CC BY
12
УДК 632.2.082.591.15.16
Шаран М. М. ©
1нститут бюлогп тварин УААН, м. Львгв, (mm [email protected])
КР1ОПРОТЕКТОРН1 ВЛАСТИВОСТ1 ХОЛЕСТЕРОЛУ ПРИ НАДШВИДКОМУ ЗАМОРОЖУВАНН1 ЕМБР1ОН1В
Наведено дат про крюзахисш властивост1 ргзних форм холестеролу (лтолеат, олеат i стеарат) при додавант гх у середовища для надшвидкого заморожування ембрютв мишей i корiв. Встановлено, що введення лтолеату i олеату холестеролу у втрифтацтне середовище у концентращях 1,01,5 мг/мл знижуе ктьтсть морфологiчно пошкоджених клтин тсля деконсервування на 10,0-18,2 %, що тдтверджуеться високим показником збереження деконсервованих ембрютв (понад 80,0 %), а також тдвищуе гх приживлення на 7,2-12,7 %.
Ключовi слова: крюконсервування, ембрюн, лтолеат, олеат, стеарату холестеролу, надшвидке заморожування, втрифжацтне середовище
Вступ. Новим i перспектившшим методом крюконсервування ембрюшв е !х надшвидке заморожування у рщкому азот в середовищах з високими концентращями проникаючих крiпротекторiв. При цьому через сильне пщвищення в'язкост розчишв цитоплазма ембрюшв разом з висококонцетрованими розчинами переходить у твердий склоподiбний стан без кристалiзацii, тобто вони вггрифжуються [1, 2].
Головним мкцем крюпошкоджень е цитоплазматична мембрана та специфiчнi лшщи в нш. Чутливкть мембран ембрюшв до крюпошкоджень визначаеться композищею фосфолшвдв та холестеролом i ix сшввщношенням [3]. Ембрюни з високим сшввщношенням холестерол: фосфолшщи (кролик, людина) стiйкiшi до крюпошкоджень, шж з низьким спiввiдношенням (бугай, кнур, жеребець, баран) [4, 5].
Оскшьки заморожування статевих кл^ин викликае втрату мембранами холестеролу [6], ми виршили застосувати рiзнi форми холестеролу для стабшзаци спiввiдношення холестерол: фосфолшщи у мембранах ембрюшв.
Метою дано! роботи було дослщження ефективност ди рiзниx форм холестеролу при додаванш !х до середовищ для надшвидкого заморожування ембрюшв мишей i корiв.
Матер1ал i методи. Матерiалом для дослщжень слугували ембрiони велико! рогато! худоби та мишей. Ембрюни мишей отримували вщ самок бiлиx безпородних мишей, вирощених в умовах вiварiю 1нституту бiологi! тварин УААН. Вс процедури з мишами проводили за стандартними методиками [7].
Дослщи на ембрюнах велико! рогато! худоби проводили у ТзОВ «Городище» Луцького району Волинсько! области якi одержували вщ корiв
© Шаран М.М., 2009
190
укра!нсько! чорно-рябо! молочно! породи bíkom 4-7 pokíb. Bw6ip i пiдготовку корiв-донорiв проводили за загальноприйнятими методами, полiовуляцiю iндукували використанням фолжулостимулюючого гормону «Фолжотротн» (Чехiя) за 4-денною схемою [8]. Оцiнку якост ембрiонiв 7-8-денного BiKy визначали за морфолопчними ознаками з врахуванням стади !х розвитку [9].
Ембрiони тсля промивання в культуральному середовищi вщ механiчного забруднення помiщали в еквшбрацшне середовище яке складалося з 10 % глщерину (1,4 М), експозищя 7-10 хв i переносили на 60 секунд у в^рифкацшне середовище.
При заморожуванш ембрiонiв мишей дослщних груп до вiтрифiкацiйного середовища додавали рiзнi форми холестеролу (Cholesteryl linoleat 17112 , Cholesteryl oleat 17121, Cholesterol stearat 17124, Serva). Дози холестеролу пщбирали емпiрично враховуючи л^ературт данi вiд 0,5 до 2.0 мг/мл середовища в 1-4 дослщних групах кожно! форми холестеролу вщповщно [6, 10].
Контролем слугували нативш ембрiони мишей, якi зразу тсля вимивання культивували 24-48 годин при температyрi 38°С. Життездатними вважали ембрюни, якi розвинулись в кyльтyрi до стади тзньо! бластоцисти.
При заморожуванш ембрюшв велико! рогато! худоби дослщних груп до в^рифкацшного середовища додавали вказаш форми холестеролу у концентращях, якi проявили високий вiдсоток збереження ембрюшв мишей. Контрольну групу ембрюшв велико! рогато! худоби заморожували методом в^рифкаци без додавання холестеролу.
Розморожування ембрюшв мишей проводили на повiтрi при температyрi 18-22°С i розмщали в 0,5 М розчин сахарози на 10 хвилин. Шсля 24-48-годинного культивування ембрiони, якi досягли стади тзньо! бластоцисти, вважали життездатними.
Виведення крiопротекторiв з деконсервованих ембрюшв велико! рогато! худоби проводили в двох розчинах по 5 хвилин. Перший розчин мктив 5 % глщерину i 0,5 М сахарозу. Друге середовище складалося з 0,25 М сахарози i мктило: води бщистильовано! — 1,5 мл, маточний розчин — 3,5 мл, середовище МЕМ — 15 мл.
Надалi ембрюни багаторазово промивали в культуральному середовища яке складалося з ФБС Дюльбекко та 0,4 % БСА i заправляли в пайети i трансплантували телицям-рецитентам нехiрyргiчним методом [8].
Життездатшсть деконсервованих ембрюшв велико! рогато! худоби визначали за результатами !х приживлення ректальним дослщженням статевих оргашв рецишенив через 2 мкящ тсля трансплантаци.
Результати дослщження. Застосування Cholesteryl linoleat i Colesteryl oleat суттево зменшило кiлькiсть ембрiонiв мишей з грубими морфологiчними пошкодженнями тсля деконсервування. Оптимальною дозою лшолеату холестеролу е 1 мг/мл середовища. При цьому кшькють розморожених ембрюшв iз значними пошкодженнями бластомерiв зменшилася порiвняно з контролем на 18,2 % i становила 9,1 %. Низью показники морфолопчних
191
пошкоджень ембрюшв одержали i при додаванш олеату холестеролу у дозi 1,5 мг/мл середовища — 16,7 %, що на 13,3 % менше, нiж у контроле
Протилежнi результати розморожування отримали при застосуваннi стеарату холестеролу. Збшьшення дози холестеролу вiд 0,5 до 2,0 мг/мл середовища тдвищувало кшьккть деконсервованих ембрiонiв iз значними дефектами бластомерiв вiд 22,2 до 33,3 %.
Вказаш пошкодження кл^инно! маси визначили результатившсть культивування розморожених ембрюшв i 1х збереженiсть. Найвищу збережешсть ембрiонiв (90,0 %) спостерiгали при додаванш холестеролу лшолеату у дозi 1,0 мг/мл (рис. 1). Аналопчш показники збереженостi деконсервованих ембрiонiв мишей пiсля культивування одержали при використанш холестеролу олеату у дозi 1,5 мг/мл середовища — 83,3 %.
% 95 90 85
контроль
0,5
1,5
1-1
2 мг/мл середовища
• Cholesteгyl linoleat
Cholesteгyl oleat
Cholesteгyl steaгat
Рис. 1. Збереження деконсервованих ембршшв мишей залежно вщ концентращУ рпннх форм холестеролу у вггрифжацшному середовищ1
В той же час застосування стеарату холестеролу у дозах вщ 0,5 до 1,5 мг/мл середовища майже не змшювало збереженостi деконсервованих ембрюшв. Збшьшення дози холестеролу до 2,0 мг/мл навт дещо знижувало життeздатнiсть ембрiонiв.
Отже, додавання лшолеату i олеату холестеролу в оптимальних дозах у вiтрифiкацiйне середовище пщвищуе збереженiсть деконсервованих ембрiонiв на 13,3-18,2 %. Очевидно, це пов'язано iз тим, що додаткове введення холестеролу зменшуе його втрати мембранами ембрюшв протягом крюконсервування, i тим самим знижуе крюпошкодження та пiдвищуе виживашсть ембрiонiв пiсля розморожування. Аналогiчнi даш отриманi вченими при крiоконсервуваннi сперми [10].
Шсля розморожування вiдсоток деконсервованих ембрюшв корiв з незворотними морфолопчними змiнами у I i II дослщних групах був досить низьким (вщповщно 10,0 % i 16,7 %) у порiвняннi з контролем, де цей показник
1
192
становив 30,0 % (табл. 1). Це й зумовило пщвищення збереженосп деконсервованих ембрюшв у цих дослщних групах — вщповщно 90,0 % i 83,3 %, що на 20,0 % i 13,3 % бiльше вiд контролю. При застосуванш стеарату холестеролу збережешсть вiдталих ембрiонiв корiв майже не вiдрiзнялася вiд контролю.
Таблиця 1
Збереження деконсервованих ембршшв велико? рогато? худоби залежно ввд форми 1 концентрат?" холестеролу у вггрифжацшному середовнщ1
Показники Групи тварин та дози холестеролу
контрольна I досл1днаа II досл1днаь III дослщна0
Заморожено ембрюшв, п 10 10 12 11
Деконсервоваш ембрюни з морфолопчними пошкодженнями, п-% 3-30,0 1-10,0 2-16,7 3-27,3
Збереження деконсервованих ембрюшв, % 70,0 90,0 83,3 72,7
Примiтка. У цiй i наступнiй таблицi а - 1 мг/мл лшолеату; ь - 1,5 мг/мл олеату: с - 0,5 мг/мл стеарату
Вища якiсть деконсервованих ембрюшв, обумовлена використанням лшолеату та олеату холестеролу у складi середовищ для вггрифкаци, забезпечила пiдвищення результативностi трансплантаци ембрiонiв. Приживленiсть ембрiонiв у I i II дослiдних групах становила 55,5 % i 50 %, що вщповщно на 12,7 % та 7,2 % бшьше порiвняно з контрольними рецишентами (табл. 2).
Таблиця 2
Приживлення деконсервованих ембршшв велико? рогато?' худоби, заморожених з використанням холестеролу
Показники Групи тварин та дози холестеролу
контрольна I досл1днаа II дослщна0 III дослщна0
Трансплантовано деконсервованих ембрюшв, п 7 9 10 8
Тшьш рецишенти, п 3 5 5 3
Приживлешсть ембрюшв, % 42,8 55,5 50,0 37,5
Таким чином, введення лшолеату i олеату холестеролу в середовища для надшвидкого заморожування ембрюшв проявляв позитивний вплив як на збережешсть деконсервованих ембрюшв, так i на !х приживлення у рецишенив.
Висновки. Введення лшолеату та олеату холестеролу у в^рифжацшне середовище для заморожування ембрюшв мишей надшвидким методом значно знижуе кiлькiсть морфологiчно пошкоджених кл^ин пiсля !х деконсервування (на 16,7-18,2 %), що зумовило краще !х збереження (понад 80 %) при ди низьких температур.
193
1. Застосування лшолеату i олеату холестеролу в оптимальних дозах у CKnaAi в^рифжацшного середовища пщвищуе збережешсть ембрюшв велико! рогато! худоби на 13,3-20,0 %, а !х приживлешсть — на 7,2-12,7 %.
Л1тература
1. Кривохарченко А. С. Сверхбыстрое замораживание мышиных эмбрионов, хранившихся при 4°С в течении суток. [Текст] /Кривохарченко А. С., Вильянович А. И., Рябых В. П./ Онтогенез. — 1992. — Т. 23. — № 2. — С.146-149.
2. Грищенко В. И. Сверхбыстрые скорости охлаждения и витрифицирующие растворы в криобиологии. [Текст] /Грищенко В. И., Калугин Ю. В./ Проблемы криобиологии. —1993. —№ 3. — С. 3-13.
3. Holt W. V. Basic aspects of frozen storage of semen. /Holt W. V./ Anim. Reprod. Sci. 62 (2000) 3-22.
4. Parks J. E. Lipid composition and thermotropic phase behaviour of boar, bull, stallion and rooster sperm membranes. /Parks J.E., Lynch D.V./ Cryobiology 29 (1992) 255- 266.
5. White I. G. Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. /White I. G./ Reprod. Fertil. Dev. 5 (1993) 639-658.
6. Cormier N. A differential mechanism is involved during heparin- and cryopreservation-induced capacitation. /Cormier N., Bailey J. l./ Biol. Reprod. 69 (2003) 177-185.
7. Вуд М. Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мышей. [Текст] Биология развития млекопитающих Методы. /Вуд М., Уиттингхэм Д., Ролл У./ М.: Мир.— 1990. — С. 323-356.
8. Довщник з репродуктивно! бютехнологи велико! рогато! худоби. [Текст] довщник /За редакщею Шаловила С. Г. — Львiв. — 2004. — 150 с.
9. Кауффольд П. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота. [Текст] /Кауффольд П., Тамм И., Шихов И. Я. и др./ М.: Агропромиздат. 1990 - 56 с.
10. Purdy P. H. Effect of adding cholesterol to bull sperm membranes on sperm capacitation, the acrosome reaction, and fertility. /Purdy P. H., Graham J. K./ Biol. Reprod. 71 (2004) 522-527.
Summary M. M. Sharan
CRIOPROTECTIONAL PROPERTIES OF HOLESTEROL AT ULTRAFREEZING OF EMBRYOS
Data are resulted about crioprotective properties of different forms of holesterols (linoleate, oleate and stearate) at addition of them on medium for the ultrafreezing of embryos of mise and cows. It is set, that introduction of cholesterol linoleate and oleate to the vitrification environment in concentrations 1,0-1,5 mg/ml lowers the quantity of the morphologically damaged cells after unfreezing on 10,018,2 %, that is confirmed by the high index of surviving of thawed embryos (over 80,0 %), and also promoted their nidation on 7,2-12,7 %.
Стаття надшшла до редакцИ 17.09.2009
194
