CC BY
60
УДК 57.089.3:636.2.082:615.3
КОРРЕКЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ У КОРОВ-ДОНОРОВ ПРЕПАРАТОМ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО НЕЙРОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ
В.И. ШЕРЕМЕТА, О.П. ВЕРГЕЛЕС Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины г. Киев, Украина, 43022
(Поступила в редакцию 24.01.2013)
Введение. На протяжении последних десятилетий наряду с традиционными биотехнологическими методами практическое значение приобрела трансплантация эмбрионов, которая в настоящее время в скотоводстве является эффективным методом решения проблемы обеспечения селекционного процесса необходимым количеством бычков, полученных от высокопродуктивных коров. В методе трансплантации эмбрионов наиболее важным звеном является стимуляция множественной овуляции, которая обеспечивает получение необходимого количества пригодных к трансплантации эмбрионов для снабжения селекционных программ потомками генетически ценных коров. Поэтому увеличение количества пригодных к пересадке эмбрионов во время стимуляции суперовуляции у коров-доноров является очень актуальным, поскольку повышает экономическую эффективность метода трансплантации эмбрионов и селекционного процесса.
Достижения науки в изучении воспроизводительной функции, физиологии оогенеза и раннего эмбриогенеза крупного рогатого скота стали фундаментом создания современных биотехнологий с использованием половых клеток самок и эмбрионов. Большинство известных методов интенсивного использования репродуктивного и генетического потенциала животных основывается на гормональной стимуляции фолликулогенеза и раннего эмбриогенеза [1].
По мнению многих авторов, индукция суперовуляции у коров-доноров - наиболее слабое звено в методе трансплантации эмбрионов, поскольку наблюдается значительная вариабельность реакции яичников на экзогенный гонадотропин, обусловленная изменением гормонального взаимодействия на всех этапах формирования полиовулятив-ной реакции [1]. В значительной степени такое утверждение касается схем стимуляции суперовуляции экзогенным гонадотропином сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК), полученной путем лиофильной сушки их сыворотки крови, отобранной на 45-120-й день беременности [2, 3].
Препараты группы ГСЖК оказывают комплексное фолликулости-мулирующее и лютеотропное влияние, обусловленное содержанием в структуре препарата фолликулостимулирующего и лютеинизируеще-го гормонов [4]. Известные методы полиовулятивной индукции с использованием ГСЖК не обеспечивают суперовуляции у 30 % живот-
41
ных, а стимуляция ее высокого уровня уменьшает количество пригодных эмбрионов [5].
Установлено, что стимуляция множественной овуляции у коров-доноров данным гонадотропином также обусловливает значительное количество неовулировавших фолликулов, что отрицательно влияет на выход пригодных эмбрионов [2]. Длительный период биологического полураспада ГСЖК вызывает его остаточную концентрацию в крови доноров после индукции суперовуляции, которая обусловливает рост новой волны фолликулов и увеличение концентрации эстрогенов в организме донора [2, 6]. Это порождает негативные морфофункцио-нальные изменения в матке, яйцеводах и является одной из причин увеличения дегенерированных эмбрионов, а также их потерь при вымывании нехирургическим методом [7].
В настоящее время учеными для увеличения количества пригодных эмбрионов проведено значительное количество исследований по совершенствованию метода стимуляции полиовуляции у коров-доноров. Так, было предложено использовать в схемах индуцированной гонадо-тропином СЖК суперовуляции биологически активные вещества, в частности витамины А, Е, Б и В6 [7, 8]. Разработаны рекомендации по применению АСД-2 [9] и антигонадотропных сывороток [6]. Кроме того, показано, что суперовуляцию у коров-доноров улучшает использование гонадотропин-рилизинг гормона [4], или увеличение кратности инъекций простагландина Б2а до 2-3 раз с интервалом 6-8 ч [2]. Следует отметить, что дополнительные гормональные препараты в схемах суперовуляции являются отрицательным аспектом, который усугубляет деструктивные изменения в эндокринном статусе доноров, вызванные экзогенным гонадотропином [7].
Поэтому исследования по поиску и разработке новых биологически активных препаратов, которые бы дали возможность уменьшить количество неовулировавших фолликулов и увеличить выход пригодных эмбрионов без дополнительного применения гормональных препаратов в схемах полиовуляции с использованием ГСЖК, имеют большое научное и практическое значение.
Цель работы - разработать способ увеличения количества овули-ровавших фолликулов и пригодных эмбрионов при помощи коррекции биологически активным препаратом метаболического нейротропного действия суперовуляции _у кров-доноров при ее стимуляции гонадотропином СжК «Бо1%оп®».
Материал и методика исследований. Исследования проводили ОП НАУ «Великоснитинське НДГ им. О.В. Музыченко» на коровах-донорах украинской черно-рябой молочной породы живой массой 500-615 кг с удоем по наивысшей лактации 4600-5300 кг, находившихся в одинаковых условиях кормления и содержания.
После синхронизации половой охоты с целью диагностики субклинического хронического эндометрита ставили пробу на серосодержащие аминокислоты в эстральной слизи по экспресс-методике [10].
На основе наличия серосодержащих аминокислот в эстральной слизи и клинико-гинекологических исследований было отобрано 8 коров-доноров, из которых сформировали две группы (опытную и контрольную) по четыре животных методом пар-аналогов по возрасту, живой массе, молочной продуктивности и морфологическому состоянию желтого тела.
Суперовуляцию у подопытных коров-доноров стимулировали согласно схеме, представленой в табл. 1. Для индукции суперовуляции коровам-донорам на 10-й день полового цикла вводили гонадотропин СЖК «FoШgon®» в дозе 3 тыс. МЕ. Опытным донорам на 10-й и 11-й день полового цикла под кожу за лопаткой вводили 20 мл препарата «Стимулин-Вет». Через 48 и 72 ч после инъекции гонадотропина коровам-донорам вводили аналог простагландина F2й «Естрофан®» в дозе 2 мл на одну голову. Осеменение доноров проводили ректоцерви-кальным способом трижды с интервалом 12 ч замороженно-оттаянной спермой одного быка через двое суток после последнего введения естрофана. В каждой дозе было не менее 30 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением (табл. 1).
Таблица 1. Схема опыта по изучению влияния парантеральной инъекции препарата «Стимулин-Вет» на уровень суперовуляции коровам-донорам
День полового цикла Введение гормонов и проведение биотехнологических работ
Не известен Проведение ректальных исследований для выявления желтого тела на яичниках
Не известен Внутримышечные инъекции аналога простагландина F2, «Естрофан®»
0 Отбор из влагалища коров эстральной слизи и определение в ней серосодержащих аминокислот
8 Отбор крови из яремной вены
10 Парантеральное введенние гонадотропина СЖК «Folligon®» в дозе 3 тыс. МЕ
10,11 Инъекции донорам под кожу биологически активного препарата «Стимулин-Вет»
12 Отбор крови из яремной вены до введения «Естрофана®»
12, 13 Внутримышечные инъекции аналога простагландина «Естрофан®»
14(0), 1 Искусственное осеменение коров-доноров
7 Отбор крови из яремной вены. Вымывание эмбрионов у коров-доноров
Перед вымыванием эмбрионов проводили ректальное исследование доноров для оценки эффективности гормональной обработки, подсчитывали количество желтых тел и неовулировавших фолликулов. Эмбрионы вымывали на 7-й день полового цикла нехирургическим методом по общепринятой методике фосфатно-солевым буфером Дюльбек-ко («SIGMA», Германия) с добавлением 1 % фетальной сыворотки телят и антибиотиков (гентамицин, ампициллин) [3]. Количественную и качественную оценку эмбрионов проводили микроскопическим методом, по морфологическим признакам, с учетом стадии развития.
43
Отбор крови из яремной вены доноров проводили до введения препаратов на 8, 12, 7-й день полового цикла. В сыворотке крови исследовали активность трансаминаз: аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланин-аминотрансферазы (АлАТ) ферментативным кинетическим методом, с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Stat Fax 1904 (Awareness Technology, USA).
Результаты исследований и их обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что все коровы-доноры отреагировали на гормональную обработку. Следует отметить, что у животных опытной группы размах вариации овуляций был большим, поскольку ее минимальный и максимальный уровни у опытных доноров были больше соответственно на 50 и 72,7 %. Поэтому у коров-доноров опытной группы уровень суперовуляции был больше на 27,9 % по сравнению с контролем. При этом у опытных доноров было достоверно меньше на 77,8 % неовулировавших фолликулов, чем в контроле (табл. 2).
Таблица 2. Результаты суперовуляции у коров-доноров, М ± m
Показатели Группы, n = 4
контрольная опытная
Уровень суперовуляции, шт. 8,5±1,19 11,8±2,43
Лимит овуляций у доноров, limm¡n.max 6-11 9-19
Число неовулировавших фолликулов, шт. 4,5±0,96 1,0±0,41*
Индекс вымывания эмбрионов, % 76,5% 87,2%
*Р<0,05.
Эффективность вымывания эмбрионов у доноров была довольно высокой, хотя в контрольной группе коров-доноров отмечается снижение индекса на 12,2 %.
Итак, совместное введение препарата «Стимулин-Вет» с гонадо-тропином СЖК «Бо1%ои®» интенсифицирует рост преовуляторных фолликулов, способствует их овуляции и повышает эффективность вымывания эмбрионов и гамет.
У доноров опытной группы вымыли всего 10 эмбрионов, и из них пригодных к пересадке было соответственно в 1,6 и 1,9 раза больше, чем в контроле (табл. 3).
Таблица 3 . Эффективность вымывания эмбрионов, их качество и стадии развития, М ± т
Показатели Группы, n = 4
контрольная опытная
Эмбрионы, всего, шт. 6,0±1,47 10,0±2,68
Из них: пригодные 3,8±1,18 7,3±1,25
непригодные 2,2±1,03 2,7±1,49
Морулы, шт. 4,0±0,71 6,3±0,85
Из них: пригодные 2,2±0,63 3,5±1,26
непригодные 1,8±0,85 2,8±1,49
Бластоцисты, шт. 2,0±0,82 3,7±2,25
Из них: пригодные 1,5±0,65 3,7±2,25
непригодные 0,5±0,29 0
Яйцеклетки, шт. 0,5±0,29 0,3±0,29
Сравнительный анализ стадий развития эмбрионов показал, что у доноров опытной и контрольной групп вымыли из матки 63 морулы (67 %), и 37 бластоцист (33 %), т. е. у животных опытной и контрольной групп соотношение более ранних и поздних стадий развития эмбрионов было почти одинаковым. Результаты данных исследований позволяют думать, что препарат не влияет на интенсивность развития эмбрионов, а только увеличивает их количество. Так, в опытной группе коров-доноров вымыли пригодных морул больше в 1,5 раза, чем в контроле.
Аналогичная тенденция прослеживается и с качеством полученных бластоцист. У опытных доноров их вымыли в 2,5 раза больше по сравнению с контрольными. Необходимо отметить очень большую ошибку средней по количеству бластоцист, что свидетельствует об увеличении индивидуальной изменчивости их выхода у опытных доноров.
Количество неоплодотворенных яйцеклеток у коров-доноров было незначительным. У контрольных животных оно было в 1,7 раза больше, чем у опытных, но эта разница находилось в пределах ошибки.
У подопытных доноров на 8-й день полового цикла различий в активности ферментов не наблюдалось. После введения препаратов в крови коров контрольной группы активность АлАТ достоверно увеличилась на 21 % в сравнении с 8-м днем полового цикла, тогда как у опытных доноров на 12-й день полового цикла в сравнении с 8-м днем увеличилась активность АсАТ и АлАТ соответственно на 12,0 и 11,6 %. Помимо этого у опытных доноров активность АсАТ была большей на 7,2 % (Р<0,05), чем в контроле. У опытных животных на 7-й день полового цикла активность АсАТ и АлАТ снизилась на 10,4 % (Р<0,01) и 3,8 % по сравнению с 12-м днем и была меньше, чем в контроле, соответственно на 3 и 6,8 % (табл. 4).
Таблица 4. Активность ферментов в крови коров-доноров, ед/л, М±т
Ферменты, коэффициент де Ритиса День полового цикла
контроль, п = 4 опыт, п = 4
8 12 7 8 12 7
АсАТ 59,40± ±1,96 62,20± ±1,36 61,80± ±1,16 59,80± ±2,01 67,00± ±1,45ас 60,00± ±0,84
АлАТ 19,60± ±1,29 23,80± ±1,16в 21,80± ±1,36 19,00± ±0,84 21,20± ±0,80 20,40± ±0,68
АсАТ АлАТ 3,00± ±0,13 2,62± ±0,06в 2,90± ±0,18 3,20± ±0,05 3,20± ±0,07ав 2,90± ±0,09
аР<0,05 - сравнение с контролем; вР<0,05; сР<0,01 - сравнение между животными в группе.
В крови контрольных доноров после введения гонадотропина достоверно снизился коэффициент де Ритиса до 2,62 (Р<0,05) в сравнении с 8-м днем полового цикла, тогда как у опытных доноров он не изменился.
Значительное количество неовулировавших фолликулов у контрольных доноров при стимуляции ГСЖК «Бо1^оп®» суперовуляции, возможно, обусловлено его длительным периодом полураспада, что вызывает дисбаланс между эндогенным фолитропином (ФСГ) и лютропином (ЛГ). Помимо этого введение гонадотропина контрольным донорам изменило физиологическую координированность тран-саминаз, что снизило коэффициент де Ритиса. Это, очевидно, свидетельствует об изменении метаболических потоков в направлении интенсификации анаболических реакций, что отрицательно влияет на овуляцию фолликулов и развитие эмбрионов.
Полученные результаты суперовуляции у опытных доноров косвенно подтверждают теоретическое предположение, что соединения анаболического нейротропного действия, которые объединены в препарате «Стимулин-Вет», регулируют энергетический и пластический обмен в системе гипоталамус - гипофиз - яичники, корректируя соотношение между ЛГ и ФСГ и способствуя увеличению количества овуляций. Это подтверждается данными о том, что появление в кровообращении экзогенных интермедиаторов цикла трикарбоновых кислот, входящих в состав биологически активного препарата, воспринимается рецепторной системой организма как сигнальный фактор условной гипоксии в тканях. Адекватный ответ организма сопровождается рядом физиологических и биохимических компенсаторных реакций, основанных на интенсификации энергетического обмена, особенно в возбужденных центральных регуляторных образованиях, в первую очередь в гипоталамусе [11].
Подтверждением этому постулату может служить тот факт, что коэффициент де Ритиса в опытной группе между 8-м и 12-м днем цикла не менялся даже с учетом изменения активности обеих трансаминаз после совместного введения гонадотропина с биологически активным препаратом «Стимулин-Вет». Возможно, это обусловлено тем, что исследуемые энзимы были взаимосвязаны через глутаминовую кислоту (составляющую препарата) и формировали субстрактно-энзимологическую регуляцию интенсивности метаболических потоков на уровне крови. При этом сохранялась физиологическая координированность като- и анаболизма в организме доноров, несмотря на агрессивное воздействие индуктора, вызывающего множественный рост фолликулов, что в целом способствовало увеличению количества овуляций и выхода пригодных эмбрионов.
Кроме того, логично предположить, что препарат, действующим веществом которого является глутаминовая кислота и ее метаболиты, обусловливает предвзятую активацию путей мобилизации и поддержки аэробного энергетического обмена, способствуя синтезу ЛГ-рилизинг-гормона в гипоталамусе, который стимулирует дополнительное выделение гипофизом лютропина в кровь доноров и как следствие улучшает результаты множественной овуляции.
46
Заключение. Биологически активный препарат нейротропно-метаболического действия, введенный в организм доноров в период морфофункциональной активации половой системы коров-доноров, стимулированной воздействием экзогенного гонадотропина, обусловливает изменение активности трансамилаз, что свидетельствует об интенсификации белкового обмена и, возможно, энергетического. Такие изменения обменных процессов в организме доноров способствуют росту большего количества фолликулов на яичниках, индуцированных экзогенным гонадотропином, и, возможно, обусловливают активацию синтеза ЛГ-рилизинг-гормона в гипоталамусе, который стимулирует дополнительное выделение в кровь гипофизом эндогенного лютропина, что улучшает результаты множественной овуляции. Поэтому введение коровам-донорам препарата «Стимулин-Вет» на 10-й и 11-й день полового цикла в дозе 20 мл во время стимуляции гонадотропином СЖК «Folligon®» суперовуляции обусловливает тенденцию к увеличению количества растущих фолликулов, достоверно увеличивает количество фолликулов, которые овулировали. Кроме того, происходят и морфофункциональные изменения в эндометрии матки доноров, что способствует вымыванию большего на 40 % количества эмбрионов, в том числе на 48 % пригодных к пересадке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Леткевич, Л.Л. Эндокринные закономерности формирования фолликулогене-за у коров-доноров эмбрионов / Л.Л. Леткевич, А.И. Ганджа, Л.В. Голубец // Весщ На-цыянальнай акадэмп навук Беларуси - 2005. - № 2. - С. 84-87.
2. Смолянинов, Б.В. Контроль и регуляция воспроизводительной функции самок сельскохозяйственных животных / Б.В. Смолянинов, М.О. Кротких. - Одесса: СМИЛ, 2004. - 197 с.
3. Бугров, О.Д. Санащя ембрюшв велико!' рогато!' худоби: метод. рекомендаци / О.Д. Бугров, Г.С. Тихона. - Харгав: 1нститут тваринництва УААН, 2004. - 8 с.
4. Никоян, П.Е. Суперовуляция и оплодотворяемость яйцеклеток в зависимости от сезона года и уровня овуляции / П.Е. Никоян // Эндокринология и трансплантация зародышей селськохозяйственых животных: сб. науч. тр. - Дубровицы, 1983. - Т. 44. -С. 68-73.
5. Лиепа, Л.П. Результаты гормонального вызывания суперовуляции у коров с использованием антисыворотки на СЖК / Л.П. Лиепа, И.В. Мальцева // Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции сельскохозяйственых животных: бюл. науч. работ. - Дубровицы, 1988. - Вып. 89. - С. 41-43.
6. Saumande, J. Production of PMSG anti-serum in cattle: Assay of inhibitory activity and use in superovulated heifers / J. Saumande, D. Chuping. - Theriogenology, 1982. -Vol. 15. - Р. 125-134.
7. Овчиников, А.В. Уровень полиовуляции у коров-доноров в зависимости от размера яичников и состояния желтого тела / А.В. Овчиников // Эндокринология и трансплантация зародышей сельскохозяйственных животных: сб. науч. тр. - Дубровицы, 1983. - Т. 44. - С. 68-73.
8. Чорненький, Т.Я. Применение витамина В6 и цитрата натрия при вызывании суперовуляции у крупного рогатого скота / Т.Я. Чорненький, З.В. Кузымкив // О мерах повышения эффективности организации более широкого использования биотехнологии в племенном животноводстве: тез. докл. II респ. науч.-произв. конф. - Львов, 1988. -С.102-103.
9. Мороз, Т.А. Выживаемость эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации / Т.А. Мороз // Биология воспроизводства и биотехнологические методы разведения сельскохозяйственных животных. - 1989. - С. 135-140.
10. Селиверстов, В.В. Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты здоровья животных: метод. рекомендации / В.В. Селиверстов, А.Г. Шахов. - М.: Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, 2000. - 246 с.
11. Арабська, Л.П. Бурштинова кислота та можливють 11 застосування у педiатрil / Л.П. Арабська, О.А. Смiрнова, С.1. Толкач, К.В. Несвгтайлова // Перинатоло-гия и педиатрия. - 2006. - № 1 (25). - С. 72-76.
УДК 636.2.082.454.615.3
ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ОПЛОДОТВОРЯЕМОСТИ КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКИТВНОГО ПРЕПАРАТА «СТИМУЛИН-ВЕТ»
В.И. ШЕРЕМЕТА, Н.С. ГРУНТКОВСЬКИЙ Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины г. Киев, Украина, 43022
(Поступила в редакцию 21.01.2013)
Введение. Интенсивное производство продукции скотоводства неразрывно связано с высоким уровнем воспроизводства поголовья. Животные должны иметь высокий надой молока с достаточно высоким содержанием в нем жира и белка. Поддержание такого уровня производительности в течение всего периода эксплуатации без снижения воспроизводительной способности могут обеспечить только здоровые животные [4]. В результате многочисленных исследований установлена антагонистическая связь между молочной продуктивностью и воспроизводительной функцией. У коров с молочной продуктивностью 5000-7000 кг и более наблюдается снижение воспроизводительной способности по всем показателям по сравнению с животными, у которых надои составляют 3000-3900 кг молока за лактацию, что подтверждается отрицательной корреляционной связью (r = -0,71) между удоем и оплодотворяемостю [3, 5, 12, 14]. Существует концепция, согласно которой высокая молочная продуктивность коров отрицательно влияет на их эстральное поведение, но не на восстановление функции яичников после отела [2]. Данная концепция имеет один недостаток, суть которого заключается в том, что эстральное поведение коров зависит от уровня эстрогенов в крови, которые продуцируют растущие фолликулы диаметром более 0,5 мм. Поэтому очевидно, первичное значение имеет восстановление функции яичников после отела, на которое влияет молочная продуктивность.
Высокая концентрация животных, гиподинамия, неполноценное кормление, стрессовые ситуации и другие негативные факторы отрицательно влияют на физиологические процессы в организме и, в частности, на морфофункциональное состояние половой системы коров. Поэтому среди причин выбраковки животных нарушение воспроизводительной способности составляет 24-27 % [4].
