CC BY
20
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
В процессе проведенных исследований установлено, что интоксикация бытовым газом и его метаболитами вызывает тяжелое необратимое поражение почек и печени, сопровождающееся декомпенсированным ацидозом с достоверным снижением активности ЛДГ в клетках канальцевого эпителия и повышением уровня активности данного фермента в клетках печени, увеличением показателя энергетического обеспечения НАД-Н2-де-гидрогеназы. Эти глубокие структурно-метаболические изменения печени и почек вляются специфическими признаками токсического поражения бытовым газом, способными в дальнейшем приводить к развитию хронической печеночной и почечной недостаточности.
Ключевые слова: отравление, бытовой газ, печень, почки.
SUMMARY
E. Y. Kalinina, O. D. Yagmurov
Functional morphology of the proximal and distal channels of the kidneys and of the liver in modeling of acute domestic gas poisoning
The work is dedicated to the study of histological and histochemical liver and kidneys changes on the model of domestic gas poisoning during the experiment. In the process of investigations carried out, it has been found that gas intoxication and intoxication by its metabolites causes deep structural and metabolic liver and kidneys damages leading to the development of chronic liver and kidneys decompensation.
Key words: domestic gas poisoning, liver, kidneys.
© О. В. Долгих, Д. Г. Дианова, А. М. Гугович, 2012 г.
УДК 547.56:612.014:577.7
О. В. Долгих, Д. Г. Дианова, А. М. Гугович
АПОПТОЗ У РАБОТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЭКСПОЗИЦИИ ФЕНОЛАМИ
Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, г. Пермь
Важнейшей задачей медицины труда в настоящее время является оптимизация профессионального здоровья с целью сохранения трудового потенциала страны. Техногенные химические загрязнители производственной среды являются приоритетными факторами риска для здоровья работающего населения [2]. Химический фактор является причиной снижения как специфического, так и неспецифического иммунитета, что приводит к развитию патологического процесса и росту заболеваемости населения [3].
Очевидно, индуцирующее влияние неблагоприятных техногенных химических факторов производственной среды на организм человека диктует необходимость углубленного изучения состояния иммунологического здоровья работающего населения для своевременной диагностики и проведения адекватных, обоснованных лечебно-профилактических мероприятий.
Цель работы - оценка особенностей апоптоза у изолировщиков в условиях экспозиции фенолами.
Всего, включая группу контроля, обследованы 128 человек. В основную группу вошли 90 человек, имеющих рабочую специальность «изолировщик». Уровень фенола в воздухе рабочей зоны производственных помещений составил 1,4 мг/м3, что превышает ПДК (предельно допустимую концентрацию) (0,3 мг/м3). В соответствии с Р2.2.2006-05, класс условий труда (КУТ) изолировщиков по фактору «Фенол в воздухе рабочей зоны» относится к классу 3.2. Возраст обследуемых основной группы - от
21 до 56 лет (средний возраст - 39,1±5,2 года); мужчин -59 (69,5 %), женщин - 31 (30,5 %). Исследование проведено с учетом рабочего стажа на производстве (средний стаж -7,8±1,8 года). Контрольную группу составили 39 человек в возрасте от 20 до 54 лет (средний возраст - 39,83± ±2,90 года), мужчин - 20 (51 %), женщин - 19 (49 %), не имеющих контакта с производственными вредностями (служащие Налоговой инспекции).
Определение органических соединений (фенол, о-кре-зол, м-крезол, п-крезол) в биосредах (кровь) вытолнялось на капиллярном газовом хроматографе «Кристалл 2000» (Россия) (ЗАО СКБ «Хроматэк», Россия) в соответствии с МУК 4.1.2102-4.1.2116-06.
Фенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы Becton Dickinson (BD, USA) с использованием универсальной программы CellQuestPrO (BD, USA). Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD95+, CD3+CD16+CD56+(NKT), CD4+CD25+, CD4+ CD25+127) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам (BD, USA; Becman Coulter BC, USA). Для определения уровня экспрессии рецептора к фактору некроза опухоли-a 1 -го типа (ФНОа, TNFRI - tumor necrosis factor receptor I) использовали цитофлюориметрический метод, основанный на взаимодействии соответствующих моноклональных антител с мембранным рецептором к TNFa на лимфоцитах. Клетки (1(106 клеток/мл) отмывали фосфатно-соле-выш буфером (рН=7,2) (PBS) и окрашивали стандартными МКАТ к рецептору TNFRI, мечеными PE (Phycoerythrin) (BC, USA) согласно протоколу фирмы-производителя. Содержание лимфоцитов, флюоресцирующих на FL2-канале (568-590 нм), анализировали с помощью проточного цитофлюориметра FACSCalibur (BD, USA). Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили методом, основанным на определении экспрессии фос-фатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгирован-ного с FITC (Annexin V-FITC) (BD, USA). После отмывания клетки (1х106 клеток/мл) ресуспендировали в рабочем растворе буфера для окрашивания и инкубировали
Таблица 1 Уровень низкомолекулярных химических соединений в крови обследуемых
Показатель Контрольная группа (n=39), M ± m Основная группа (n=58), M±m
Фенол, мг/л 0,0531 ±0,002 0,0710±0,016
о-крезол, мг/л 0,0 0,0005±0,0003
м-крезол, мг/л 0,0 0,0062±0,002*
п-крезол, мг/л 0,0 0,0010±0,0007
Здесь и далее * - разница достоверна по сравнению с контрольной группой (р<0,05).
с добавлением красителей. Через 15 минут их фиксировали рабочим раствором связывающего буфера и подвергали проточной цитофлюорометрии. Определение внутриклеточного маркера апоптоза - р53-протеина - проводилось с помощью МКАТ против белка р53, конъюгированные с PE. Для анализа использовалась суспензия мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. Затем клетки, дважды отмытые в холодном фосфатно-солевом буфере, ресуспенди-ровали в буфере для разведения клеток Cell Wash (1х106 клеток/мл) и окрашивали стандартными МКАТ согласно протоколу фирмы-производителя (BC, USA). Сбор данных проводили на проточном цитометре.
Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики с помощью программы Microsoft® Office Excel 2003 и пакета прикладных программ Statistica 6.0. (StatSoft, США). Статистический анализ данных проводился методами описательной статистики и сравнения выборок (с использованием t-критерия Стьюдента), корреляционного анализа (с использованием коэффициента корреляции и коэффи-
Таблица 2
Характеристика показателей иммунной системы обследуемых
Показатель Контрольная группа (n=39), M±m Основная группа (n=90), M±m
CD3+, % 73,00±1,16 68,19±0,67*
CD3+, 109/л 1,51±0,07 1,48±0,04
CD4+, % 43,10±0,90 41,32±0,89
CD4+, 109/л 0,90±0,05 0,89±0,03
CD8+, % 25,44±0,95 24,41±0,69
CD8+, 109/л 0,52±0,03 0,53±0,02
CD19+, % 9,39±0,48 11,08±0,41*
CD19+, 109/л 0,20±0,01 0,24±0,01
CD3+CD16+CD56+, % 14,46±1,22 12,54±0,51
CD3+CD16+CD56+, 109/л 0,30±0,02 0,27±0,02
CD4+ CD25+127-, % 0,55±0,06 0,81±0,05*
CD4+ CD25+127-, 109/л 0,01±0,001 0,02±0,001*
CD4+CD25+, % 7,82±0,39 11,33±0,33*
CD4+CD25+, 109/л 0,16±0,01 0,25±0,01*
CD95+, % 35,14±1,55 31,34±0,77*
CD95+, 109/л 0,69±0,03 0,67±0,02
p53, % 3,42±0,29 1,44±0,11*
TNFRI+, % 3,31±0,27 1,39±0,11*
Annexin V-FITC+PI-, % 4,77±0,42 2,17±0,09*
Annexin V-FITC+PI+, % 13,06±1,17 7,69±0,25*
циента детерминации). Характер статистического распределения по выборкам устанавливали по критерию согласия с2. Различия между группами считали значимыми при р<0,05.
Анализ результатов показал, что в крови всех обследуемых основной группы зафиксировано статистически значимое повышение концентрации м-крезола в сравнении со значениями, зафиксированными в контрольной группе (р<0,05) (табл. 1). Крезолы (о-крезол, м-крезол, п-крезол) в биосредах группы контроля данной методикой не идентифицировались. Отмечена достоверная зависимость уровня м-крезола в крови обследуемых в зависимости от стажа работы в условиях производства (г=0,34; р<0,05).
Сравнительный анализ иммунограмм продемонстрировал, что у обследуемых работающих статистически значимо снижено относительное число СО3+-лимфоцитов (р<0,05) и повышено процентное содержание CD 19+-кле-ток (р<0,05) в сравнении с величинами, полученными в группе контроля (табл. 2). Ряд авторов утверждают, что низкая экспрессия CD3 - общего популяционного маркера Т-лимфоцитов - является отражением дефекта Т-клеточного звена иммунитета [5]. Однако другие исследователи полагают, что снижение количества С03+-анти-гена на иммунокомпетентных клетках - признак мобилизации иммунной системы с преобладанием молодых незрелых форм Т-лимфоцитов, еще не экспрессирующих CD3, но экспрессирующих комплексы антигенов для МНС I класса (major histocompatibility complex I) (CD8+) или антигенов МНС II (CD4+) [1]. Экспериментально доказано, что В-лимфоциты являются источником FasL (Fas-лиганд), необходимого для процесса запрограммированной гибели Т-лимфоцитов [7]. Поэтому можно полагать, что активация В-клеточного звена, фиксируемая при повышенной антигенной нагрузке, является фактором торможения иммунологической ответной реакции организма. Оценка уровня регуляторных клеток (CD4+ CD25+127-, Treg) позволила установить, что у работающих на производстве статистически значимо повышено количество Treg (по относительной и абсолютной величине) (р<0,05) в сравнении с результатами, выявленными в контрольной группе. Данная субпопуляция Т-лимфоцитов способна оказывать супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток [6]. Мишенями цитотоксич-ности Treg могут быть рядом расположенные CD4+-, CD8+-Т-клетки, моноциты, дендритные клетки, антигенп-резентирующие В-клетки. Будучи однажды активированными, Treg не зависят ни от природы антигена, ни от клетки, на которую они оказывают воздействие. Повышение экспрессии рецептора клеточной смерти Fas (CD95) вносит вклад в снижение количества ^eg [4]. Анализ актива-ционного профиля субпопуляций иммунокомпетентных клеток показателен для оценки остроты и выраженности ответной иммунной реакции на воздействие антигена. Оценка активационных процессов в иммунной системе продемонстрировала, что для обследуемых работающих характерен высокий (в 1,5 раза по сравнению с конт-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
рольными значениями) (р<0,05) уровень прироста в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации - СВ25-антиген, что обеспечивает быстрое размножение и последующую дифферен-цировку наивных Т-клеток до зрелых форм в период повышенной гаптенной стимуляции. Решающую роль в регуляции иммунного ответа играет процесс программированной клеточной смерти, запускаемый через так называемые «рецепторы смерти». Данные рецепторы представляют собой трансмембранные гликопротеиды, которые, взаимодействуя со специфическими лиганда-ми, передают апоптотический сигнал в клетку и вызывают активацию каспаз. Значимая роль в регуляции апопто-за отводится таким рецепторам, как CD95+ (Fas) и TNFRI+. У обследуемых основной группы отмечено достоверное снижение маркера Fas-зависимого апоптоза (относительного и абсолютного числа) (р<0,05) на популяции CD3+ в сравнении с показателями, зафиксированными в контрольной группе. Величина экспрессии СD95+-антигена отражает готовность лимфоцитов вступить в апоптоз и включить механизм запрограммированной клеточной гибели по Fas-зависимому механизму. При изучении уровня апоптотической готовности иммуноцитов периферической крови обнаружено статистически значимое уменьшение содержания TNFRI+-лимфоцитов (р<0,05) у работающих в условиях производства по сравнению со среднем уровнем данных показателей в контрольной группе. У обследуемых основной группы наблюдается достоверное понижение уровня белка р53 (р<0,05) относительно значений, зафиксированных в группе контроля. Белок р53 регулирует многие клеточные функции, включая митотический цикл, репарацию поврежденной ДНК, диф-ференцировку клеток и их гибель по типу апоптоза. Концентрация р53 резко повышается при воздействии различных стрессорных факторов. Отмечено, что р53 трансактивирует некоторые киллерные рецепторы, в частности, Fas и KILLER/DR5. Активация р53 дает мощный апоптогенный сигнал, в реализации которого задействованы различные механизмы индукции «эффекторных» каспаз. Пониженный уровень содержания транскрипционного белка р53 в условиях экспозиции фенолами свидетельствует о торможении запрограммированного процесса клеточной гибели. Поскольку форма реакции клетки в ответ на антигенную стимуляцию определяет результативность иммунного ответа, наиболее значимой является оценка активационного апоптоза. В результате оценки реализации программируемой клеточной гибели в аннексиновом тесте были установлены изменения апоптотической реакции лимфоцитарных клеток при повышенном содержании фенолов в биосредах. Анализ иммунограмм выявил статистически значимое снижение уровня апоптотических (Annexin V-FITC+PI) (р<0,05) и некротических (Annexin V-FITC+PI+) (р<0,05) клеток в группе обследуемых основной группы относительно цифр, зарегистрированных в группе контроля. Подобная реакция может быть связана с измененной чувствительностью иммунокомпетентных клеток
к апоптогенным факторам в условиях гаптенной нагрузки.
Выгавлен достоверный положительный коэффициент корреляции между концентрацией фенола в биосредах и количеством клеток, экспрессирующими ранний маркер активации (г=0,24; р<0,05), а также процентным содержанием Treg (r=0,17; р<0,05). Отмечена статистически значимая отрицательная зависимость показателей, характеризующих активационно-индуцированную гибель клетки (CD95+(r=-0,54; р<0,05), р53 (r=-0,56; р<0,05), TNFRI+ (r=-0,57; р<0,05), Annexin V-FITC+PI- (r=-0,44; р<0,05), Annexin V-FITC+PI+ (r=-0,44; р<0,05)) от уровня фенола в крови обследуемых основной группы.
Таким образом, у обследуемой группы изолировщиков в условиях экспозиции фенолами усиление иммунного ответа сопряжено с интенсивныши активационны-ми процессами в иммунной системе, которые сопровождаются выраженным увеличением экспрессии ранних (CD25+) (р<0,05) активационных антигенов на иммуноци-тах и в то же время повышением лимфоцитов (Treg) (р<0,05), оказытающих супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток. Отмечено статистически значимое снижение количества маркеров (CD95+, р53, TNFRI+, Annexin V-FITC+PI-, Annexin V-FITC+PI+) (р<0,05), определяющих клеточную гибель. На фоне повышенной контаминации биосред фенолами направленность апоптотической реакции иммунокомпетентных клеток характеризуется ее угнетением.
Модификация клеточного цикла в условиях повышенного содержания фенолов в воздухе рабочей зоны и биологических средах изолировщиков указывает на наличие связи между функциональным состоянием организма и качеством производственной среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баева, Е. В. Модификация экспрессии Т-клеточных актива-ционныгх маркеров лимфоцитами периферической крови лиц, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях / Е. В. Баева, В. Л. Соколенко, Д. А. Базыжа // Иммунология. - 1999. -№ 1. - C. 54-58.
2. Зайцева, Н. В. Особенности аннексин-зависимого апоптоза у аппаратчиков производства активированным углей / Н. В. Зайцева, О. В. Долгих, Д. Г. Дианова // Связь заболевания с профессией с позиции доказательной медицины: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с международ. участием. 19-20 мая 2011 г. - Казань. 2011. - С. 256-258.
3. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2006 году: гос. докл. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - 360 с.
4. Сорочан, П. П. Регуляторные т-клетки и новые стратегии противоопухолевой иммунотерапии / П. П. Сорочан, И. А. Гро-макова, Н. Э. Прохач // Международ. мед. журн. - 2009. - № 2. -С. 85-90.
5. Ярилин, А. А. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор Foxp 3 / А. А. Ярилин, А. Д. Донецкова // Иммунология. -2006. - № 3. - С. 176-184.
6. Moseman, E. A. Human plasmacytoid dendritic cells activated by CpG oligodeoxynucleotides induce the generation of CD4+CD25+ regulatory T cells / E. A. Moseman [et al] // J. Immunol. - 2004. - Vol. 173. - № 7. - P. 4433-4442.
7. Nilsson, N. Immature B cells in bone marrow express Fas/FasL / N. Nilsson, S. Ingvarsson, C. A. K. Borrebaeck // Scand. J. Immunol. -2000. - № 51. - Р. 279-284.
РЕЗЮМЕ
О. В. Долгих, Д. Г. Дианова, А. М. Гугович
Апоптоз у работающих в условиях экспозиции фенолами
Техногенные химические факторы в условиях производства являются источниками постоянной опасности нарушения здоровья работников различных профессий. При исследовании показателей апоптоза у изолировщиков в условиях экспозиции фенолами отмечались признаки активации иммунной системы и в то же время повышение количества лимфоцитов, оказывающих супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток. Выявлено достоверное снижение количества маркеров, характеризующих апоптотическую гибель клетки. Поступление в организм фенолов
обуславливает развитие иммунных нарушений, в частности, замедление клеточного цикла на стадии апоптоза.
Ключевые слова: лимфоцит, гибель клетки, фенолы.
SUMMARY
O. V. Dolgikh, D. G. Dianova, A. M. Gugouich
Apoptosis in workers exposured to phenols
Technogenic chemical factors have permanent hazardous impact on industrial workers' health. We studied apoptosis indicators in insulation workers who were exposed to phenols, and identified signs of immune activation together with elevated levels of lymphocytes suppressing different types of immunocompetent cells. We evidenced a significant decrease in the number of markers characterising apoptotic cell death. Exposure to phenols may cause development of immune disorders, such as delayed cell cycle at the stage of apoptosis.
Key words: lymphocyte and cellular immunity, cell death, phenols.
© М. В. Дубина, О. Н. Васильев, Т. Д. Федосенко, 2012 г. УДК 616.31:616.9]:575
М. В. Дубина, О. Н. Васильев, Т. Д. Федосенко
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ ДЕСТРУКТИВНЫХ ФОРМ ОДОНТОГЕН-НОЙ ИНФЕКЦИИ
Кафедра хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время не вызывает сомнения, что хронические воспалительные заболевания пародонта - мульти-факториальные заболевания. Основными причинами их развития являются пародонтопатогенные бактерии [17], расстройство микроциркуляции [4]. Возникновению и развитию этой патологии способствуют нарушения иммунитета, наличие фоновой патологии, а также воздействие таких факторов риска, как курение, стресс и т. д. [3].
Отдельным направлением в исследованиях патогенеза заболеваний пародонта является поиск генетических факторов, обуславливающих развитие этой патологии и, в частности, повреждения костной ткани.
По нашему мнению, наиболее перспективными для изучения полиморфизмами генов, ответственных за развитие редукции костной ткани челюстей, являются полиморфизмы гена витамина В (УВЯ), гена коллагена (Со11 а1), гена супероксиддисмутазы (БОВ2).
Полиморфизм Б$т1гена УБЯ. В настоящее время общепризнанным фактом является то, что витамин В и его активные производные - главные компоненты гормональной системы, регулирующие фосфорно-кальциевый об-
мен, участвующие в минерализации костной ткани и в поддержании гомеостаза кальция. Кроме того, они оказывают непосредственное влияние на процессы ремоделирования через ядерный рецептор витамина D (VDR) [2].
В связи с этим полиморфизмы гена VDR связывали с минеральной плотностью костной ткани (МПКТ). Данному вопросу посвящено достаточно много работ, носящих противоречивый характер [18, 21, 23, 24].
По результатам проведенных исследований, связанных с попытками выявить связи между полиморфизмами гена VDR и хроническим пародонтитом, ученые также до сих пор не пришли к единому мнению [6, 13].
Полиморфизм Sp1 гена Collai. Коллаген типа I - главный компонент органического матрикса костной ткани. Он составляет 90-95 % массы всех органических веществ костной ткани. Коллаген I типа альфа I входит в состав костей, сухожилий, связок, кожи и других соединительных тканей.
В 1996 г. Grant et al. было установлено, а в последствии Uitterlinden et al. (1998), Braga et al. (2000) подтвердили, что полиморфизм Sp1 гена Col1a1 связан с развитием остеопороза.
Имеется достаточно много исследований, посвященных связи полиморфизма Sp1rern Col1a1 с остеопоро-зом, с одной стороны, и различных других полиморфизмов с хроническим пародонтитом, с другой. Тем не менее нам удалось найти лишь одну статью, посвященную взаимосвязи полиморфизма Sp1rern Col1 a1 с заболеваниями пародонта.
Так, D. Sakellari et al. (2006) приводят данные о том, что полиморфизмы IL1 a+3954, IL1P+4845, TNFa-308, Col1a1 Sp1 не связаны с развитием хронического пародонтита у греческой популяции. Других данных по взаимосвязи полиморфных аллелей Col1a1 и пародонтита нами не найдено.
Таким образом, в литературе имеются весьма противоречивые данные о связи полиморфизмов Sp1 гена Col1a1 и Bsm1 гена VDR с остеопорозом и хроническим пародонтитом. Поэтому нам представляется перспектив-
