CC BY
23
2. Гринжевський М. В. Ытенсифшащя виробництва продукцп аквакультури у внутршшх водоймах Укра1ни / М. В. Гринжевський. - К.: Свгг. - 2000. - 188 с.
3. Erickson K. Micronutrients and innate immunity / K. Erickson, E. Medina, N. Hubbard // J. Infect. Dis. - 2000. - V. 182. - P. 45-53
4. Тушницька Н. И. Стан iмунноi системи i метаболiчний профiль KpoBi коропа при захворюванн краснухою i piзних способах його лiкування [Текст] : автореф. дис. ... канд. вет. наук : 03.00.04 / Тушницька Н. И. - Львiв, 2009. - 18 с.
5. Лянзберг О. В. Динамша гематолопчних показнишв коропових риб протягом зимового утримання / О. В. Лянзберг, I. М. Шерман // Рибгосподарська наука Украши. - 2008. - №4. - С. 54-58.
6. Filho W. D. Influence of season and pollution on the antioxidant defenses of the cichlid fish acara (Geophagus brasiliensis) /W. D. Filho, M. A. Torres, T. B. Tribess, R. C. Pedrosa //Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 2001. - V. 34(6). -Р.719-726.
7. Грициняк I. I. Генетична структура порщ i порвдних груп коротв за окремими генетико-бiохiмiчними системами / I. I. Грициняк, Т. А. Нагорнюк, С. I. Тарасюк // Рибогосподарська наука Украши. - 2008. - № 1. - С. 29-33.
8. Грициняк I. I. Природна резистентшсть любшського рам частого i лускатого коротв та 1х гiбpидiв / I. I. Грициняк, О. I. Вiщуp, О. В. Дерень // Бiологiя тварин. -2007. - т.9, №1-2. - С. 110-112.
9. Олексieнко О. О. Внутршньопорвдна структура украшських коpопiв / О. О. Олекаенко, I. I. Грициняк, // Рибогосподарська наука Украши. - 2007. - № 1. -С. 21-27.
10. Лабораторш методи до^джень у бюлогп, тваринництм та ветеринарнш медицина довiдник / В. В. Влiзло, Р. С. Федорук, I. Б. Ратич, О. I. Вщур [та iн.]; за ред. В. В. Влiзла. - Львiв: СПОЛОМ, 2012. - 764 с.
Стаття надшшла до редакцИ 5.10.2015
УДК 57.08:639:31
Салша А. С., к.б.н., (E-mail: [email protected]) © Горбунов Л. В., к. с.-г. н., с.н.с. (E-mail: [email protected])
1нститут тваринництва НААН Украгни, м. Харюв
ВИЗНАЧЕННЯ К1НЦЕВО1 ТЕМПЕРАТУРИ ОХОЛОДЖЕННЯ СПЕРМПВ I ЕМБР1ОН1В ТВАРИН ДО ЗАНУРЕННЯ В Р1ДКИЙ АЗОТ
Запропоновано споаб визначення ктцевог температури заморожування спермпв i ембрютв тварин, що мае аналтичне i графiчне рШення. За допомогою аналтичного методу визначено, що при кнцевих температурах заморожування - 20 i -25 °С 3i змтною i постшною швидюстю охолодження, вiдповiдно, вiдсоток спермпв бугая, в яких не утворюються внутрШньоклтинт кристали, складае 62,5 %. На основi використання графiчного методу встановлено, що ктцева температура заморожування -26 °С, забезпечуе максимальний рiвень збереженостi ембрютв мишi 99,7 %, при застосувант прискореного режиму заморожування.
Ключов'1 слова: крюконсервування, ктцева температура заморожування, ембрюни миш-i, спермп бугая, графiчний метод, аналтичний метод.
© Салша А. С., Горбунов Л. В., 2015
102
УДК 57.08:639:31
Салина А.С., к.б.н., Горбунов Л.В., к. с.-х. н., с.н.с.
Институт животноводства НААН Украины, г. Харьков
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЕЧНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ ОХЛАЖДЕНИЯ СПЕРМИЕВ И ЭМБРИОНОВ ЖИВОТНЫХ ДО ПОГРУЖЕНИЯ В ЖИДКИЙ АЗОТ
Предложен способ определения конечной температуры замораживания спермиев и эмбрионов животных, имеющий аналитическое и графическое решения. С помощью аналитического метода определено, что при конечных температурах замораживания -20 и -25 °С с переменной и постоянной скоростью охлаждения, соответственно, процент спермиев быка, в которых не образуются внутриклеточные кристаллы, составляет 62,5 %. На основе использования графического метода установлено, что конечная температура замораживания -26 °С, обеспечивает максимальный уровень сохранности эмбрионов мыши 99,7 %, при ускоренном режиме замораживания.
Ключевые слова: криоконсервирование, конечная температура замораживания, эмбрионы мыши, спермии быка, графический метод, аналитический метод.
UDC 57.08:639:31
Salina A. S., c.b.s., Gorbunov L. V., c. agric. s., s.s.s.
Institute of animal science UAAS of Ukraine, Kharkov
DETERMINATION OF EVENTUAL TEMPERATURE OF COOLING OF SPERMS AND EMBRYOS OF ANIMALS TO IMMERSION IN LIQUID
NITROGEN
The method of determination of eventual temperature of freezing of sperms and embryos of animals, having analytical and graphic decisions, offers. It is certain by means of analytical method, that at the eventual temperatures of freezing - 20 and -25 °С with a variable and permanent speed of cooling, accordingly, percent of sperms of bull, inwardly cellular crystals do not appear in that, 62,5 %, is got. It is set on the basis of the use of graphic method, that eventual temperature of freezing -26 °С, provides the maximal level of safety of embryos of mouse 99,7 %, at the speed-up mode offreezing
Key words: cryoconservation, eventual temperature of freezing, embryos of mouse, sperms of bull, graphic method, analytical method.
Вступ. Одним з провщних napaMeTpiB отримання максимально! збереженосп деконсервованого бюлопчного матерiалу е кшцева температура заморожування до занурення його в рщкий азот, при досягненшяко! вщбуваеться необхщна депдратащя кттини з подальшою вщсутшстю внутршньокттинно! кристатзаци. Знаходження оптимального значення цього показника дозволить спростити процес заморожування i шдвищити рiвень збереженосп бюоб'екту.
До тепершнього часу кшцеву температуру заморожування бiоматерiалу визначають або за допомогою емтричного тдходу, за допомогою дослщного перебору ушх можливих варiантiв при охолодженш зразка [1], або теоретичними розрахунками величини, котра розраховуеться з введенням рiзного роду допущень [2]. У першому випадку виникае проблема великих витрат часу i матерiальних засобiв на досягнення бажаного результату, в другому - неможливосп облшу математичним апаратом ушх нюаншв процесу охолодження-вщ^вання бiоматерiалу. До того ж кшцева температура охолодження бюоб'екту залежить вщ умов заморожування, а саме швидкосп теплообмшу, яка може бути не лише постшною, але i перемiнною. Це у свою чергу е недослщженим явищем вщносно
103
зростання поза- i внутршньокл^инних кристатв, що також робитиме значимий вплив на кшцеву температуру охолодження.
Мета дослiджень - розробка способу визначення кшцево! температури охолодження статевих клiтин i ембрiонiв тварин на основi використання графiчного i анал^ичного методiв.
Матерiали i методи. Об'ектами дослiдження служили сперми буга!в-плщниюв червоно-строкато! укра1нсько1 молочно! породи, яю належали племпiдприeмству 1Т НААН, а також ембрюни мишей, що знаходилися на стади розвитку вiд шзньо! морули до експандовано! бластоцисти. Рiвень збереженостi нативно! сперми буга!в складав 80±5%. Взяття, оцiнка якостi, розбавлення i пiдготовка сперми до охолодження проводилася за Харювською технологieю асептичного узяття i крiоконсервування сперми буга!в-плщниюв [3]. Рiвень життeздатностi, що використовувалися в експериментах ембрiонiв визначали за морфолопчними ознаками i за результатами !х короткострокового культивування in vitrо до наступно! стади розвитку [4].
В якост контейнера для заморожування використовували пробiрки Уленгута (У=0,75 мл). Температуру зразка вимiрювали за допомогою хромель-копелево! термопари з дiаметром вимiрювальноl голiвки 0,3 мм i за допомогою позистора СТ -17-380 Ом, вiдкалiброваного за показаннями термопари. Режим зниження температури реестрували графiчним пристроем Н-307.
Заморожування спермив i ембрiонiв зi змшою швидкiстю здiйснювали в пристро!, робота якого заснована на пасивному охолодженш термоблоку в горловиш посудини Дьюара Х-34Б [5]. Розморожування проводили у водянш банi при 38 °С.
Вiрогiднiсть внутрiшньоклiтинного кристалоутворення бiооб'екту визначали за допомогою формули 1 [6]:
Р1 =
1 _ ^з
V Ъо у
•100%о, (1)
де: 8з - збереженiсть бiооб'екту, що тддавався охолодженню до температури рщкого азоту Т=-196 °С, 8о - збережешсть вiдтаяного бiоматерiалу у водянш баш Т=38 0С.
Теоретичнi розрахунки вiрогiдного вiдсотка внутрiшньоклiтинного кристалоутворення бюоб'екту проводили при використаннi формули Байесса для не пов'язаних подш (ф. 2), а збережешсть визначали за формулою 3:
Р1к(и1А1) = 2 Р!^ (2)
Ъ « (1 _ Р„1)-100%, (3)
де: S - збереженiсть деконсервованого бiооб'екту, Р'к - вiрогiднiсть внутршньокттинного кристалоутворення.
Отриманi результати статистично оброблялися за допомогою загальноприйнятих методiв [7].
Результати дослiдження. Спошб визначення кшцево! температури охолодження ембрюшв i спермив ссавцiв, який засновано на встановленш мiнiмального вiдсотка клггин, в яких сталася внутрiшньоклiтинна кристалiзацiя.
Запропоновано аналiтичний варiант знаходження вщсотка пошкоджених спермив бугая при заданш кiнцевiй температурi заморожування. Для цього отримано вiрогiднiсть розподiлу внутрiшньоклiтинного кристалоутворення на
104
основi показниюв збереженост спермпв бугая, охолоджених до рiзних кшцевих температур рис. 1.
З рис. 1 виходить, що вiдсоток кттин, в яких утворився внутрiшньоклiтинний лщ, пропорцiйний площi перетину криво! такою, що характеризуе варiацiю температурного гравдента в горловинi посудини Дьюара (Д=±2,5 0С) i щiльностi в1ропдносп розподшу внутршньокл ¡тинного кристалоутворення спсрмпв бугая.
Рис. 1. Кривi щiльнiсть вiрогiдностi внутршньокл^инного кристалоутворення спермilв бугая Р2 (Т) [6] i вар1ацп температурного градieнту в горловинi посудини Дьюара Р1 (Т) [8]
Щоб анал^ично розрахувати вiдсоток загиблих спермпв, необидно застосувати математичний апарат, за допомогою якого визначили площу перетину (рис. 2) \ вщсоток клггин, що вижили ф. (4, 5).
Рис. 2. Схематичне зображення площ1 перетину кривих внутрiшньоклiтинного кристалоутворення спермilв бугая i вар1ацп температурного градieнта в горловинi посудини Дьюара
= 8Д1 + Бд2 = {Г(X!)Лх1 Г(х2)ёх2 = {с| 1--^ ^ + {с| 1 - -2 ах2, (4)
0 0 0 V а У 0 V Ь У
ь
ь
а
а
105
г
8
8
^ -100%
(5)
р
де: - площа АСБ, 8д1 - площа АСВ, 8д2 - площа ВСБ, а - довжина вiдрiзку АВ, Ь - довжина вiдрiзку ВБ, с - довжина вiдрiзку ВС, Ъ - вщсоток
спермilв, що вижили,
Sр
- площа криво1 щшьносп вiрогiдностi
внутршньокштинного кристалоутворення спермi1в бугая.
Для спрощення розрахунку вiдсотка клiтин, що вижили, при заданш кiнцевiй температурi заморожування аналiтичним методом використовували програму для знаходження певних iнтегралiв. При цьому вводимо задаш значення меж кривих розподшу (рис. 2) i на виходi отримуемо площу, яка е частиною площi (Sд=1) пiд кривою вiрогiдностi внутрiшньоклiтинно1 кристалiзацi1. На основi цього визначено, що при перемшнш швидкостi (В =2^180 °С/хв) i постiйною (В =12 °С/хв) кiнцевi температури охолодження спермi1в бика склали - 20 i -25 °С, вiдповiдно. Практична перевiрка показала, що при заморожуванш спермi1в бугая за заданими режимами отримано максимальний вщсоток спермi1в що вижили - 62,5%.
Спростити ршення цiе1 задачi можна за допомогою використання графiчного шдходу, на пiдставi якого визначена кшцева температура охолодження ембрiонiв мишi. Для цього побудована крива щшьнють вiрогiдностi внутрiшньоклiтинного кристалоутворення ембрiонiв Р2 i варiацi1 температурного градiента в горловиш посудини Дьюара Р1 (рис. 3).
'Рх (t) 1 ^2 (t)
-0,4 V. 0,4
- 0,3 - 0,3\
-0,2\ - 0,2 \
- 0,1 \ у/ - 0,1 \
1 1 1 \2с 1"| 1 1 1 ^ t
-26 -27,2
-29,7
-32,2
-34,7 -37,2
-39,7
-42,2
Рис. 3. Щшьшсть вiрогiдностi розподiлу внутршньокл^инноТ кристалiзащT ембрiонiв Р2 (t) [1] i вар1ацп температурного градieнта в горловиш посудини
Дьюара Р1 (1)
З рис. 3 визначаемо число середньоквадратичних вщхилень на перетинi кривих Р2 (t) i Р1 (t), тсля чого, застосовуючи формулу Байесса для не пов'язаних подш (ф. 2) обчислюемо вiрогiдний вiдсоток внутрiшньоклiтинного кристалоутворення. На пiдставi отриманих даних визначаемо збережешсть бiооб'екту за допомогою формули 3. Проведет розрахунки за визначенням збереженост бiооб'екту при кiнцевiй температурi заморожування Тк = -28,4 °С показали, що:
Р1к=(0,107+0,025)-(0,025+0,107+0,337+0,337)=0,106 %;
S«(1-0,106)-100%=89,4 %.
З метою пiдвищення збереженостi бiооб'екту проведено розрахунки для кшцево! температури заморожування -26 °С:
106
Р'к =0,025 (0,107+0,025)=0,0033 %; S«(1-0,0033)-100%=99,7 %.
Таким чином, з вище представлених pозpахункiв при використанш гpафiчного пiдходу витiкае, що максимальний piвень збеpеженостi ембpiонiв мишi отримано для кшцево! температури заморожування Тк=-26 °С, при застосуваннi прискореного режиму заморожування.
Практична пеpевipка показала, що при заморожуванш ембpiонiв мишi до кшцево! температури заморожування Тк=-32 °С, з повiльною пеpемiнною швидкiстю 0,3 °С/хв. в температурному дiапазонi вщ - 5 до -25 °С/хв. piвень збеpеженостi складае 93,6% (n=72), а при 2 °С/хв. (прискорений режим) - 95,7% (n=30). Отpиманi результати свщчать про те, що на збережешсть ембpiонiв впливае, кiнцева температура заморожування, характер змши швидкостi охолодження i початкова якiсть бiооб'екту.
Висновки: 1 Запропоновано спосiб визначення кiнцево! температури заморожування спеpмi!в i ембрюшв тварин, що мае аналiтичне i гpафiчне piшення.
2. За допомогою аналiтичного пiдходу визначено, що при перемшнш швидкостi (В=2^180 °С /хв) i постiйнiй (В=12 0С /хв) кiнцевi температури охолодження спеpмi!в бугая склали - 20 i -25 °С, вiдповiдно, якi забезпечили piвень збеpеженостi 62,5%.
3. На основi використання гpафiчного пiдходу встановлено, що кшцева температура заморожування -26 °С, забезпечуе максимальний piвень збереження ембрюшв мишi 99,7 %, при прискореному pежимi заморожування
Перспективи подальших дослщжень. Вважаемо, що отpиманi кiнцевi температури заморожування спермпв бугая та ембрюшв миш^ можуть сприяти удосконаленню технологш кpiоконсеpвування спеpмi!в i ембpiонiв тварин. Тому надат будуть пpоведенi дослщження по вивченню впливу прискорених pежимiв заморожування бiооб'екту до розрахованих кшцевих температур на збережешсть спермпв бугая i ембрюшв коpiв
Лiтература
1. Валигура Е. Г. Влияние различных режимов замораживания на сохранность эмбрионов крупного рогатого скота: автор. дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук. спец. 03.00.13 «физиология животных и человека» - Харьков, 1994. - 22 с.
2. Иткин Ю. А. Актуальне проблемы криобиологии / Ю. А. Иткин, Р. Клен, Е. А. Гордиенко, В. Л. Бронштейн // К.: Наук. думка. - 1981. - 608 с.
3. Осташко Ф. И. Биотехнология воспроизведения крупного рогатого скота / Ф. И. Осташко // К.: Наукова думка. - 1995. - 195 с.
4. Кауффольд П. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота: Руководство для работы по пересадке эмбрионов / П. Кауффольд, И. Тамм, И. Я. Шихов - М.: Агропромиздат, 1990. - 56 с.
5. Пат. 60161А Укра!на, МКВ F 25 D 3/10. Установка для заморожування бюлопчних об'екпв та споаб шщацл кристалоутворення в крюзахисному середовищг Пат. 60161А Укра!на, МКВ F 25 D 3/10/ Л. В. Горбунов, В. I. Кабачний, Т. С. Антоненко, Н.1 Горбунова, Т.О. Томаровська (Укра!на); Нацюнальна фармацевтична академiя Укра!ни. - №2003021337; Заявл. 14.02.2003; Опубл. 15.09.2003; Бюл. №9. - 2 с.
6. Горбунов Л.В., Суржанська Я. Ю. Температура внутpiшньоклiтинного кристалоутворення спермпв буга!в / Л. В. Горбунов, Я. Ю. Суржанська // Науково-технiчний бюлетень IТ УААН. - Харшв. -2003. - № 83. - С. 44-48.
7. Лакин Б. Ф. Биометрия / Б. Ф. Лакин - М. : Высшая школа, 1990. - 254 с.
8. Леонид Горбунов. Гетерогенность ооцитов и эмбрионов млекопитающих / Горбунов Л., Манюков // АLAPLAMBERT Academic Publishing / Германия, 2015 - 124 c. (ISBN: 978-3-659-37957-4).
Стаття надшшла до редакци 4.09.2015
107
