CC BY
66
УДК 663.16; 663.18
Е.Д. Мурзина*, В.Е. Нагаева, С.В. Калёнов
Российский химико-технологический университет им.Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская площадь, дом 9 *Б-шаП: [email protected]
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГАЛОБАКТЕРИЙ НЛЬОБЛСТЕЯШМ 8ЛЬтЛШМ 353П НА СИНТЕТИЧЕСКИХ СРЕДАХ
Синтетические питательные среды для ИаЬЪа^вгшш заНпагыш содержат набор аминокислот, ростовых факторов, макро- и микроэлементов, потребности в которых отличаются для различных штаммов. Минимизация состава сред важна для исследования метаболизма галобактерий с помощью аналитических методов. В настоящей работе для штамма галобактерий И. заНпатш 353П разработана минимальная синтетическая питательная среда для дальнейшего исследования ингибирующих рост галобактерий метаболитов.
Ключевые слова: синтетическая среда, аминокислотная среда, галобактерии, ИаЬЪа^вгшш заНпатш.
Архебактерии Halobacterium salinarum экстремальные галофилы, обитающие в средах, содержащих повышенные концентрации соли и зачастую обедненных кислородом. [1] Биомасса галобактерий используется для выделения различных БАВ: ферменты, галоцины, витамины, нуклеиновые кислоты, липиды, каротиноиды, бактериородопсин. Метаболиты галобактерий находят широкое применение в косметической и фармацевтической промышленности. [2] Однако, процесс культивирования галобактерий является нестабильным из-за ингибирующих веществ, накапливающихся в среде.
В литературе этим метаболитам-ингибиторам не уделяется должного внимания. Исследование их упрощается при использовании синтетических питательных сред. Задача данного исследования заключалась в создании минимальной питательной среды для роста галобактерий Halobacterium salinarum 353П с целью дальнейшей идентификации метаболитов.
В литературных данных имеются исследования по культивированию галобактерий для получения бактериородопсина на жидких средах с высоким содержанием хлорида натрия, в состав которых входят гидролизаты (триптон, пептон) и дрожжевой экстракт. Необходимыми компонентами являются ионы микроэлементов: Mn2+' Zn2+, Fe2+, Cu2+ и др., вносимые в среду в качестве солей. [3, 5] Так в работе Ghasemi и др. [1] для получения высокого выхода бактериородопсина оптимальный состав среды был определен как (г/л): мясной экстракт 10, казаминокислоты 3,75, глицерин 10, кукурузный порошок 50, цитрат Na 1, KCl 6, FeSO/^O 0.2, MnSO4*H2O 0.2, MgSO4 10. Причем воздействия кукурузного порошка и глицерина значительны. Глицерин стимулирует рост клеток Halobacterium salinarum. [1, 4] Однако, компоненты среды содержат загрязняющие белковые продукты, которые могут ингибировать рост культуры. Поэтому целесообразно использовать
синтетическую среду с минимальным содержанием компонентов. [3]
Синтетические среды состоят из отдельных аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов и витаминов и направлены в основном на синтез целевого продукта - бактериородопсина. По литературным данным известно несколько вариантов химически определенных сред, содержащих от 10 до 15 аминокислот, из которых валин, метионин, лейцин и изолейцин (в некоторых вариантах аргинин, лейцин, лизин, валин) необходимы для роста, а остальные стимулируют рост, два нуклеотида (аденозин, уридин), глицерин, а также минеральные компоненты, такие как NaCl, KCl, цитрат Na, MgSO4-7H2O. [5, 6] Однако, при сравнении деления клеток и продолжительности лаг-фазы данная среда, обеспечивающая хороший рост галобактерий, была менее эффективна, чем среда, содержащая дрожжевой экстракт.
Для данного исследования использовали два варианта синтетических сред, взятые из литературных источников: полная аминокислотная среда (ПС) и сокращенная синтетическая аминокислотная среда (СС), на которых культивировали галобактериальный штамм 353П Halobacterium salinarum.
Состав сред. ПС (г/л): D^-аланин 0.43; L-аргинин 0.4; D,L-аспарагиновая кислота 0.45; L-цистеин 0.05; L-глутаминовая кислота 1.3; D,L-гистидин 0.3; D,L-изолейцин 0.44; L-лейцин 0.8; L-лизин 0.85; D,L-метионин 0.37; D^-фенилаланин 0.26; L-пролин 0.05; D^-серин 0.61; D^-треонин 0.5; L-тирозин 0.2; D,L-триптофан 0.5; D^-валин 1.0; NaCl 250; MgSO4*7H2O 20; KCl 2; NH4CI 0.5; KNO3 0.1; KH2PO4 0.05; K2HPO4 0.05; цитрат Na 0.5; MnSO4*2H2O 3*10-4; CaCl2*6H2O 0.065; ZnSO4*7H2O 4*10-5; FeSO4*7H2O 5*10-4;CuSO4*5H2O 5*10-5; глицерин 1.0; биотин 1*10-4; нуклеинат Na 0.3.
СС (г/л): L-аргинин 0.16; L-цистеин 0.02; L-глутаминовая кислота 0.52; D,L-изолейцин 0.176; L-лейцин 0.32; L-лизин 0.34; D,L-метионин 0.148; D,L-валин 0,4; NaCl 250; MgSO4*7^O 20; KCl 2; цитрат Na 3; глицерин 2, нуклеинат Na 0,06
Выращивание проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 100 мл (объем смеси - 50 мл) 7 суток при 36-380С при аэрации на шейкере. Для
количественного сравнения роста вариантов культуры была снята оптическая плотность среды.
Вариант минимальной среды для галобактерий не дал желаемых результатов (рис. 1). Дальнейшая работа заключалась в исключении компонентов среды из ПС, которые могут быть избыточными для выбранного штамма.
Первоначально исключались компоненты в следующей последовательности: химически неопределенный нуклеинат Na, выделенный из дрожжевого экстракта, KNOз (как дополнительный источник азота) и биотин (сложное вещество, использовалось как фактор роста). В таблице 1 представлены оптические плотности (ОП) выращенной культуры.
Таблица 1. Значения ОП выращенной культуры при
измененной ПС
№ Компоненты, Значение ОП,
опыта исключенные из ПС о.е.
1 нуклеинат Na 0,87
2 нуклеинат № и KNO3 0,75
3 нуклеинат KNO3 и биотин 0,68
Оптическая плотность культуры, выращенной на ПС была 0,73 о.е. Удаление нуклеината № положительно отразилось на росте галобактерий, ОП возросла на 19%, а при отсутствии всех трех компонентов ОП упала на 6,85%, что не существенно.
Следующим этапом было постепенное сокращение аминокислот в ПС. Значения оптической плотности приведено в таблице 2.
Рис. 1. Результат культивирования на ПС (а) и на СС (б) Таблица 2. Значения ОП при удалении аминокислот из среды
№ опыта АК, удаленные из ПС Значение ОП, о.е. % изменение ОП при сравнении с ОП полной среды
1 Б,Ь-аспарагиновая кислота 0,64 87,67
2 Б,Ь-аланин 0,32 43,84
3 Ь-цистеин 0,32 43,84
4 Б,Ь-гистидин 0,40 54,80
5 Ь-глутаминовая кислота 0,11 15,07
6 Б,Ь-метионин 0,12 16,44
7 Ь-пролин 0,82 112,33
8 Б,Ь-серин 0,54 73,97
9 Б,Ь-треонин 0,30 41,10
10 Ь-тирозин 0,17 23,29
11 Б,Ь-триптофан 0,67 91,78
12 Б,Ь-изолейцин 0,11 15,07
13 Б,Ь-фенилаланин 0,11 15,07
а
б
Полученные данные позволяют сказать, что D,L-аспарагиновая кислота, L-пролин, D,L-серин и D,L-триптофан стимулируют рост, но не являются необходимыми компонентами, в то время как без остальных аминокислот культура растет слабо. При удалении из среды микроэлементов рост культуры не выявлен.
Результатами работы являются удовлетворительные характеристики роста галобактерий на синтетической АК среде при удалении из нее
следующих компонентов: нуклеината Na, КЫ03, биотина и четырех аминокислот. Оптическая плотность при этих изменениях снизилась на 19% по сравнени ю с ПС. Вариант среды с оптимизированными концентрациями АК позволит более точно определить потребности штамма в питании и поможет в дальнейшем созданию методики выделения метаболитов галобактерий, их определению при помощи методов ВЭЖХ.
Мурзина Екатерина Дмитриевна аспирант 2-го года обучения кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Нагаева Виктория Евгеньевна студент 3 курса кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Калёнов Сергей Владимирович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Mohammad Faezi Ghasemi, Abolfath Shodjai-Arani, Nasrin Moazami Optimization of bacteriorhodopsin production by Halobacterium salinarium PTCC 1685 // Process Biochemistry. - 2008. - № 43. - Р. 1077-1082
2. Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования: диссертация на соискание ученой степени доктора биологии. - Кишинев, 2005.
3. Mosin О., Ignatov I. Biosynthesis of photochrome transmembrane protein bacteriorhodopsin of Halobacterium halobium labeled with deuterium at aromatic amino acids residues of 2,3,4,5,6-2H5]Phe, [3,5-2H2]Tyr and [2,4,5,6,7 -2H5]Trp. // Chemistry and Materials Research. - 2014. Vol.6. № 3.
4. Young S.U., Joon T.P., Sang Y.L., Ho NC. The effects of glycerol and growth conditions on the production of bacteriorhodopsin by halobacterium halobium R1 // Korean J Biotechnol Bioeng. - 1997. № 3. - Р. 309-322.
5. Larsen H. Biohemical aspects of extreme halophilism // Advan.Microbiol. - 1967. Vol l. - Р. 97-132.
6. Jnishi H., McCance M.E., Gibbons N.E. A synthetic medium for extremely halophilic bacteria // Canad.J.Microbiol. - Vol. 1365. № 11. - Р. 365-373.
Murzina Ekaterina Dmitrievna*, Nagaeva Viktoriya Evgenevna, Kalenov Sergei Vladimirovich D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: [email protected]
THE CULTIVATION OF HALOBACTERIUM SALINARUM 353P HALOBACTERIA IN SYNTHETIC MEDIUM
Abstract
Synthetic nutrient medium for Halobacterium salinarum contain a set of amino acids, growth factors, macro - and micronutrients for which requirements are different for different strains. Minimization of the content of the medium is important to study the metabolism of halobacteria using analytical methods. In the present work, for a strain 353П of H.salinarum halobacteria developed a minimal synthetic nutrient medium for further studies inhibiting the growth of halobacteria metabolites.
Key words: synthetic environment, amino acid environment, halobacteria, Halobacterium salinarum.
