CC BY
62
УДК 616-097:616.41
А.М. Гугович, О.В. Долгих, Д.Г. Дианова
МАРКЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ АКТИВАЦИИ И АПОПТОЗА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
ФГУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками
здоровью населения» (Пермь)
Данная статья посвящена оценке особенностей активационных клеточных маркеров и аннексин-индуцированного апоптоза в условиях воздействия химических факторов. Установлена зависимость между активационными, и сигнальными маркерами апоптоза и показателями, отражающими контаминацию биосред (содержание метилированных фенолов и хлороформа в крови) у работников химического производства, а также у детей, проживающих на экологически неблагоприятных территориях Пермского края с различной интенсивностью техногенного загрязнения.
Ключевые слова: лимфоцит, апоптоз, хлороформ, фенолы
MARKERS OF CELL ACTIVATION AND APOPTOSIS UNDER THE INFLUENCE OF CHEMICAL FACTORS
A.M. Gugovich, O.V. Dolgikh, D.G. Dianova
FSSI «Federal Scientific Centre for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies»,
Perm
This article is devoted, to estimation of features of activation cellular markers and annexin-induced apoptosis under the impact of chemical factors. The study identified, the correlation between activation and signaling markers of apoptosis and indicators of biological media contamination, (blood methylphenols and chloroform levels) in workers of chemical manufacturing and. also in children living in environmentally adverse territories of Perm. Region with various intensity of industrial pollution.
Key words: lymphocyte, apoptosis, chloroformium, phenolum
ВВЕДЕНИЕ
Постоянное многокомпонентное воздействие техногенных химических факторов в промышленно развитых регионах оказывает негативное влияние на здоровье населения [4, 5]. Ряд исследований посвящены изучению влияния антропогенной нагрузки на здоровье работающих на производстве людей [1, 2, 6]. Однако несомненный интерес также представляет изучение состояния иммунной системы у людей, постоянно проживающих в непосредственной близости к источникам выбросов и сбросов промышленных отходов.
Апоптоз — генетическая запрограммированная форма клеточной гибели, определяемая на основе характерных морфологических изменений умирающих клеток. Данный процесс является одним из ключевых процессов, определяющих формирование антигенспецифической составляющей иммунной системы и в значительной степени реализацию ее эффекторных функций. Однако известны патологические состояния, при которых механизм запрограммированной клеточной гибели оказывается заблокированным, что приводит неконтролируемой клеточной пролиферации, не сдерживаемой конкурирующим процессом апоптоза [10].
Экотоксиканты химического производства способны нарушать регуляторные функции иммунной системы, что может способствовать снижению адаптационных возможностей организма [3, 7]. В связи с важностью влияния экзогенных факторов
на возникновение дисбаланса иммунной системы, часто выражающегося в нарушении регуляции апоптотических реакций, особую значимость представляет изучение состояния иммунной системы с целью научного обоснования современных диагностических и лечебно-профилактических мероприятий.
Таким образом, целью настоящего исследования явилась оценка активационных маркеров и апоптотической реакции лимфоцитов периферической крови у людей с различной контаминантной нагрузкой.
МЕТОДИКА
В соответствии с поставленной целью в 2010 г. было проведено обследование 418 человек, включая взрослых и детей. В блоке взрослых всего обследовано 111 человек, включая группу контроля. Основную группу составили 72 человека, по профессиональному составу аппаратчики, занятые на производстве активированных углей. Контрольная группа включала 39 человек, не имеющих контакта с производственными вредностями. В блоке детей было обследовано 307 человек дошкольного возраста: в основную группу вошли 102 ребенка, проживающих на техногенно нагруженной территории, группу контроля составили 205 детей из «условно чистой» зоны. Анализируемые выборки работающих и детей объединяло наличие позитивной контаминации биосред органическими соединениями.
Все обследуемые проживают на территории Пермского края. Основная и контрольная группы взрослых и детей были сопоставимы по возрасту, половому составу, соматической заболеваемости. Выборка обследуемых была достаточна для достоверного определения межгрупповых различий.
Исследование биосред (кровь) на содержание органических соединений (хлороформ, фенол и его производные) выполнялось в соответствии с МУК 4.1.2102-4.1.2116-06 на капиллярном газовом хроматографе «Кристалл 2000» (Россия) [8].
Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD3 + , CD4+, CD8+, CD19+, CD16 + CD56+) проводили методом мембр нной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител к мембранным CD-рецепторам («Becton Dickinson», USA), при этом регистрировалось суммарно не менее 10 000 событий.
В определении целевых популяций клеток использовали следующие сочетания моноклональных антител:
CD3/CD8/CD45/CD4;
CD3/CD16 + CD56/CD45/CD19;
CD3/CD45/CD25/CD95.
Для определения количества апототических клеток использовали суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных путем центрифугирования в градиенте плотности фи-колл-верографина. Оценка уровня апоптотических клеток проводилась с помощью стандартной процедуры окрашивания, для чего использовали меченный флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) аннек-син V, специфически связывающийся с остатками фосфатидилсерина на мембранах апоптотических клеток, и пропидиум йодид (PI) — флюоресцентный краситель ДНК, позволяющий дифференцировать клетки с интактной и проницаемой мембраной [11]. Цитометрический анализ мононуклеаров выполняли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США) с использованием универсальной программы CellQuest.PrO. Накопление производили до 10 000 событий в лимфоцитарной области. Для настройки режимов компенсации и установки границ квадрантов использовали следующие контроли: неокрашенные клетки, клетки, окрашенные только Annexin V-FITC (без PI), клетки, окрашенные только пропидиум йодидом (без Annexin V-FITC).
Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики с помощью программы Microsoft® Office Excel 2003 и пакета прикладных программ Statistica 6.0. Количественные признаки представлены как M ± ст (среднее ± стандартное отклонение). Все различия считались статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При оценке уровня контаминации биосред у аппаратчиков было установлено достоверное повышение концентрации м-крезола и п-крезола при р < 0,05, тогда как у обследуемых группы
контроля фенолы в биосредах не определялись (табл. 1).
Таблица 1
Содержание низкомолекулярных химических соединений в сыворотке крови обследуемого взрослого контингента
Показатели Группа контроля (n = 39) Аппаратчики (n = 72)
Фенол, мг/л 0,0531 ± 0,002 0,0634 ± 0,005
о-Крезол, мг/л 0 ± 0 0,0015 ± 0,0007
м-Крезол, мг/л 0 ± 0 0,0049 ± 0,002*
п-Крезол, мг/л 0,0007 ± 0,0005 0,0040 ± 0,001*
Примечание: * - р < 0,05 при сравнении с группой контроля.
Анализ результатов показал, что у всех обследуемых основной группы наблюдается статистически значимое повышение активационного маркера CD25 + , как в относительных, так и в абсолютных величинах по сравнению с контрольными значениями. Увеличение содержания лимфоцитов, экспрессирующих CD25 + , свидетельствует об активации Т- и В-лимфоцитов.
Повышение относительного и абсолютного числа сигнального маркера апоптоза CD95+ у обследуемых имеет выраженный характер с высокой степенью достоверности различий с аналогичными показателями группы контроля (табл. 2). Однако величина экспрессии маркера СD95 отражает только готовность лимфоцитов вступить в апоптоз — включить механизм программированной клеточной гибели по Fas-зависимому механизму. Вклад CD95+ в клеточную гибель зависит от специфической восприимчивости клетки к FAS-зависимому апоптозу.
Таблица 2
Характеристика отдельных показателей иммунного статуса у обследуемого взрослого населения
Показатели Г руппа контроля (n = 39) Аппаратчики (n = 72)
CD25+, % 9,21 ± 0,63 13,84 ± 0,68*
CD25+,109/л 0,18 ± 0,01 0,31 ± 0,02*
CD95+, % 35,14 ± 1,55 42,21 ± 1,21*
CD95+,109/л 0,69 ± 0,03 0,96 ± 0,05*
Примечание: * - р < 0,05 при сравнении с группой контроля.
Установлено, что с увеличением в биосредах рабочих уровня фенолсодержащих соединений пропорционально возрастает количество лимфоцитов, экспрессирующих на мембране CD25 + и CD95 + . Повышение генетически детерминированной клеточной гибели активированных лимфоцитов является одним из механизмов, отражающих формирование повышенной чувствительности иммунокомпетентных клеток к антигенной перестройке в условиях контаминации фенолами.
В ходе исследования было отмечено значимое снижение уровня апоптотических клеток (2,72 ± 0,45 %) у аппаратчиков относительно кон-
трольных цифр (4,77 ± 0,42 %) (р < 0,05). Однако процентное содержание некротических клеток (11,12 ± 1,44 %) находится в диапазоне контрольных значений (13,06 ± 1,17 %). У обследуемых основной группы результаты корреляционного анализа позволили установить обратную связь между п-крезолом и уровнем апоптотических лимфоцитов (г = —0,23; р < 0,05), а также между п-крезолом и количеством некротических клеток (г = —0,29; р < 0,05). Наличие у производного фенола активных химических группировок в пара-положении, которые могут выступать в качестве источника радикалов и антиоксидантов, может снижать способность соединения индуцировать апоптоз [9]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что, возможно, фенолы вносят вклад в модификацию аннексин-за-висимого апоптоза.
Анализ уровня контаминации биосред у детей с промышленно развитой территории позволил установить, что в организме регистрируется значимое повышение концентрации хлороформа (0,0113 ± 0,0024 мкг/см3) по сравнению с контрольной группой (0 ± 0).
У всех обследуемых основной группы было установлено статистически значимое (р < 0,05) снижение количества клеток, вступивших как в стадию апоптоза (Аппехт V-FITC + PI'-клетки: 1,62 ± 0,10 %), так и в стадию некроза (Аппехт V-FITC + PI + -клетки: 7,02 ± 0,5 %) по сравнению с контрольными значениями (1,96 ± 0,09 % и 9,88 ± 0,42 % соответственно).
Выявлено, что у всех обследуемых основной группы наблюдалось достоверное повышение активационного маркера CD25+, как в относительных, так и в абсолютных величинах по сравнению с контрольными значениями (табл. 3), что свидетельствует об избыточной антигенной стимуляции клеток иммунной системы, способствующей их активации. Также было зафиксировано повышение клеточного маркера CD95+, не достигшее статистически значимого уровня.
Таблица 3
Характеристика отдельных показателей иммунного статуса детского населения
Показатель Контрольная группа (п = 205) Основная группа (п = 102)
CD25+, % 5,42 ± 0,12 6,49 ± 0,46*
CD25+, 109/л 0,14 ± 0,004 0,17 ± 0,01*
CD95+, % 24,87 ± 0,60 26,03 ± 1,01
CD95+, 109/л 0,69 ± 0,07 0,68 ± 0,04
Примечание: * - р < 0,05 при сравнении с группой контроля.
Увеличение экспрессии CD25+-антигена на им-мунокомпетентных клетках характеризует повышенное функциональное состояние Т-лимфоцитов в условиях гаптенной нагрузки. Однако отсутствие увеличения маркера негативной активации лимфоцитов (CD95+-маркера) в условиях контаминации биосред хлорорганическими соединениями может привести к нарушению клеточной регуляции, что
выражается в ингибировании Fas-зависимого апоптоза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленный материал доказывает вклад пороговой дозы метилированных фенолов и хло-рорганических соединений в трансформацию апоптотического ответа, а также однотипность изменений клеточного цикла (отсутствие возрастной зависимости) в ответ на контаминацию органических соединений у работающих и детей. Скорее всего, данный эффект способствует перестройке рецепторов лимфоцитов и повышает их готовность к клеточной гибели. Полученные данные позволяют предположить нарушение индукции Fas-зависимого апоптоза на фоне повышенной гаптенной нагрузки, что является одним из механизмов функционального дисбаланса иммунорегуляции в условиях техногенной нагрузки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аскарова З.Ф., Денисов Э.И. Оценка профессионального риска нарушений здоровья работников горнодобывающей промышленности // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2009. - № 1 (65). - С. 9 - 14.
2. Иммунный статус организма как критерий адаптации к техногенному загрязнению среды обитания (на примере производства полиметаллических катализаторов) / А.Б. Бакиров [и др.] // Медицинский вестник Башкортостана. -2008. - № 5. - С. 25-29.
3. Долгих О.В., Зайцева Н.В., Дианова Д.Г Аннексин-индуцированный апоптоз в условиях производственной среды // Материалы XLV научно-практической конференции с международным участием «Гигиена, организация здравоохранения и профпатология» и семинара «Актуальные вопросы современной профпатологии», Новокузнецк, 17-18 ноября 2010 г. - С. 102-103.
4. Оценка иммунологического статуса в условиях воздействия химических факторов / О.В. Долгих [и др.] // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический сборник по аллергологии и иммунологии. - 2010. - № 2/1 (29). - С. 124-125.
5. Зайцева Н.В., Долгих О.В., Дианова Д.Г. Особенности иммунных нарушений в условиях производства активированных углей // Медицина труда и промышленная экология. - 2011. - № 2. -С. 21-23.
6. Состояние клеточного и гуморального иммунитета и аутотолерантности у работников атомной промышленности / И.В. Леках [и др.] // Медицинская иммунология. - 2007. - № 2-3. - С. 301302.
7. Нотова С. В., Мирошникова С.А., Лебедев С.В. Изучение уровня тяжелых металлов в организме при различных патологических состояниях, связанных с нарушением функционирования иммунной системы // Вестник ОГУ. - 2009. -№ 6. - С. 496-498.
8. Уланова Т.С. Определение вредных веществ в биологических средах: Сборник методических указаний. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 183 с.
9. Цыганкова И.Г., Женодарова С.М. Корреляционное соотношение структура-свойство для описания индукции апоптоза (программированной гибели клеток) производными фенолов
// Журнал общей химии. — 2008. — Т. 78 (9). — С. 1529-1535.
10. Apoptosis: molecular regulation of cell death / A.J. Hale [et al.] // Eur J Biochem. — 1996. — Vol. 236 (1). — P. 1 —26.
11. Van Engeland M., Nieland L.J.W., Ramaekers F.C.S. et al. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. — 1998. — Vol. 31. — P. 1—9.
Сведения об авторах
ГуговичАлеся Михайловна - м.н.с. лаборатории методов клеточной диагностики ФГУН «Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (614087, г Пермь, ул. Орджоникидзе, д. 82; моб.: 8 (964) 197 74 91)
Долгих Олег Владимирович - д.м.н., профессор, заведующий отделом иммунобиологических методов диагностики ФГУН «Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора
Дианова Дина Гумеровна - к.м.н., ст.н.с. лаборатории методов клеточной диагностики ФГУН «Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора
