CC BY
167
УДК 577.37 + 537.86
О. В. Мосин, канд. хим. наук, науч. сотр.,
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова» И. Игнатов, доктор наук Европейской академии естественных наук (Германия), директор Научно-исследовательского центра медицинской биофизики (Болгария)
Природный фотопреобразуюший наноматериал бактериородопсин из галофильной бактерии Halobacterium halobium 1
Ключевые слова: Halobacterium halobium, бактериородопсин, биомолекулярная электроника, пурпурные мембраны. Key words: Halobacterium halobium, bacteriorhodopsin, biomolecular electronics, purple membranes.
В статье сообщается о микропрепаративном микробиологическом синтезе природного фото-преобразующего белка бактериородопсина (выход — 8-10 мг), способного преобразовывать световую энергию в электрохимическую энергию генерируемых протонов Н+ и АТФ, что важно для наноиндустрии новых современных отечественных фотопреобразующих наноматериа-лов и биомолекулярной электроники. Белок выделен из пурпурных мембран галобактерий На-¡оЬа^егшт На1оЫит лизисом бактериальной биомассы ультразвуком, спиртовой экстракцией низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, с последующим растворением конечного продукта в 0,5 %-м растворе додецилсульфата натрия (ДДС-Ыа) и низкотемпературным осаждением метанолом. Гомогенность и степень очистки синтезируемого бактериородопсина доказаны комбинацией методов выделения и белкового анализа, включая электрофорез в 12,5 %-м полиакриламидном геле с 0,1 %-м ДДС-Ыа и гель-проникающую хроматографию на сефадексе 0-200.
Введение
Бактериородопсин был впервые выделен из клеточной мембраны экстремальной аэробной фото-органогетеротрофной палочковидной галобакте-рии На1оЬас1епит На1оЫит в 1971 году В. Стохени-усом (США) и Д. Остерхельтом (ФРГ) [1]. Он представляет собой хромопротеид с молекулярной массой 26,7 кДа, связанный альдиминной связью с остатком
Работа осуществлялась при финансовой поддержке Научно-исследовательского центра медицинской биофизики (Болгария), грант № 012.
лизина-216, который содержит в качестве хромо-формной группы эквимолекулярную смесь 13-цис-и полностью 13-транс-ретинольного С20-кароти-ноида — аналога витамина А, определяющего пурпурно-красный цвет галобактерий. Наряду с бак-териородопсином в клеточной мембране галофилов содержатся другие сопутствующие каротиноидные пигменты, основной из которых бактериоруберин, обусловливающий окраску галобактерий от розового до красного и красно-оранжевого цветов, что имеет важное значение для галофилов как средство защиты против избыточной радиации и солнечного излучения, так как для мест их обитания характерна высокая освещенность.
Несмотря на изученность структуры и функций бактериородопсина, он остается в центре внимания био- и нанотехнологии прежде всего благодаря своей высокой светочувствительности и разрешающей способности и используется в молекулярной биоэлектронике как природный фотохромный материал для управляемых светом или электрическими импульсами модулей компьютерных и оптических систем [2]. Кроме того, бактериородопсин очень привлекателен как модельный объект для исследований, связанных с изучением функциональной активности и структурных свойств фотопреобразующих мембранных белков в составе искусственных нативных энерго- и фотопреобразующих мембран [3].
Природные фотопреобразующие наноматериалы также представляют большую ценность для коммерческой нано- и биотехнологии, микроэлектроники, биофотоники, а также биофизических исследований на их основе [4]. Например, бактериородопсин-содержащие нанопленки, полученные с использованием пурпурных мембран галобактерий, используются в качестве компонента в биомолекулярной электронике, использующей биоматериалы и принципы переработки информации биологиче-
14
Основы биомединженерии
скими объектами в вычислительной технике для создания электронных устройств. Впервые в мире такие пленки на основе молекул бактериородопсина были получены и исследованы в нашей стране в рамках проекта «Родопсин», в ходе которого была продемонстрирована эффективность и перспективы использования наноматериалов «Биохром» в качестве фотохромных материалов для голографической записи и микроэлектронных устройств [5]. Эти на-номатериалы обратимо изменяют свою структуру в ответ на физические воздействия и генерируют два дискретных состояния, поддающихся измерению спектральными методами. Это определяет их дальнейшее использование в качестве логических вычислительных систем в биомолекулярной электронике. Так, на основе бактериородопсина был сконструирован фоторецептор с микроэлектродом из 8п02, состоящий из 64 ячеек (пикселей), размером 2,5 х 2,5 мм и напряжением 0,3-0,7 В. Для преобразования сигналов в данном фоторецепторе слабый ток элементов (3-10 нА) усиливается до достижения значения напряжения от 1 до 10 В и затем подается на светоизлучающие диоды. Данная конструкция свидетельствует о возможности эффективной интеграции бактериородопсина в современные микроэлектронные системы.
Основной задачей при изготовлении бактерио-родопсинсодержащих нанопленок является ориентация пурпурных мембран между гидрофобными и гидрофильными средами, например между водой и воздухом, как это распространено в природе. Как правило, для улучшения характеристик бак-териородопсинсодержащих пленок, используется несколько слоев пурпурных мембран, которые наносятся на поверхность полимерного носителя — подложки и высушиваются в определенных условиях с сохранением своей природной структуры. Подложка, на которой сформирован препарат, может быть изготовлена из натуральных и синтетических полимеров, гидрогелей, стекла, керамики, металлов и быть электропроводящей, многослойной, нести на себе функциональные подслои и т. д. Наилучшие показатели достигаются при изготовлении нанопленок на основе желатина. Это позволяет добиться высокой концентрации бактериородопсина (до 50 масс. %) в нанопленках, избежать агрегации фрагментов пурпурных мембран, а также разрушения бактериородопсина в процессе изготовления. Встроенные в желатиновую подложку фрагменты пурпурных мембран с бактериородопсином долговечны (время жизни ~104 ч) и устойчивы к воздействию многих факторов как при изготовлении, так и в процессе эксплуатации (колебания температуры, интенсивное воздействие светом с помощью лазера и др.). При высыхании пурпурные мембраны укладываются друг на друга, ориентируясь в плоскости подложки. Слой высохших мембран толщиной 1 мкм содержит около 200 монослоев. При освещении в таких сухих пленках регистри-
руется фотопотенциал 100-200 мВ, что совпадает с величиной мембранного потенциала живой клетки.
Большой научно-практический интерес к получению препаратов бактериородопсина для реконструкции нанопленок, определил цель настоящей работы, связанной с разработкой условий выращивания галобактерий ИаЬоЪасЬегЬит НаЬоЫит и оптимизаций условий выделения чистого бактерио-родопсина в микропрепаративных количествах.
Структура и механизм функционирования бактериородопсина
По своей структуре и расположению в мембране клетки бактериородопсин относится к интегральным трансмембранным белкам (рис. 1), пронизывающим всю толщу клеточной мембраны, которая подразделяется на три фракции: желтую, красную и пурпурную. Содержащая бактериородопсин пурпурная фракция образует естественные двумерные кристаллы, которые можно исследовать с помощью электронной микроскопии и дифракционных ме-
Цитоплазма
вконец
Рис. 1
Расположение белковой части молекулы бактериородопсина и остатка ретиналя в клеточной мембране галобактерии ИаЬоЪа^епит НаЬоЪЬит по данным компьютерного моделирования: белковые фрагменты молекулы бактериородопсина в виде семи пронизывающих клеточную мембрану а-спиральных сегментов обозначены латинскими буквами; темным цветом обозначены сегменты, ответственные за связывание остатка ретиналя в молекуле бактериородопси-на с белковой частью молекулы
Основы биомединженерии
тодов анализа — рассеивания рентгеновского излучения, электронов и нейтронов на поверхности кристаллов пурпурных мембран. Этими методами было доказано существование в молекуле бактериородопсина семи спиральных белковых сегментов, в середине которых симметрично расположена хромофорная часть молекулы в виде остатка ретиналя.
Полипептидная цепь бактериородопсина состоит из 248 аминокислотных остатков, 67 % которых являются гидрофобными [3], а 33 % — гидрофильными остатками аспарагиновой и глу-таминовой кислот, аргинина и лизина (рис. 2, а). Эти остатки играют важную структурно-функ-
а)
циональную роль в пространственной ориентации а-спиральных сегментов молекулы бактериоро-допсина, которая организована в пурпурной мембране упорядоченно в виде тримеров со средним диаметром около 0,5 мкм и толщиной 5—6 нм; каждый тример окружен шестью другими так, что образуется правильная гексагональная кристаллическая решетка (рис. 2, б). Отдельная молекула бактериородопсина состоит из семи находящихся в конформации а-спирали сегментов, расположенных в направлении, перпендикулярном плоскости цитоплазматической мембраны (рис. 2, в). Гидрофобные домены представляют собой трансмембран-
Рис. 2
Структура молекулы бактериородопсина по данным дифракционного анализа: а — первичная структура молекулы бактериородопсина;
аминокислоты обозначены латинскими символами, кружками и ромбами показаны функционально важные аминокислоты — LYS, ARG, ASP и GLU, ответственные за пространственную ориентацию а-спиральных сегментов белковой части молекулы и формирование каналов для транслокации протонов H+ через клеточную мембрану;
6 — карта электронной плотности пурпурных мембран (в центре обведена отдельная молекула белка); цифрами 1—7 обозначены а-спиральные сегменты молекулы бактериородопсина:
1 —A-сегмент; 2 — B-сегмент; 3 — C-сегмент; 4 — D-сегмент; 5 — E-сегмент; 6 — F-сегмент;
7 — G-сегмент;
в — пространственная структура молекулы бактериородопсина: 1 — A-сегмент; 2 — B-сегмент; 3 — C-сегмент; 4 — D-сегмент; 5 — E-сегмент; 6 — F-сегмент; 7 — G-сегмент
ные сегменты, а гидрофильные домены выступают из мембраны и соединяют отдельные внутримем-бранные а-спиральные сегменты белковой части молекулы бактериородопсина. Наряду с бактерио-родопсином пурпурные мембраны содержат липи-ды, каротиноиды и воду [6]. Пурпурные мембраны устойчивы к солнечному свету, воздействию кислорода, температуре более чем 80 о0 (в воде) и до 140 ос (на воздухе), рН от 1-12, высокой концентрации МаС1 (15-20 масс. %), действию большинства ферментов-протеаз, чувствительны к смесям полярных органических растворителей с водой, но устойчивы к неполярным растворителям типа гексана. Эти факторы имеют большое практическое значение для встраивания пурпурных мембран в полимерные наноматрицы с сохранением фотохимических свойств.
Бактериородопсин выполняет в клетке галофи-лов функции светозависимого протонного насоса, перекачивающего протоны через мембрану клетки и создающего электрохимический градиент протонов Н+ на поверхности клеточной мембраны, энергия которого используется клеткой для синтеза АТФ в анаэробном фотосинтетическом фосфори-лировании. Этот механизм синтеза АТФ получил название «бесхлорофильный фотосинтез» в отличие от реализуемого растениями фотосинтеза с участием хлорофилла. В этом механизме при каждом поглощении молекулой кванта света бактериоро-допсин обесцвечивается, вступая в цикл фотохимических превращений, в результате происходит высвобождение протона на внешней стороне мембраны и поглощение протона из внутриклеточного пространства. Вследствие этого между внутренней и наружной сторонами цитоплазматической мембраны устанавливается градиент концентрации протонов Н+ [7].
Механизм последующего переноса Н+ посредством молекулы бактериородопсина через мембрану клетки включает цепь водородных связей, образованных боковыми радикалами гидрофильных аминокислот и простирающихся через всю толщу белка. Перенос Н+ через цепь осуществляется в том случае, если она состоит из двух участков и содержит функциональную фотохромную группу, способную под воздействием кванта света изменять свое микроокружение и тем самым последовательно соединять и разъединять участки связывания и переноса Н+ через клеточную мембрану. Роль такого переносчика между двумя белковыми проводниками Н+, один из которых сообщается с внешней, а другой — с цитоплазматической поверхностью мембраны клетки, играет ретиналь, связанный альдиминной связью (как в зрительных пигментах животных) с остатком лизина-216 белкового фрагмента молекулы бактериородопсина. Ретиналь имеет 13-транс-конформацию и располагается в мембранном туннеле между белковыми а-сегментами, блокируя поток протонов.
При поглощении кванта света происходит обратимая световая фотоизомеризация 13-^-БР (^тах = = 548 нм) в а11-Е-БР (^тах = 568 нм) [8], инициирующая каскад быстрых фотохимических реакций продолжительностью от 3 миллисекунд до 1 пико-секунды, с образованием промежуточных интерме-
диантов J625, К590, L550, М412, N560 и °640 (цифры в нижнем индексе обозначают положения максимума поглощения интермедиаторов фотоцикла, нм) с последующим отрывом Н+ от ретинального остатка бактериородопсина и его присоединением со стороны цитоплазмы (рис. 3). В этом процессе молекула ретиналя изгибается в мембранном туннеле, формируя канал трансмембранного переноса протонов из цитоплазмы во внешнюю среду, и переносит протон Н+ с внутренней цитоплазматической мембраны на внешнюю мембрану клетки. При этом протон из ретинального остатка переносится на остаток Асп-85, после чего образовавшаяся вакансия заполняется протоном, перешедшим с Асп-96. В результате между внутренней и внешней поверхностью мембраны образуется градиент концентрации Н+, приводящий к тому, что при освещении
Рис. 3
Схема фотохимического цикла молекулы бактериородопсина (водная суспензия, рН 7,2, 20 °С). Латинские буквы J, К, Ь, М, Ы, О обозначают спектральные интермедианты бактериородопсина. ХМ и ПМ обозначают спектральные интермедианты мета бактериородопсина с протонированной и депротонированной альдиминной связью. Верхние индексы с и £ относятся к циклам 13-цис- и 13-транс-производных бактериородопсина (БР), Ь и Б обозначают световую и темновую формы бактериородопсина. Нижние индексы соответствуют положению максимума поглощения интермедиаторов фотоцикла, нм. Символами 13^ и а11-Е показаны изомеры бактериородопсина; Ни — квант света. Продолжительности реакций измерены в мс (миллисекундах), мкс (микросекундах) и пкс (пикосекун-дах)
светом клетки начинают синтезировать АТФ, то есть преобразуют энергию света в химическую энергию связей. Этот процесс обратим и в темноте протекает в обратном направлении, когда бактериородопсин самопроизвольно возвращается в исходную форму [9]. Таким образом, молекула бактериородопсина ведет себя как фотохром-ный переносчик с малым временем релаксации — перехода из возбужденного состояния в основное. Оптические и динамические характеристики бактериородопсина изменяются в зависимости от условий получения пурпурных мембран и состава полимерной матрицы.
Биосинтез бактериородопсина
Технология получения бактериородопсина заключается в культивировании галобактерий на жидких синтетических средах (с 15-20 масс. % NaCl), содержащих аминокислоты, или на природных средах с пептонами — смесями полипептидов и аминокислот, получаемыми из продуктов неполного гидролиза сухого молока или мяса животных под действием протеолитических ферментов (пепсин, трипсин), или на белково-витаминном концентрате (БВК) дрожжей, с последующим выделением бакте-риородопсина из пурпурных мембран клеток комбинацией методов физико-химического разделения.
Для биосинтеза бактериородопсина использовали мутантный каротиноидсодержащий штамм экстремальных фотоорганогетеротрофных галобакте-рий Halobacterium halobium ET 1001, полученный из коллекции культур МГУ. Штамм модифицирован селекцией отдельных бактериородопсин-син-тезирующих колоний пурпурно-красного цвета на твердой (2 %-й агар) пептоновой среде с 4,3 М NaCl. Полученный селекцией штамм галобактерий культивировали в жидкой комплексной синтетической среде (количества компонентов приведены в г/л), содержащей:
• 18 аминокислот: DL-аланин — 0,43; L-арги-нин — 0,4; D,L-аспарагиновая кислота — 0,45; L-цистеин - 0,05; L-глутаминовая кислота — 1,3; L-глицин — 0,06; D.L-гистидин — 0,3; D.L-изо-лейцин — 0,44; L-лейцин — 0,8; L-лизин — 0,85; D.L-метионин — 0,37; D.L-фенилаланин — 0,26; L-пролин — 0,05; D.L-серин — 0,61; DL-трео-нин — 0,5; L-тирозин — 0,2; D.L-триптофан — 0,5; DL-валин — 1,0 г/л;
• нуклеотиды: аденозин-5-монофосфат — 0,1; уридин-5-монофосфат — 0,1 г/л;
• соли: NaCl — 250; MgSO4 7H2O — 20; KCl — 2,0; NH4Cl — 0,5; KNO3 — 0,1; KH2PO4 — 0,05; K2HPO4 — 0,05; Na+^итрат — 0,5; MnSO4 • 2H2O —
3 x 10-4; CaCl2 • 6H2O — 0,065; ZnSO4 • 7H2O —
4 x 10-5; FeSO4 • 7H2O — 5 x 10-4; CuSO4 • 5H2O —
5 x 10-5 г/л;
• глицерин — 1,0 г/л;
• ростовые факторы: биотин — 1 х 10 4; фо-лиевая кислота — 1,5 х 10-4; витамин Bi2 — 2 х10-5 г/л.
Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси — 100 мл) 3—4 сут при 35—37 °С в условиях интенсивной аэрации (расход воздуха — 0,5—2,0 л/мин на 1 л среды) в орбитальном шейкере 380-S (Biorad, Венгрия) и освещении монохромными люминисцентными лампами ЛДС-40-2 (40 Вт) (ООО «Альфа-Электро», Россия) (3 лампы освещенностью 1,5 лк). Бактериальный рост изучали по оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при длине волны X = 620 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (Beckman Coulter, США). Процедура выделения бактериородоп-сина из пурпурных мембран галобактерий и все последующие стадии выделения и очистки белка производились с использованием светозащитной лампы, снабженной оранжевым светофильтром ОРЖ-1Х (75 х 50 см) (Marbel, Германия).
В оптимальных условиях выращивания гало-бактерий, показанных на рис. 4, 2, относительно контроля (рис. 4, 1) на пептоновой среде в клетке синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 = 1,5 : 1,0 полностью идентичный природному бактериородопсину. Как показали результаты исследования, рост галобактерий Halobacterium halobium на комплексной синтетической среде (рис. 4, 2) ингибировался незначительно по сравнению с контролем (рис. 4, 1) на пептоновой среде, что существенно упрощает и удешевляет оптимизацию условий биосинтеза бактериородопсина, которые заключаются в культивировании галобактерий
D620 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
10
20 30 40 50 60
Время выращивания, ч
70
80
Рис. 4
Динамика роста галобактерии Halobacterium halobium, измеренная по оптической плотности клеточной суспензии при X = 620 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (Beckman Coulter, США) в различных экспериментальных условиях: пептоновая среда (1), комплексная синтетическая среда (2). Условия выращивания: период инкубации — 4-5 сут при 35 °С, освещение монохромным, светом с длиной волны X = 560 нм. В качестве контроля использовали пептоновую среду
биотехносфера
| № 5-6(23-24)
в синтетическои среде при освещении монохромным светом с длиноИ волны X = 560 нм в течение 4-5 сут при 35 °С. Существенным преимуществом является то, что в отличие от пептоновоИ среды синтетическая среда не содержит в своем составе загрязняющих белковых продуктов, которые могут усложнить последующее выделение и очистку бактериородопсина.
Выделение и очистка бактериородопсина
Основными этапами получения бактериородопсина являлись:
• выращивание галобактериИ ИаЬоЪа^егЬит НаЬоЫит на синтетической среде;
• дезинтеграция клеток и лизис клеточных стенок;
• выделение фракции пурпурных мембран;
• очистка пурпурных мембран от низко- и высокомолекулярных примесеИ, клеточноИ РНК, каротиноидов и липидов;
• растворение пурпурных мембран в 0,5 %-м растворе ионного детергента додецилсульфата натрия (ДДС-Ма) с образованием микроэмульсии;
• осаждение бактериородопсина из микроэмульсии метанолом;
300 400 500 600 700
Диапазон длин волн, нм
Рис. 5
Спектры поглощения суспензии пурпурных мембран в 50 %-м растворе этанола (в Н2О), измеренные на спектрофотометре Беектап Би-в, на различных стадиях обработки: природный бактериородопсин (а); пурпурные мембраны после промежуточной обработки (б); очищенные от посторонних каротиноидов пурпурные мембраны (в). Полоса 1 соответствует основной спектральной форме бактериородопсина БР5в8;
2 — примесь спектральной формы мета бактериородопсина М412', 3 — общая полоса поглощения ароматических аминокислот; 4, 5 — посторонние кароти-ноиды. В качестве контроля использовали природный бактериородопсин
• гель-проникающая хроматография (ГПХ) на сефадексе 0-200;
• электрофорез в 12,5 %-м полиакриламидном геле (ПААГ) с 0,1 %-м ДДС-Ш.
Поскольку выделяемыИ белок локализуется в пурпурных мембранах, освобождения от низкомолекулярных примесеИ и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированноИ водоИ на холоде после удаления 4,3 М МаС1 и последующим разрушением клеточноИ оболочки ультразвуком с частотоИ 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената ферментом РНК-азоИ I (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточноИ РНК. В результате получаются фрагменты пурпурных мембран, содержащих бактериоро-допсин. Поскольку фракция пурпурных мембран наряду с выделяемым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативноИ структуры и диссоциации ретинального остатка. Это существенно усложняло задачу выделения индивидуального бактериородопсина с применением методов декаротини-зации и делипидизации (удаления каротиноидов и липидов), а также очистки и колоночноИ ГПХ на сефадексе. Декаротинизация, заключающаяся в многократноИ обработке суспензии пурпурных мембран 50 %-м этанолом при 4 °С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50 %-м этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) пурпурных мембран (степень хроматографическоИ чистоты — 80-85 %), показанного на рис. 5 на различных стадиях обработки (б) и (в) относительно природного бактериородопсина (а). Образование 13-ретиналь-протеинового комплекса в молекуле бактериоро-допсина приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения пурпурных мембран (рис. 5, в) — основная полоса (1) при максимуме поглощения X = = 568 нм, вызванная световоИ изомеризациеИ хромофора по С13 = С14-кратноИ связи определяется наличием 13-транс-ретинального остатка в основноИ спектральноИ форме БР568, дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при X = 412 нм характеризует незначительную примесь образующеИся на свету спектральноИ формы мета бактериородопсина М412 с депротонированноИ альдиминноИ связью между остатком 13-транс--ретиналя и белком, а общая полоса (3) при X = 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) в полипептидноИ цепи белка (для чистого бактериородопсина соотношение поглощениИ 0280/^568 равно 1,5 : 1,0). Для лучшего результата данныИ метод биосинтеза бактериородопси-на позволяет контролировать содержание ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина и
триптофана — в ростовой среде штамма-продуцента, добавляемых в количествах 0,26; 0,20 и 0,50 г/л.
Фракционирование и тщательная хроматогра-фическая очистка белка являлись следующим необходимым этапом. Поскольку бактериородопсин, будучи трансмембранным белком, пронизывает билипидный слой в виде семи а-сегментов, применение сульфата аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата при выделении белка. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму за счет коллоидного растворения (солюбили-зации) полученной фракции пурпурных мембран в 0,5 %-м растворе ДДС-Ма с последующим низкотемпературным осаждением из них белка метанолом. Использование в качестве ионного детергента ДДС-Ма диктовалось необходимостью максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и осаждения в нативном (с сохранением природной конфигурации) виде, поскольку солюбилизированный бактериородопсин сохраняет спиральную а-конфигурацию. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей — ацетона, метанола и хлороформа — для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование белка и уменьшающую его потери при выделении. Значительным преимуществом метода является то, что целевой белок в комплексе с молекулами ли-пидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а другие высокомолекулярные примеси и остатки клеточных мембран — в непрореаги-ровавшем осадке, легко отделяемом центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0,5 %-м ДДС-Ма белка с его последующим выделением в кристаллическом виде проводилось в три стадии дробным осаждением метанолом при —5 ос, с уменьшением концентрации детергента от 0,5 до 0,2 и 0,1 % соответственно. Кристаллический белок (8-10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 х 1 мл) и осаждали центрифугированием (1200 g, 15 мин).
Окончательная стадия очистки бактериородоп-сина заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом ГПХ, для чего бактериородопсинсодержащие фракции дважды пропускали через колонку (150 х 10 мм) с декстра-новым сефадексом 0-200 (РЬагтас1а, США) (размер гранул — 40—120 мкм). Колонку уравновешивали буферным раствором, содержащим 0,1 %-й ДДС-Ма и 2,5 мМ раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты. Пробу белка растворяли в 100 мкл буферного раствора и элюировали 0,09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0,5 М МаС1 с рН 8,35 (ионная сила растворителя I = 0,075 моль/л) со скоростью 10 мл/см2 • ч. Содержание белка в отобранных пробах определяли спектрофотометрически по соотношению поглощений 0280/0568 (молярные
коэффициенты светопоглощения при длинах волн X = 280 и 568 нм: е280 = 1,1 . 105 M-1 . см-1 и е568 = = 6,3 . 104 M-1 . см 1). Объединенные белковые фракции подвергали вакуумной сублимационной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 х 50 мм) и хранили в морозильной камере холодильника при -15 °С.
Идентификацию бактериородопсина проводили электрофорезом в 12,5 %-м ПААГ с 0,1 %-м ДДС-Na в соответствии с протоколом фирмы LKB (Швеция). Количественное определение содержания белка выполняли сканированием прокрашенного в растворе индикатора «кумасси-голубой R-250» электрофоретического геля на лазерном денситометре Beckman CDS-200 (Beckman Coulter, США).
Конечную идентификацию бактериородопсина проводили регенерацией свободных от ретиналя апомембран с 13-транс-ретиналем. Для получения апомембран суспензию пурпурных мембран (50 мг) в 50 мл 1 М NH2OH (pH 6,0) выдерживали 10 ч при перемешивании на ледяной бане (4 °С) при освещении реакционной смеси ксеноновой лампой ДКСТВ-6000 (ОАО «МЭЛЗ», Россия). Осадок отделяли центрифугированием (1000 g, 10 мин), дважды промывали дистиллированной водой и центрифугировали. Фракцию апомембран суспендировали в 2 мл 5 мМ 2-(^морфолино)-этансульфонилами-да в 100 мМ NaCl. Для регенерации апомембран с 13-транс-ретиналем к 2 мл суспензии апомем-бран (2 . 10-5 М) в кварцевой кювете (10 х 10 мм) добавляли при перемешивании 0,1 мл 2 мМ раствора 13-транс-ретиналя в метаноле и выдерживали 6-8 ч в темноте при 40 °С. Степень регенерации определяли спектрофотометрически по соотношению ^Онат.280:°нат.568/:0рег.280:0рег.568, где D280 и D568 — поглощение суспензии нативных и регенерированных апомембран при длинах волн 280 и 568 нм соответственно.
Выводы
Разработанный метод биосинтеза бактериородоп-сина свидетельствует о достаточно высоких выходах синтезируемого продукта. В результате получено 8-10 мг чистого бактериородопсина из 1 г бактериальной биомассы галобактерий, гомогенность, степень очистки и структура которого удовлетворяют требованиям, предъявляемым для конструкции нанопленок и искусственных мембран на основе бактериородопсина. Для обеспечения более высоких выходов бактериородопсина необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы, этого можно легко достичь в лабораторных условиях. Главным достоинством метода является то, что выделенный данным способом бактериородопсин сохраняет природную конфигурацию и способность к фотохимическим превращениям in vitro, что важно для дальнейшего использования полученных образцов
Основы биомединженерии
бактериородопсина для конструирования бактерио-родопсинсодержащих фотопреобразующих пленок.
| Литература |
1. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium // Nature. 1971. Vol. 233, N 89. P. 149-160.
2. Hampp N., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin and its Potential in Technical Applications // Nanobiotechnology / Eds. Ch. Niemeyer, C. Mirkin. Weinheim: Wiley-VCH-Verlag, 2004. P. 146-167.
3. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А. и др. Получение бактериородопсина H. halobium, меченного дейтерием по остаткам ароматическим аминокислот фенилаланина, тирозина и триптофана // Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.
4. Molecular electronics and hybrid computers // Wiley Encyclopedia of Electrical and Electronics Engineering / Eds.
5.
6.
7.
B. W. Vought, R. R. Birge. New York: Wiley-Interscience, 1999. P. 477-490.
Lanyi J. K. Understanding structure and function in the light-driven proton pump bacteriorhodopsin // Journal of Structural Biology. 1998. Vol. 124. P. 164-178. Grigorieff N. Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin // Journal of Molecular Biology. 1996. Vol. 259. P. 393-421.
Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin as an example of a light-driven proton pump // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1976. Jan. Vol. 15, N 1. P. 17-24.
Haupts U., Tittor J., Bamberg E. et al. General concept for ion translocation by halobacterial retinal proteins: the Isomerization/switch/transfer (1ST) model // Biochemistry. 1997. Vol. 36, N 1. P. 2-7.
Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Pshenichnikova A. B.
et al. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin // 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. Leiden: Leiden University Press, 1994. P. 115-116.
(Г
Л
ОАО «Издательство "ПОЛИТЕХНИКА"
предлагает:
П. И. Бегун
БИОМЕХАНИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ПРОТЕЗИРОВАНИЯ Учебное пособие
ISBN 978-5-7325-0914-4 Объем 464 с. Формат 60x90 1/i6 Тираж 1000 экз. Цена 410 руб.
Учебное пособие разработано в соответствии с государственными образовательными стандартами высшего образования по подготовке дипломированных специалистов по направлению 200400 (653900) «Биомедицинская техника» по специальностям 200401 (190500) «Биотехнические и медицинские аппараты и системы», 200402 (190600) «Инженерное дело в медико-биологической практике» и бакалавров и магистров 200300 (553400) «Биомедицинская инженерия».
Пособие служит основой для изучения смежных дисциплин, способствует установлению междисциплинарных связей и формирует навыки системного подхода к постановке и решению прикладных задач.
Для приобретения книги по издательской цене обращайтесь в отдел реализации:
Тел.: (812) 312-44-95, 710-62-73; тел./факс: (812) 312-57-68;
e-mail: [email protected], [email protected], через сайт: www.polytechnics.ru
Возможна отправка книг «Книга—почтой».
Книги рассылаются покупателям в России наложенным платежом (без задатка).
Почтовые расходы составляют 40 % и выше от стоимости заказанных Вами книг.
Jf
№ 5-Б(23-24)/2012 |
биотехносфера
