSS и помещается в чистую чашку Петри, в которую предварительно были залиты 10 мл свежего раствора CMF HBSS и 1 мл размороженного трипсина. Чашка плотно закрывается и пе-
°С
проводится трипсинизация сердечной ткани с целью уменьшения соединительной, сосудистой и других видов ненужных в данных экспериментах тканей.
На следующий день проводится процедура извлечения отдельных кардиомиоцитов из тканевой суспензии и их очистка. Операции производятся в ламинарном шкафу второго класса при комнатной температуре. Масса измельченной сердечной ткани в чашке Петри вынимается из холодильника и помещается в подготовленный для работы ламинарный шкаф. В раствор с массой добавляется 1 мл ингибитора трипсина (предварительно размороженного). Кусочки ткани собираются пипеткой в 50 мл пробирку и к ним добавляется предварительно приготовленный 0,1% раствор коллагеназы типа II в 7,5 мл среды L-15 (среда Лейбовица — 15). Раствор коллагеназы с измельченной и частично диссоциированной трипсином массой сердечной ткани инкубируется в шейкере при температуре
°С
социации ткани. Процесс прекращается тогда, когда раствор становится мутным, то есть превращается в суспензию, а кусочки ткани визуально уменьшаются в 3-4 раза (маленькие кусочки диссоциируют полностью). Суспензия перемешивается с помощью пипетки с широким носиком (10 мл пластиковая одноразовая пипетка) и фильтруется через специальный фильтр (размер пор 0,1 мм). Полученная отфильтрованная суспензия центрифугируется в течение 5 минут на скорости 60 g при температуре +4 °С. Супернатант сливается, к полученному осадку добавляется 1 мл среды L-15, осадок аккуратно ресуспендируется. К полученной суспензии добавляется 7 мл среды L-15. Клеточная суспензия центрифугируется второй раз при тех же условиях. Супернатант сливается, к полученному осадку добавляется 2 мл среды L-15, осадок ресуспендируется. К полученной суспензии методом "каиля-по-капле" (во избежание кальциевого шока клеток) добавляется Са+2-содержащая среда DMEM (Dulbecco’s modified Eagl’s medium) с 10% бычьей сыворотки (FBS). Общий объем суспензии доводится до 15 мл. Суспензия разливается в равных долях в две чашки
2
°С 2
суспензия собирается из чашек Петри в 50 мл пробирку.
2.2. Выращивание возбудимой культуры неонатальных кардиомиоцитов
Оценка качества клеточной суспензии, предназначенной для посадки и дальнейшего инкубирования с целью получения образцов культуры сердечной ткани, проводится следующим образом. Сначала производится подсчет общего числа клеток в суспензии и процент жизнеспособных клеток по общепринятой методике в клеточной камере Горяева с использованием трипанового голубого (Trypan Blue). 20 мкл суспензии разводятся с 20 мкл рабочей среды и смешиваются с трипановым голубым (Trypan Blue) из расчета 4:1 (на 4 части суспензии 1 часть Trypan Blue). 10 мкл полученной суспензии помещаются в камеру Горяева. После этого производится подсчет окрашенных и неокрашенных клеток и вычисление их количества в стоковой суспензии. В среднем получается примерно 1-1.5 млн клеток из одного сердца. Из них около 90% — живые.
Посадка клеток проводится в стерильных условиях в ламинарном шкафу при комнатной температуре. Посадка осуществляется на покровные стекла, предварительно обработанные фибронектином, ламинином или поли-Ь-лизином и простерилизованные с обеих
2
ральной чашки Петри или покровного стекла. Кардиомиоциты инкубируются при темпе-°С
2
в небольших объемах (до 50 мл) в холодильнике. Непосредственно перед использованием
°С
с посаженной культурой первый раз меняется не ранее 18 и не позднее 24 часов после посадки с целью удаления всех неприкрепившихся клеток из культуры. Последующие смены культуральной среды проводятся 1 раз в два дня с предварительным промыванием культуры стерильным физиологическим раствором. Время формирования клеточного монослоя, способного к проведению возбуждения, определяется сроком от 2 до 3-4 дней. Если К 4-MV дню монослой имеет незаполненные клетками места, культура не может быть использована для экспериментов, связанных с параметрами проводимости возбуждения. Такая культура (при наличии механических сокращений, свидетельствующих о жизнеспособности клеток) может быть использована для проведения экспериментов, в которых однородность слоя не играет решающей роли. Жизнеспособность клеток, то есть время, на протяжении которого монослой кардиомиоцитов способен к проведению возбуждения, определяется сроком от 3-4 до 7-8 дней. В дальнейшем монослой, как правило, искажается и имеет неоднородную плотность.
2.3. Оптическое картирование волн возбуждения в культуре кардиомио-цитов
Оптическое картирование волн возбуждения в культуре проводилось на пятый день инкубации. Среду инкубации заменяли на раствор Тирода (Sigma), содержащий Са2+-зависимый краситель Fluo-4 (Invitrogen) и инкубировали при комнатной температуре в течение 40 минут.
Установка для оптического картирования представляет собой сочетание микроскопа Olympus MVX 10 с фильтром YFP и цифровой камеры ANDOR iXon+. Параметры стимуляции волн возбуждения: 3000 мВ, длительность стимула 20 мс, частота стимуляции 1,25 Гц.
При исследовании образцов мы получили записи фильмов распространения волны возбуждения. Для обработки изображений использовали программу ImageJ (NIH), с помощью которой получали временное разрешение волнового фронта. На основании этих данных рассчитывалась скорость распространения волны возбуждения по культуре.
2.4. Подавление дыхательной активности митохондрий кардиомиоцитов ротеноном и ее восстановление дурохиноном или менадионом
После нагрузки культуры красителем Fluo-4 клетки промывали свежим раствором Тирода и проводили оптическое картирование образца для определения контрольной скорости. В дальнейшем каждые 10 минут аккуратно выполняли добавки веществ (ротенон, дурохинон), перед каждой добавкой проводили оптическое картирование культуры в течение минуты, остальное время инкубации образец находился в темноте.
3. Результаты и обсуждение
Вне зависимости от того, являются ли источником химической энергии для синтеза АТР в митохондриях жирные кислоты, аминокислоты или углеводы, путь катаболизма этих соединений в эукариотической клетке связан с синтезом ацетил-СоА, который окисляется 2
Классический механизм сопряженного функционирования ферментов цикла Кребса и цепи окислительного фосфорилирования (схематически представлен на рис. 1) предполагает совместную работу пяти белковых комплексов, локализованных во внутренней митохондриальной мембране.
Н+ СН3СО - СоА Н+
2 С02
Рис. 1. Схема сопряженной работы цикла трикарбоновых кислот и цепи окислительного фосфорилирования, встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий. Римскими цифрами обозначены ферментативные комплексы цепи (I — NADH-дегидрогеназа, III — цитохром-с-редуктаза, IV — цитохром-с-оксидаза, V — АТР-спнтетаза). В одном цикле трикарбоновых кислот один ацетильный остаток окисляется до двух молекул диоксида углерода. При этом синтезируется три молекулы NAD
Три из них — NADH:yбиxинoн-oкcидopeдyктaзa (комплекс I), цитохром-с-редуктаза (комплекс III) и цитохром-с-оксидаза (комплекс IV) — являются протонными помпами,
которые создают трансмембранный градиент ионов водорода. Источником энергии для транспорта протонов через мембрану являются окислительно-восстановительные реакции, в которых первичными донорами электронов являются NADH и янтарная кислота, синтезирующиеся в цикле трикарбоновых кислот, а конечным акцептором электронов — кислород. Возникающий в результате работы протонных помп трансмембранный градиент ионов водорода утилизируется комплексом V в процессе синтеза АТР — универсальной энергетической валюты клетки, которая используется в абсолютном большинстве внутриклеточных процессов, требующих энергии. В настоящей работе нас более всего интересовало то, что АТР нужен для поддержания ионных градиентов, используемых для передачи возбуждения кардиомиоцитами и нейронами.
Ингибирование комплекса I должно приводить к накоплению в митохондриях восстановленного NADH, исчерпанию окисленного NAD+, остановке работы ферментов цикла Кребса (в силу отсутствия одного из субстратов — NAD+), постепенной деполяризации внутренней митохондриальной мембраны (см. схему на рис. 2) и окислительному стрессу, который вызывается активацией паразитных путей восстановления кислорода. В условиях повышенной концентрации активных форм кислорода открывается неспецифическая митохондриальная пора. Последнее ведет к весьма негативным для клетки последствиям, в большинстве случаев заканчивающихся той или иной формой клеточной гибели [17-19].
Рис. 2. Блокирование синтеза АТР и накопление NADH в митохондриях в результате ингибирования комплекса I под действием ротенона и пиерицидина. NAD+ отсутствует, мембрана практически деполязована, идет гидролиз запасов АТР
Существует несколько способов восстановления генерации протонного трансмембранного потенциала, необходимого для синтеза АТР в условиях искусственной или природной дисфункции комплексов I, II и III. Классический пример — это восстановление работы комплекса IV с помощью аскорбата и витамина КЗ. Благодаря этому методу Бриттон Чанс в свое время смог значительно облегчить жизнь молодой девушки, страдавшей дисфункцией сразу нескольких комплексов дыхательной цепи [20]. В рассмотренном случае восстановилась полноценная работа только одной протонной помпы, однако и этого было достаточно для возвращения человека к более или менее нормальному существованию.
В случае дисфункции или блокирования только комплекса I, связанной с накоплением NADH, эффективный способ восстановления работы дыхательной цепи связан с NQ01, которая начинает активно экспрессироваться клетками в ответ на окислительный стресс, сопровождающий практически любые нарушения работы дыхательной цепи (см. рис. 3). Для восстановления переноса электронов от NADH к комплексу III помимо NQ01 нужен дополнительный низкомолекулярный шаттл, которым может быть любой относительно гидрофильный хинон [13-15, 21]. Такие хиноны могут быть искусственного происхождения, но, в некоторых случаях, могут являться и природными метаболитами полифенолов, поступающих с пищей или образующихся под действием цитохромов Р450.
В своем исследовании мы использовали искусственный дурохинон, а также витамин КЗ. Последний является близким структурным аналогом природного витамина К, участвующего в каскаде реакций, приводящих к сворачиванию крови.
мембрана
сн3со - СоА
генерация Д|иН+идет за счет гидролиза ADP
н+
Н+ СН3СО - СоА Н+
2 С02
Рис. 3. Восстановление работы дыхательной цепи под действием гидрофплвного хинона в присутствии NQ01. Комплекс I по-прежнему блокирован, однако восстановлена работа протонных помп комплексов III и IV, концентрация NADH и кислорода по сравнению с тем состоянием, которое схематически изображено на рис. 2, снижается и нормализуется
Используя метод оптического картирования, мы можем отслеживать ряд функциональных параметров возбудимой двумерной культуры кардиомиоцитов. Помимо прочего, к таковым можно отнести скорость прохождения волны возбуждения по культуре, характерную величину периода автоколебаний, а также пороговое значение разности потенциалов между двумя электродами, подводимыми к культуре кардиомиоцитов, которое позволяет генерировать вынужденные волны возбуждения. В большинстве случаев для здоровой первичной культуры кардиомиоцитов достаточно потенциала в 1,5 вольта между стимулирующими электродами для того, чтобы генерировать вынужденную волну возбуждения. Увеличение порогового потенциала говорит о том, что электрофизиологические параметры культуры нарушены. Зачастую это изменение является необратимым, однако бывают исключения. Например, с помощью АзоТАБа можно фотоконтролируемым образом изменять активность ионных каналов кардиомиоцитов [22]. Однако этот метод является мягким по отношению к клеточной энергетике, способность клеток поддерживать редокс-статус от этого практически не зависит. В данной же работе изменения в клеточной энергетике носили более серьезный характер и сопровождались острым окислительным стрессом.
Основной наш интерес в настоящем исследовании, во-первых, был связан с изучением влияния подавления окисления NADH системой окислительного фосфорилирования митохондрий на возбудимость культуры первичных кардиомиоцитов. Во-вторых, со способностью гидрофильных хинонов — дурохинона и витамина КЗ — восстанавливать возбудимость культуры, подвергнутой воздействую ротенона или его аналога пиерицидина.
Первая фаза эксперимента во всех случаях заключалась в измерении основных элек-трофизиологических характеристик культуры: минимального порогового значения потенциала, требующегося для генерации вынужденных волн возбуждения (1), скорости прохождения волн возбуждения по двумерной клеточной культуре (2), поддерживаемой возбудимой культурой частоты вынужденных колебаний при пороговом потенциале (3). Клеточная культура считалась приемлемой для дальнейших экспериментов, если пороговое значение потенциала, генерирующего вынужденные колебания, составляло не более 3 В. Поддерживаемая частота вынужденных колебаний при этом значении потенциала составляла 1,25 Гц, а скорость прохождения волны возбуждения была не менее 100 миллиметров в секунду.
На рис. 4-6 приведены экспериментальные данные, демонстрирующие зависимость скорости прохождения волн возбуждения по культуре от времени инкубации культуры с ингибиторами комплекса I ротеноном (рис. 4, 5) и пиерицедином (рис. 6). Необходимо отметить, что действующая концентрация ротенона примерно в 30 раз превышала ту, которая используется при работе непосредственно с митохондриями, а концентрация пиерицидина — в 100 и более. Было показано, что эффект снижения скорости волны зависит от времени нелинейно. В ряде случаев в течение 10-15 минут после добавления ротенона или пиерицидина
Рис. 4. Зависимость скорости распространения волны возбуждения в культуре кардиомицитов от последовательных добавок 30 мкМ ротенона ( ■ ) и 15 мкМ дурохинона ( О )• Добавки ротенона и дурохинона делались однократно, затем образец инкубировался в темноте в течение 10 мин. После этого в течение времени порядка 1 минуты делалось оптическое картирование волн возбуждения в культуре
Рис. 5. Зависимость скорости распространения волны возбуждения в культуре кардиомицитов от последовательных добавок 5 мкМ ротенона ( ■ ), 50 мкМ ротенона ( □ ) и 20 мкМ дурохинона ( • ). В данном случае, в отличие от предыдущего, ротенон добавлялся в среду инкубации два раза, поскольку после 7-го измерения скорости волны возбуждения стало понятно, что 5 мкМ ротенона в среде инкубации не оказывают значительного действия. Между измерениями, как и в предыдущем случае, образец инкубировался в темноте в течение 10 мин. После этого в течение времени порядка 1 минуты делалось оптическое картирование волн возбуждения в культуре
наблюдалось кратковременное увеличение скорости волн возбуждения, либо плато. После это примерно 20-40 минут скорость волны линейно снижалась, пока не выходила на новое плато. В одном эксперименте мы наблюдали полную потерю культурой способности как к авто-, так и к вынужденному возбуждению после часа инкубации с 50 мкМ ротенона.
Восстановление скорости прохождения волн возбуждения после добавления гидрофильного хинона происходило достаточно быстро. Причем использовавшиеся концентрации соединений (20 мкМ дурохинона и 10 мкМ витамина КЗ) практически не отличались от тех, которые традиционно используются при исследовании дыхательной функции митохондрий [13-15, 23, 24].
Восстановление скорости прохождения волн возбуждения по культуре под действием дурохинона и КЗ в подавляющем большинстве случаев происходило лишь частично — до 60-70% от начальной скорости без ротенона или пиерицидина — и на этом уровне стабилизировалось. Прямой связи между этими пропорциями, скорее всего, нет, но стоит отметить, что регенерация дыхательной активности митохондрий под действием гидрофильных хи-нонов выводит КПД митохондрий (коэффициент АБР/О) на 2/3 от нормального уровня
Рис. 6. Зависимость скорости распространения волны возбуждения в культуре кардиомицитов от последовательных добавок 5 мкМ пиерицидина ( ■ ),15 мкМ перицидина ( □ )и 20 мкМ дурохинона ( О )• Каждая добавка выполнялась мгновенно, затем образец инкубировался в темноте в течение 10 мин.
из-за включения только двух протонных помп из трех.
Известно, что внесение менадиона и дурохинона в среду с митохондриями, у которых был блокирован комплекс I, приводит к повышенному выделению АФК [25-27], которые в свою очередь могут отправить клетку в апоптоз. Более мягким является воздействие хинонов ряда и М^оС^, которые в уже охарактеризованных условиях могут проявлять антиоксидантное действие [28-30], с одной стороны, а с другой, хотя и менее эффективно, — переносить электроны от ХАБН на комплекс III в обход ХАБН-дегидрогеназы [24]. Данные, представленные в настоящей работе, говорят о том, что воздействие подобных соединений потенциально может стабилизировать сократительную активность кардиомио-цитов в условиях дисфункции комплекса I. Природа подобной дисфункции может быть как генетической [31], так и ксенобиотической [12]. Дополнительным фактором снижения окислительного стресса может быть мягкое разобщение по Скулачеву, которое хиноны ряда и М^оС^ способны катализировать [23].
В период активного изучения свойств N(^01 и их связи с функционированием электрон-транспортной цепи митохондрий в нашей лаборатории были проведены исследования [12], показавшие, что ХАБН-дегидрогеназный участок дыхательной цепи неспецифически блокируется гидрофобными веществами, относящимися к разным классам органических соединений. Только бифильные вещества, которые обладают отрицательным зарядом при физиологических pH, не подавляют комплекса I. Гидрофильные хиноны, такие как КЗ или дурохинон, в присутствии ХАБН и N(^01 восстанавливаются до гидрохинонов и, окисляясь в комплексе ш дыхательной цепи, создают шунт в обход блока в комплексе I.
При этом удалось обнаружить несколько интересных корреляций физико-химических свойств и ингибирующей активности по отношению к ХАБН дегидрогеназе у органических соединений различной природы.
Было показано, что различные классы ароматических соединений — сложные эфиры, амиды, производные анилина и фенолы с низкой константой диссоциации (рК>7,7) специфически ингибируют перенос электронов между ХАБН и цитохромами Ь. Причем ингибирующий эффект этих веществ может быть в значительной степени ослаблен с помощью гидрофильных хинонов. Эффективность ингибирующего действия указанных веществ не зависит от конкретной структуры входящих в них функциональных групп, но коррелирует
с интегральным сродством к липидам, поскольку есть линейная корреляция между эффективностью ингибиторов и логарифмом коэффициента их распределения (log р) в системе октанол^вода.
В той же работе было изучено воздействие на дыхательную цепь различных алифатических спиртов [12]. Эти вещества тоже специфически ингибировали дыхательную цепь в сайте связывания между NADH и цитохромом Ь. Было показано, что эффект алифатических спиртов может быть обращен с помощью менадиона, а их эффективность как ингибиторов зависит от коэффициента распределения в системе октанол—вода аналогично ароматическим соединениям. Существует качественное различие между электронейтраль-ными бифильными веществами (с большим гидрофобным радикалом) и сильными кислотами, существующими в физиологических условиях в виде анионов. Первый тип веществ преимущественно ингибирует участок цепи между NADH и цитохромами Ь. Их связывание обуславливается двумя факторами: отсутствием у молекулы отрицательного заряда и её гидрофобностью. Изучение электронейтральных молекул, обладающих относительно малым дипольным моментом (метилового эфира 2-метил-4-хлорофенола и метилового эфира а-нафтола) показало, что их свойства не подчиняются общему правилу. Их эффективность в качестве ингибиторов была в 10-100 раз ниже, чем должна была быть согласно их коэффициенту распределения в системе октанол—вода. Это означает, что степень ингибирования электронного транспорта на начальном участке дыхательной цепи зависит не только от коэффициента распределения вещества (Р), но также и от поверхностной активности. Измерения, сделанные в работе [12] показали, что концентрации веществ, которые на 50% блокируют дыхание митохондрий в комплексе I, вдвое снижают поверхностное натяжение на границе октан—вода. Таким образом, сродство сайта связывания неспецифических ингибиторов количественно равно сродству этих ингибиторов к межфазной границе октан—вода.
Указанные результаты показывают, что попадание нейтральных и положительно заряженных ксенобиотиков (к которым можно отнести множество новых лекарственных препаратов) в клетку должно губительно сказываться на функции фосфорилирующей системы митохондрий. Гидрофильные хиноны при этом играют роль факторов, которые частично обращают этот негативный эффект. В настоящем исследовании впервые удалось показать, что негативное действие ксенобиотиков может быть обращено не только на уровне цепи окислительного фосфорилирования, но и на уровне динамических характеристик многоклеточной возбудимой клеточной культуры кардиомиоцитов. Дальнейшие исследования должны быть направлены на получение долгосрочного эффекта стабилизации возбудимости и снижения последствий окислительного стресса. Последнее может быть связано, во-первых, с заменой КЗ и дурохинона на хиноны ряда SkQ и MitoQ, а во-вторых, с введением дополнительной стадии преинкубации возбудимой культуры с факторами, вызывающими увеличенную экспрессию NQ01, перед стадией ингибирования комплекса I, например ЗН-1,2-дитиол-З-тион (D3T) [10].
Данное исследование было выполнено в рамках работ по Государственному контракту № 11.519.11.2021 (мероприятие 1.9 Федеральной целевой программы «Исследования и разработки»; Федеральной целевой программой «Кадры», мероприятие 1.4), а также поддержано грантом № 11.G34.31.0015 от 30 ноября 2010 г. Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования.
Литература
1. Taegtmeyer Н., Golfman L., Sharma S., Razeghi P., van Arsdall M. Linking gene expression to function: metabolic flexibility in the normal and diseased heart // Ann. N Y Acad. Sci. _ 2004. - V. 1015. - P. 202-213.
2. Randle P. J., England P. J., Denton R. М. Control of the tricarboxvlate cycle and its interactions with glycolysis during acetate utilization in rat heart // Biochem J. — 1970. — V. 117. - P. 677-695.
3. Randle P. J., Garland P. B., Hales C. N., Newsholme E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus // Lancet. — 1963. _ v. l. _ p. 785-789.
4. Asher G., Lotem J., Cohen B., Sachs L., Shaul Y. Regulation of p53 stability and p53-dependent apoptosis by NADH quinone oxidoreductase 1 // Proc. Natl. Acad. Sei. USA
- 2001. - V. 98. - P. 1188-1193.
5. Asher G., Lotem J., Kama R., Sachs L., Shaul Y. NQOl stabilizes p53 through a distinct pathway // Proc. Natl. Acad. Sei. USA - 2002. - V. 99. - P. 3099-3104.
6. Cao Z., Tsang M., Zhao H., Li Y. Induction of endogenous antioxidants and phase 2 enzymes by alpha-lipoic acid in rat cardiac H9C2 cells: protection against oxidative injury // Biochem. Biophvs. Res. Commun. — 2003. — V. 310. — P. 979-985.
7. Cao Z., Zhu H., Zhang L., Zhao X., Zweier J. L., Li Y. Antioxidants and phase 2 enzymes in cardiomvocvtes: Chemical inducibilitv and chemoprotection against oxidant and simulated ischemia-reperfusion injury // Exp. Biol. Med. (Maywood) — 2006. — V. 231. — P. 13531364.
8. He X., Kan H., Cai L., Ma Q. Nrf2 is critical in defense against high glucose-induced oxidative damage in cardiomvocvtes // J. Mol. Cell Cardiol. — 2009. — V. 46. — P. 47-58.
9. Purdom-Dickinson S. E., Lin Y., Dedek M., Morrissy S., Johnson J., Chen Q. M. Induction of antioxidant and detoxification response by oxidants in cardiomvocvtes: evidence from gene expression profiling and activation of Nrf2 transcription factor // J. Mol. Cell Cardiol. — 2007. - V. 42. - P. 159-176.
10. Zhu H., Jia Z., Mahaney J.E. \et al.\. The highly expressed and inducible endogenous NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 in cardiovascular cells acts as a potential superoxide scavenger // Cardiovasc Toxicol. — 2007. — V. 7. — P. 202-211.
11. Zhu H., Jia Z., Zhou K., et al. Cruciferous dithiolethione-mediated coordinated induction of total cellular and mitochondrial antioxidants and phase 2 enzymes in human primary cardiomvocvtes: cvtoprotection against oxidative/electrophilic stress and doxorubicin toxicity// Exp. Biol. Med. (Maywood) - 2009. - V. 234. - P. 418-429.
12. Yaguzhinsky L. S., Smirnova E. G., Ratnikova L. A., Kolesova G. M., Krasinskaya I. P. Hydrophobic Sites of the Mitochondrial Electron Transfer System // Journal of Bioenergetics and Biomemebranes. — 1973. — V. 5. — P. 163-174.
13. Колесова P.M., Вышинский C. A., Ягужинский Л. С. Изучение механизма циан-резистентного дыхания митохондрий печени в присутствии менадиона // Биохимия.
- 1989. - Т. 54. - С. 103-111.
14. Колесова Г. М., Карнаухова Л. В., Сегаль Н. К., Ягужинский Л. С. Влияние ингибиторов Q-цикла на циан-резистентное окисление мала га в присутствии менадиона митохондриями печени // Биохимия. — 1993. — Т. 58. — С. 1630-1640.
15. Колесова Г. М., Карнаухова Л. В., Ягужинский Л. С. Взаимодействие менадиона и дурохинона с Q-циклом в условиях работы ДТ-диафоразы // Биохимия. — 1991. — Т. 56.
- С. 1779-1786.
16. Agladze K., Kay М. W., Krinsky V., Sarvazyan N. Interaction between spiral and paced waves in cardiac tissue // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. — 2007. — V. 293. — P. 503-513.
17. Andrews D. T., Roy se С., Roy se A. G. The mitochondrial permeability transition pore and its role in anaesthesia-triggered cellular protection during ischaemia-reperfusion injury // Anaesth. Intensive Care. — V. 40. — P. 46-70.
18. D% Lisa F., Carpi A., Giorgio V., Bernardi P. The mitochondrial permeability transition pore and cvclophilin D in cardioprotection // Biochim. Biophvs. Acta. — V. 1813. — P. 1316-1322.
19. Oerlemans M.I., Koudstaal S., Chamuleau S. A., de Kleijn D.P., Doevendans P. A., Sluijter J. P. Targeting cell death in the reperfused heart: Pharmacological approaches for cardioprotection // Int. J. Cardiol.
20. Eleff S., Kennaway N. G., Buist N. R., et al. 31P NMR study of improvement in oxidative phosphorylation by vitamins КЗ and С in a patient with a defect in electron transport at complex III in skeletal muscle // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1984. — V. 81. — P. 3529-3533.
21. Lind C., Cadenas E., Hochstein P., Ernster L. DT-diaphorase: purification, properties, and function // Methods Enzvmol. - 1990. - V. 186. - P. 287-301.
22. Magome N., Kanaporis G., Moisan N., Tanaka K., Agladze K. Photo-control of excitation waves in cardiomvocyte tissue culture // Tissue Eng. Part A. — V. 17. — P. 2703-2711.
23. Еремеев С. А., Каргин В. И., Мотовилов К. A. [et al.}. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих «ловушек» свободных радикалов // Биохимия. — 2009. — V. 74. — Р. 1368— 1379.
24. Каргин В. И., Мотовилов К. А., Высоких М.Ю., Ягужинский Л. С. Взаимодействие положительно заряженного аналога убихинона (MitoQIO) с ДТ-диафоразой митохондрий печени // Биологические мембраны. — 2008. — V. 25. — Р. 34-40.
25. Chiou T.J., Wang Y. T., Tzeng W.F. DT-diaphorase protects against menadione-induced oxidative stress // Toxicology. — 1999. — V. 139. — P. 103-110.
26. Kossenjans W., Rymaszewski Z., Barankiewicz J., Bobst A., Ashraf M. Menadione-induced oxidative stress in bovine heart microvascular endothelial cells // Microcirculation. — 1996. _ V. 3. _ p. 30 17.
27. Takahashi K., Shibata T., Oba T. \et al.\. Multidrug-resistance-associated protein plays a protective role in menadione-induced oxidative stress in endothelial cells // Life Sci. — 2009. _ у. 84. - P. 211-217.
28. Antonenko Y.N., Avetisyan A.V., Bakeeva L.E. \et al.\. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 1. Cationic plastoquinone derivatives: synthesis and in vitro studies // Biochemistry (Mosc.). — 2008.
- V. 73. - P. 1273-1287.
29. Bakeeva L.E., Barskov I. V., Egorov М. V. [et al.}. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 2. Treatment of some ROS-and age-related diseases (heart arrhythmia, heart infarctions, kidney ischemia, and stroke) // Biochemistry (Mosc.). - 2008. - V. 73. - P. 1288-1299.
30. Skulachev V.P., Antonenko Y. N.. Cherepanov D.A. [et al.}. Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs) // Biochim. Biophvs. Acta. — V. 1797. — P. 878-889.
31. Desler C., Rasmussen L. J. Mitochondria in biology and medicine // Mitochondrion. — V.
12. - P. 472-476.
Поступим в редакцию 21.08.2012.
