CC BY
51
УДК 616-001.18-097:615.356
КОРРЕКЦИЯ ЭТАНОЛОМ И ЖИРОРАСТВОРИМЫМИ ВИТАМИНАМИ ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ОСТРОМ ХОЛОДОВОМ СТРЕССЕ
© Лосенок С.А., Бровкина И.Л., Прокопенко Л.Г.
Кафедра спортивной медицины и медицинской реабилитации, кафедра военной и экстремальной медицины, кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]. ru
Установлено, что охлаждение снижает функционально-метаболическую активность нейтрофилов, иммунологическую реактивность организма, угнетает антиоксидантный статус клеток и вызывает иммуносу-прессирующие свойства у легких эритроцитов. Сочетанное введение этанола с жирорастворимыми витаминами, особенно с менадионом, приводило к повышению функционально-метаболической активности нейтрофилов и гуморального иммунного ответа. Строма эритроцитов, включавшая менадион, индуцирует выделение хелперных цитокинов прилипающими к стеклу при температуре 32-37°С, а строма эритроцитов, включавшая менадион и обработанная этанолом, влияла на выделение хелперных цитокинов как прилипающими, так и не прилипающими клетками селезенки охлажденных животных. Более выраженный иммуномодулирующий эффект вызывает строма эритроцитов, включавшая менадион и обработанная этанолом.
Ключевые слова: иммуномодуляция, антиоксидантный статус, этанол, жирорастворимые витамины, охлаждение.
CORRECTION OF IMMUNE METABOLIC DISTURBANCES IN ACUTE COLD STRESS WITH ETHANOL AND FAT-SOLUBLE VITAMINS Losenok S.A., Brovkina I.L., Prokopenko L.G.
Sports Medicine and Medical Rehabilitation Department, Military and Extreme Medicine Department, Biochemistry Department of the Kursk State Medical University, Kursk Cooling has been estimated to reduce the functional metabolic activity of neutrophils, the immunologic reactivity of the body, depresses the antioxidant status of the cells and causes the immune suppressive properties in light erythrocites. Combined administration of ethanol with fat-soluble vitamins, especially with menadion, resulted in the increase in functional metabolic activity of neutrophils and in humoral immune response. The stroma of the erythrocites including menadion induces the release of helper cytokines sticking to the glass at 32-37 °C, and the stroma of erythrocites including menadion and treated with ethanol influenced the release of helper cytokines by both sticking and non-sticking cells of the spleen of the cooled animals. Stroma of erythrocites including menadion and treated with ethanol causes more pronounced immune modulating effect.
Key words: immune modulation, antioxidant status, ethanol, fat-soluble vitamins, cooling.
Переохлаждение организма индуцирует развитие адренергических реакций, одним из составных звеньев которых является разобщение процессов окислительного фосфори-лирования. Это приводит к увеличению утечки электронов их дыхательной цепи, ускорению генераций активных форм кислорода, повышению интенсивности перекисного окисления липидов клеточных мембран, снижению функциональной активности различных типов клеток, в том числе и иммуноци-тов [9, 26].
Поступление в организм небольших доз этанола приводит к повышению иммуноло-
гической реактивности [2]. После охлаждения существенно повышается потребность в витаминах, обладающих антиоксидантными свойствами [19]. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о выраженном усилении иммуномодулирующего эффекта при совместном применении мембранотропных соединений и жирорастворимых витаминов [20]. Можно было предположить, что введение этанола с препаратами этих витаминов окажет более выраженное корригирующее влияние на вызванные охлаждением имму-нометаболические нарушения, чем раздельное их применение.
Принимая во внимание изложенное, было изучено влияние этанола и жирорастворимых витаминов на иммунологическую реактивность организма, функционально-метаболическую активность нейтрофилов, метаболические параметры печени и эритроцитов, им-мунотропные свойства последних.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на крысах Ви-стар массой 180-200 г. Для получения статистически достоверных результатов формировали группы из 8-10 животных. Острый холо-довый стресс моделировали содержанием животных в воде при температуре 5±1°С в течение 60 минут. Этанол вводили внутриже-лудочно 5 -кратно с 12 часовым интервалом в разовой дозе 1 мг/кг, а ретинола ацетат, токоферола ацетат, менадион - внутримышечно в дозах 5 мг/кг, 10 мг/кг и 1 мг/кг соответственно по отдельности или в парных сочетаниях.
Животных иммунизировали внутрибрю-шинно эритроцитами барана (ЭБ) (10 клеток/100 г массы тела). Через 5 суток определяли выраженность гуморального иммунного ответа (ГИО) (по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [14] и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по разнице массы регионарного и контрлатерального лимфатических узлов -РМЛ). Активность кислородзависимых бактерицидных механизмов нейтрофилов оценивали в спонтанном и индуцированном зимо-заном тесте восстановления нитросинего тет-разолия (НСТ-сп. и НСТ-инд.) [27]. Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови исследовали после их инкубации в течение 30 мин. при 37°С с латексом. При этом фагоцитарное число (количество части латекса, захваченных одним нейтрофилом, ФЧ) и фагоцитарный индекс (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, ФН) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза [15]. В сыворотке крови определяли биохимические показатели, характеризующие выраженность перекисного окисления липидов - по концентрации диеновых конъюгатов (ДК) [23] и малонового диальдегида (МДА) [24], синдрома цитолиза гепатоцитов - по активности аспартат- и ала-
нинаминотрансфераз (АСТ и АЛТ), синдрома холестаза - по активности щелочной фосфа-тазы (ЩФ) и концентрации общего билирубина (ОБ) [16].
Эритроциты выделяли по В. Beutler [23] и фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина [8]. Выделяли 2 фракции: легкие, плотность которых <1,079 г/см , и тяжелые, плотность которых >1,117 г/см3. Иммуномодулирующую активность эритроцитов и их фракций определяли путем 3-кратного (с 24 часовым интервалом) внутривенного введения клеток (107/100 г массы) аллогенным животным.
Клетки селезенки интактных животных освобождали от эритроцитов гемолитическим шоком и фракционировали по их способности прилипать к стеклу при различной температуре [21]. К прилипающим и неприлипающим спленоцитам интактных крыс 107 клеток на 1 мл среды добавляли эритроциты охлажденных, получавших этанол и витамины крыс (соотношение спленоцитов и эритроцитов 1:2) и инкубировали в течение 48 часов. После инкубации клетки осаждали центрифугированием, а супернатанты прилипающих и неприлипающих к стеклу клеток (СПКС и СНКС) концентрировали путем диализа и фракционировали на сефадексе G-150 [7]. Получали 3 белковых фракции - фракция I, содержащая белки с молекулярной массой более 150 кД, фракция II - белки с молекулярной массой 50-60 кД, и фракция III - белки с молекулярной массой 10-15 кД и ниже. Активность супернатантов оценивали путем пятикратного (с 24-часовым интервалом) внутрибрюшинного введения их интактным крысам в объеме, содержавшем 100 мкг белка на 100 г массы тела. Одновременно с первой инъекцией исследуемого материала животных иммунизировали ЭБ. Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средних арифметических (М) и средних ошибок средних ^). Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Манна-Уитни [5, 6].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что охлаждение приводит к повышению содержания ДК и МДА, увели-
чению активности АЛТ и АСТ крови, значительному снижению функциональнометаболической активности (ФМА) нейтро-филов, развития гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), появлению иммуно-супрессирующих свойств у легких эритроцитов.
Введение этанола или менадиона не оказывало влияния на функционально-метаболическую активность полинуклеаров периферической крови, а также на развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ (рис. 1). Ретинол
ацетат (РА) и токоферол ацетат (ТА) повышали активность нейтрофилов и развитие ГИО (но не ГЗТ). Введение этанола с РА, ТА или менадионом приводило к выраженному повышению фагоцитарной и функциональной активности нейтрофилов, а также иммунологической реактивности в отношении ЭБ (рис. 2).
Инъекции этанола, ТА или менадиона не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. В отличие от этого РА обусловливали возникновение у тяжелых
80
70
60
50
40
30
20
10
0
|Ь |Ъ
*1,2
А
*1,2
*1-5
і
*1-5
т— --- —I—'—'—— --- —I—'—'—I—'—'—I— --- —Г
1 2 3 4 5 6 7 8
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0,5
*1,2
І
Б
*1,2
і
*1-5
*1-5 *1-5 т
1 2 3 4 5 6 7 8
25
20
15
10
і
її
В
*1,2 т
1,2
*1-5
|Ь
-т *1-5
*1-5
60
50
40
30
20
10
*
Г
*1,2
*1,2
ЙІ
*1-5
*1-5
*1-5
1 2 3 4 5 6 7 8
ж
0
*
5
0
0
Рис. 1. Влияние этанола и жирорастворимых витаминов на ФМА нейтрофилов крови крыс. Обозначения: А - ФЧ, Б - ФИ, В - НСТ-сп., Г - НСТ-инд.
По оси абсцисс: 1 - без введения препаратов, 2-5 - введение этанола, РА, ТА или менадиона соответственно, 6-8 -введение этанола с РА, ТА или менадионом соответственно.
По оси ординат: А, В, Г - %; Б - число частиц на 1 клетку.
70
60
50
40
30
20
10
0
А
*1, 2
*1,2
А
*1-5
*1-5
*1-5
1 2 3 4 5 6 7 8
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*1,2
[Ь
Б
*1-5 *!-5
*1,2
|Ь
*1-5
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 2. Влияние этанола РА, ТА и менадиона на развитие ГИО и ГЗТ у крыс.
Обозначения: А - АОК, Б - РМЛ.
По оси абсцисс: 1 - без введения препаратов, 2-5 - введение этанола, РА, ТА или менадиона соответственно, 6-8 введение этанола с РА, ТА или менадионом соответственно.
По оси ординат: А - тыс./орган; Б - мг.
эритроцитов слабовыраженной хелперной активности. Инъекции этанола с РА индуцировали появление у эритроцитов иммуностимулирующих свойств, выраженность которых была существенно выше, чем у эритроцитов крыс, получавших инъекции только РА. Введение этанола с ТА или менадионом не сопровождалось появлением иммуномодулирующих свойств у эритроцитов. Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что этанол в дозе 1 мг/кг не индуцирует появления иммуностимулирующих свойств у эритроцитов, но повышает чувствительность этих клеток к действию РА. В связи с изложенным интересно было изучить влияние эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанных этанолом, на функции нейтрофилов и развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ у животных, получавших инъекции препаратов жирорастворимых витаминов.
Проведенные эксперименты показали, что введение крысам эритроцитов, обработанных этанолом, не влияло на активность нейтро-филов и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции обработанных этанолом эритроцитов животным, получавшим РА и ТА, повышали активность нейтрофилов и стимулировали развитие иммунного ответа в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без экстракорпорально модифицированных эритро-
цитов. Введение обработанных этанолом эритроцитов крысам, получавшим менадион, не оказывало влияния на активность нейтро-филов и развитие иммунного ответа. Можно предположить, что экстракорпоральная обработка эритроцитов этанолом сенсибилизирует их к интракорпоральному взаимодействию с витаминами А или Е. Не исключено также, что интракорпоральное введение последних сенсибилизирует нейтрофилы к взаимодействию с экстракорпорально обработанными этанолом эритроцитами.
Изучено влияние сочетанного введения этанола и препаратов жирорастворимых витаминов на ФМА и иммунологическую реактивность охлажденных крыс. Установлено, что этанол и РА нормализовали ФМА нейтрофилов крови, а также развитие ГИО и ГЗТ у охлажденных крыс (табл. 1). Этанол, введенный с ТА, нормализовал ФМА нейтрофилов и развитие ГИО, но не оказывал существенного влияния на выраженность ГЗТ (табл. 2). Этанол с менадионом усиливали (но не нормализовали) ФМА нейтрофилов и развитие ГИО и не влияли на выраженность ГЗТ (табл. 3).
Инъекции этанола и РА интактным крысам индуцировали появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Введение этих препаратов охлажденным крысам предотвращало появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующих
Таблица 1
Влияние этанола и РА на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность
при охлаждении (M±m)
Показатели Контроль Введение этанола и РА Oхлаждeниe Охлаждение, введение этанола и РА
1 2 3 4 5
ФИ, % 47,1±3,8 66,3±5,0*2 23,9±2,6*2,3 44,9±3,7*3,4
ФЧ 1,5±0,1 2,4±0,2*2 0,7±0,1*2,3 1,4±0,1*3,4
НСТ-сп.,% 13,2±0,9 18,5±1.1*2 7,4±0,7*2,3 13,8±0,8*3,4
НСТ-инд., % 32,3±1,9 39,4±2,3*2 20,5±1,6*2,3 33,8±1,8*3,4
АОК, тыс./орган 26,4±2,8 63,7±6,8*2 9,2±1,1 *2,3 23,9±2,7*3,4
РМЛ, мг 4,5±0,5 6,8±0,7*2 2,6±0,3*2,3 4,3±0,5*3,4
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 2, 3, 4.
Таблица 2
Влияние этанола и ТА на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность
при охлаждении (M±m)
Показатели Контроль Введение этанола и ТА Oхлаждeниe Охлаждение, введение этанола и ТА
1 2 3 4 5
ФИ, % 47,1±3,8 59,4±4,2*2 23,9±2,6*2,3 54,3±3,6*3,4
ФЧ 1,5±0,1 2,4±0,3*2 0,7±0,1 2,3 1,3±0,2*3,4
НСТ-сп., % 13,2±0,9 17,0±1,2*2 7,4±0,7*2,3 12,5±1,0*3,4
НСТ-инд., % 32,3±1,9 43,4±2,4*2 20,5±1,6*2,3 34,0±2,2*3,4
АОК, тыс./орган 26,4±2,8 58,3±6,2*2 9,2±1,1 2,3 24,8±2,6*3,4
РМЛ, мг 4,5±0,5 6,0±0,8*2 2,6±0,3*2,3 2,9±0,4*3,4
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 2, 3, 4.
Таблица 3
Влияние этанола и менадиона на ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность
при охлаждении (M±m)
Показатели Контроль Введение этанола и менадиона Oхлаждeниe Охлаждение, введение этанола и менадиона
1 2 3 4 5
ФИ, % 47,1±3,8 61,7±4,0*2 23,9±2,6*2,3 36,5±3,1*2-4
ФЧ 1,5±0,1 2,5±0,3*2 0,7±0,1*23 1,2±0,2*2-4
НСТ-сп., % 13,2±0,9 15,7±0,9*2 7,4±0,7*2,3 10,5±0,8*2-4
НСТ-инд., % 32,3±1,9 45,9±2,5*2 20,5±1,3*2,3 27,4±1,5*2-4
АОК, тыс./орган 26,4±2,8 55,4±5,8*2 9,2±1,1 *2,3 17,0±1,9*2-4
РМЛ, мг 4,5±0,5 6,2±0,8*2 2,6±0,3*2,3 2,8±0,3*’2-4
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 2, 3, 4.
свойств и индуцировало появление иммуно- Сыворотка крови охлажденных крыс, по-
стимулирующей активности у тяжелых кле- лучавших этанол и РА, при экстракорпораль-
ток (табл. 4). ной обработке индуцировала появление им-
муносупрессирующих свойств у эритроцитов интактных крыс.
Эритроциты неохлажденных крыс, получавших этанол и РА, после экстракорпоральной обработки сывороткой охлажденных крыс вызывали такой же иммуностимулирующий эффект, как и эритроциты, не обработанные сывороткой охлажденных крыс.
Это позволяет считать, что этанол и РА не влияют на накопление в сыворотке крови соединений, индуцирующих появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств, но повышают резистентность эритроцитов к действию таких соединений.
Принципиально новые перспективы перед иммунофармакологией открываются в связи с разработкой технологии получения иммобилизированных лекарственных средств, и в первую очередь адсорбцией на целых клетках [13, 25]. Иммобилизация лекарственных соединений с использованием полупроницаемых оболочек предусматривает включение молекул вещества в строму эритроцитов. Это позволяет получить препараты с высоким содержанием включенных лекарств. Иммобилизованные в мембранных структурах соединения хорошо сохраняют свою активность и более эффективно взаимодействуют с клетками-мишенями [6]. Направленный транспорт лекарственных веществ в фагоцитиру-
ющие клетки печени и селезенки осуществляют с помощью эритроцитов. Доступным для практического использования методом включения лекарственных соединений в строму эритроцита является гипоосмотиче-ский гемолиз [4].
Принимая во внимание изложенное, было изучено влияние менадиона и этанола, связанных со стромой эритроцитов интактных и охлажденных крыс, на развитие иммунного ответа у неохлажденных и охлажденных животных. Менадион включали в строму эритроцитов методом гипоосмотического гемолиза. Стромальные сферы, включившие мена-дион, обрабатывали этанолом и вводили вну-трибрюшинно троекратно с интервалом 12 ч по 10 частиц на 1 кг массы тела.
У крыс получавших инъекции стромы эритроцитов интактных крыс, включившей менадион, количество АОК в селезенке было в 4,6 раза большим, чем у контрольных животных. Строма эритроцитов охлажденных крыс, включавшая менадион, также стимулировала развитие иммунного ответа у неохлажденных животных, однако стимуляция была выражена в меньшей степени, чем при введении стромы эритроцитов интактных крыс (при инъекции такой стромы количество АОК было в 3,3 раза выше, чем в контроле).
Таблица 4
Иммуномодулирующие свойства эритроцитов охлажденных и неохлажденных крыс,
получавших этанол и РА (М±т)
№ п/п Условия опыта АОК тыс./орган РМЛ, мг
1. Контроль(без введения эритроцитов) 24,7±2,8 4,6±0,5
2. Введение ЛЭ интактных крыс 23,0±2,6 4,6±0,6
3. Введение ТЭ интактных крыс 26,1±2,9 4,8±0,6
4. Введение ЛЭ крыс, получавших этанол и РА 23,5±2,7 4,5±0,5
5. Введение ТЭ крыс, получавших этанол и РА 63,2±6,8*1-4 6,8±0,7*1-4
6. Введение ЛЭ охлажденных крыс 13,2±1,8*1-5 3,1±0,3*1-5
7. Введение ТЭ охлажденных крыс 26,0±2,8*5,6 4,4±0,5*5,6
8. Введение ЛЭ неохлажденных крыс, получавших этанол и РА 22,9±2,7*5,6 4,3±0,4*5,6
9. Введение ТЭ неохлажденных крыс, получавших этанол и РА 57,2±6,1*1-4, 6-8 6,3±0,6*1-4, 6-8
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 1 -8.
Таблица 5
Влияние этанола на иммуномодулирующую активность включенного в строму эритроцитов
менадиона (М±т)
№ п/п Условия опыта АОК, тыс./орган РМЛ, мг
1. Контроль (без охлаждения и 21,8±2,7 4,9±0,5
введения стромы эритроцитов)
2. Введение стромы без менадиона 22,5±2,6 4,8±0,5
3. Введение СЭВМ 91,6±10,2*1,2 6,8±0,7*1,2
4. Введение СЭВМОЭ 141,6±14,7*1-3 9,1±0,9*1-3
5. Охлаждение 7,2±0,9*1-4 2,7±0,2*1-4
6. Охлаждение, введение стромы без менадиона 8,0±0,9*1-4 2,9±0,2*1-4
7. Охлаждение, введение СЭВМ 16,8±1,7*1-6 3,6±0,3*1-6
8. Охлаждение, введение СЭВМОЭ 22,6±2,3*2-7 4,7±0,4*3-/
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 1-7.
Принципиально важным является тот факт, что строма эритроцитов интактных и охлажденных крыс, включавшая менадион, нормализовала развитие иммунного ответа на ЭБ у охлажденных животных.
Иммуномодулирующую активность стромы эритроцитов, включавшей менадион (СЭВМ), вероятно, можно повысить путем экстракорпоральной обработки их этанолом, который, по-видимому, может служить дополнительным фактором изменения композиции эпитопной структуры поверхностного слоя мембраны. Вызванная этанолом модификация поверхности стромы эритроцитов, вероятно, послужит причиной повышения эффективности взаимодействия ее с макро-фагальными и лимфоидными клетками, приводящего к выделению последними иммуно-регуляторных цитокинов [18].
СЭВМ обработанные этанолом (СЭВМОЭ) стимулировали развитие иммунного ответа на ЭБ в большей степени, чем необработанные этим препаратом (табл. 5).
Изучено влияние СЭВМ и СЭВМОЭ на выделение цитокинов клетками селезенки. Оказалось, что первый препарат индуцировал выделение хелперных цитокинов прилипающими, а второй - прилипающими и неприлипающими к стеклу спленоцитами.
Практически важным является вопрос об иммуномодулирующей активности СЭВМ и СЭВМОЭ, полученных при использовании стромы эритроцитов охлажденных крыс. Эксперименты, проведенные для решения
этого вопроса, показали, что такие препараты стимулируют развитие иммунного ответа у здоровых и охлажденных крыс.
Изучено влияние охлаждения на активность иммунорегуляторных клеток селезенки крыс и изменение этой активности после введения охлажденным крысам СЭВМОЭ. Ин-тактным крысам внутрибрюшинно вводили СПКС и СНКС охлажденных крыс и иммунизировали их ЭБ. Установлено, что СПКС и СНКС охлажденных крыс супрессировали развитие иммунного ответа, причем эффект СПКС был выражен сильнее, чем неприлипающих. Супернатанты клеток селезенки охлажденных крыс, получавших инъекции СЭВМОЭ, при аллогенном переносе не влияли на развитие иммунного ответа или стимулировали его. Это позволяет сделать вывод, что иммуностимулирующее действие препаратов обусловлено их угнетающим влиянием на функцию антигеннеспецифических супрессоров селезенки.
Прилипающие к стеклу клетки селезенки охлажденных и получавших СЭВМОЭ крыс, выделяют иммуносупрессирующие и иммуностимулирующие факторы. В связи с этим возник вопрос: выделяются ли разные по функциональной активности факторы одной субпопуляцией прилипающих к стеклу клеток или они являются продуктами разных субпопуляций. Для решения этого вопроса клетки селезенки фракционировали по способности к адгезии в зависимости от температуры среды. Исследована иммуномодули-
рующая активность супернатантов клеток неохлажденных и охлажденных крыс, получавших СЭВМОЭ. Оказалось, что иммуносу-прессирующий фактор выделяется клетками охлажденных животных, прилипающими к стеклу при 4°С и 10°С, а иммуностимулирующий фактор - клетками обеих групп крыс, прилипающими при 32°С и 37°С (табл. 6).
Клетки селезенки охлажденных крыс, получавших инъекции СЭВМОЭ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре среды, культивировали в течение 6 часов, получали супернатант и тестировали его на наличие иммуномодулирующей, антиоксидантной и гепато-протекторной активности. Установлено, что супернатант клеток прилипающих к стеклу при 4-10°С супрессирует у аллогенных животных развитие иммунного ответа на ЭБ. После фракционирования СПКС и СНКС на сефадексе 0-150 установлено, что фракция II клеток прилипающих при 4-100С обладала иммуносупрессирующей активностью, а фракция III клеток прилипающих при 32-37°С - хелперными свойствами. Супрессиру-ющая и хелперная активность фракций (200 мкг белка) не отличалась от активности объема содержащих их СПКС. При введении 200 мкг белка фракции II и объема, содержащего
ее супернатанта, активность фракции была ниже активности ее супернатанта. Смесь фракций II и III (1:1 по белку) вызывала такой же иммуномодулирующий эффект, как не-фракционированный супернатант, а смесь фракций I и III - такой же эффект, как изолированная фракция III (табл. 7).
Фракция III СНКС при аллогенном переносе стимулировала у реципиентов развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракциониро-ванного супернатанта. Остальные фракции не влияли на выраженность реакции индуцированной ЭБ. Результаты этих экспериментов показывают, что в состав фракции III входит фактор, стимулирующий развитие иммунного ответа на ЭБ, а фракция II СПКС содержит фактор, усиливающий иммуностимулирующую активность фактора фракции III.
Определение антиоксидантной и гепато-протекторной активности фракций СПКС и СНКС показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37°С, снижает содержание ДК и МДА, активность АЛТ, АСТ и ЩФ, концентрацию билирубина у охлажденных крыс. Остальные фракции не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов (табл. 8).
Таблица 6
Иммуномодулирующая активность супернатантов фракций прилипающих к стеклу клеток селезенки, выделенных в температурном градиенте (М±т)
№ п/п Условия опыта АОК, тыс./орган РМЛ, мг
1. Введение СПКС интактных крыс 27,8±3,2 5,1±0,4
СПКС неохлажденных крыс, получавших СЭВМОЭ
2. Введение СПКС, выделенных при 4°С 25,8±2,9 5,3±0,4
3. Введение СПКС, выделенных при 10°С 26,1±3,2 4,9±0,5
4. Введение СПКС, выделенных при 22°С 24,5±3,0 5,3±0,5
5. Введение СПКС, выделенных при 28°С 30,1±3,4 4,8±0,4*1-5
6. Введение СПКС, выделенных при 32°С 81,7±9,2*1-5 7,3±0,6
7. Введение СПКС, выделенных при 37°С 93,8±11,0*1-5 9,9±0,7*1-5
СПКС охлажденных крыс, получавших СЭВМОЭ
8. Введение СПКС, выделенных при 4°С 8,4±1,0*1 3,0±0,2
9. Введение СПКС, выделенных при 10°С 7,3±0,9*1 2,7±0,2
10. Введение СПКС, выделенных при 22°С 29,4±3,6 2,8±0,3
11. Введение СПКС, выделенных при 28°С 25,4±3,0 3,1±0,3
12. Введение СПКС, выделенных при 32°С 61,3±6,8*1-11 5,2±0,4*1, 8-11
13. Введение СПКС, выделенных при 37°С 55,1±6,1*1-11 6,4±0,5*1, 8-11
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 1-11.
Таблица 7
Влияние фракций клеток селезенки охлажденных крыс, получавших инъекции СЭВМОЭ, на развитие иммунного ответа у интактных крыс (М±т)
№ п/п Условия опыта АОК, тыс./орган РМЛ, мл
1. Контроль 24,3±2,5 5,4±0,5
Клетки селезенки, неприлипающие к стеклу
2. Введение супернатанта 50,6±5,2*1 8,4±0,8М
3. Введение фракции I 24,8±2,9 5,2±0,5
4. Введение фракции II 22,6±2,7 5,5±0,6
5. Введение фракции III 53,3±6,1*1 7,9±0,7*1
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 4 М0°С
6. Введение супернатанта 9,0±1,3*1 3,3±0,3*1
7. Введение фракции I 23,5±2,6 5,2±0,6
8. Введение фракции II 9,8±1,2*1 3,1±0,3*1
9. Введение фракции III 24,0±2,8 5,2±0,6
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 32-37°С
10. Введение супернатанта 64,5±7,1*1 9,6±0,8М
11. Введение фракции I 25,4±3,1 5,5±0,4
12. Введение фракции II 24,2±2,7 5,3±0,4
13. Введение фракции III 49,5±5,3*11,12 7,9±0,8*11,12
14. Введение фракции I + III 47,3±5,2*11,13 7,4±0,8*11,13
15. Введение фракции П+ III 69,2±7,5*12,13 9,1±0,8*12,13
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями групп 1, 11, 12, 13.
Таблица 8
Влияние фракций супернатантов клеток селезенки охлажденных крыс, получавших СЭВМОЭ, на биохимический статус охлажденных крыс, не получавших инъекции СЭВМОЭ (М±т)
№ п/п Условия опыта АЛТ мкмоль/ (чхл) АСТ мкмоль/ (чхл) ЩФ нмоль/ (чхл) ОБ мкмоль/л ДК нмоль/л МДА мкмоль/л
1. Охлаждение 3,4±1,2 1,8±0,3 15,4±2,2 5,6±0,8 9,5±0,9 19,0±2,3
Введение фракций супернатантов спленоцитов, прилипающих к стеклу при 4-10°С
2. Введение фракции I 3,5± 1,0 1,7±0,3 17,4±2,3 5,4±0,7 9,4±0,8 18,4±2,5
3. Введение фракции II 3,8± 1,3 2,0±0,4 18,7±2,4 5,8±0,6 9,0±0,8 19,2±2,3
4. Введение фракции III 3,6± 1,4 2,2±0,4 15,8±2,1 6,0±0,8 8,7±0,8 16,4±2,2
Введение фракций супернатантов спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37°С
5. Введение фракции I 1,3±0,4*1 0,5±0,1*1 8,1±1,0*1 3,2±0,5*1 3,7±0,6*1 10,4±1,3*1
6. Введение фракции II 3,9±1,1 2,0±0,4 17,2±2,2 6,9±0,7 9,2±1,1 19,6±2,3
7. Введение фракции III 3,5± 1,0 1,7±0,4 18,4±2,0 6,2±0,8 8,9± 1,0 20,8±2,5
Введение фракций супернатантов спленоцитов, неприлипающих к стеклу
8. Введение фракции I 3,5±0,9 1,7±0,2 17,6±2,4 5,4±0,8 9,4± 1,0 17,3±2,4
9. Введение фракции II 3,8± 1,3 2,0±0,3 18,0±2,5 5,7±0,7 9,2±1,1 19,0±2,2
10. Введение фракции III 4,0±1,1 1,8±0,3 16,9±2,0 6,1±0,8 9,0± 1,0 17,5±2,3
Примечание. * - р<0,05 по сравнению со значениями группы 1.
В результате проведенных исследований установлено, что введение при охлаждении этанола или менадиона по отдельности не влияло на иммунологическую реактивность животных. Ретинол ацетат и токоферол аце-
тат повышали активность нейтрофилов и развитие ГИО. Сочетанное введение этанола с жирорастворимыми витаминами приводило к повышению функционально-метаболической активности нейтрофилов и гуморального им-
мунного ответа, выраженность которого значительнее, чем раздельное введение препаратов. Строма эритроцитов, включившая мена-дион (СЭВМ), индуцирует выделение хел-перных цитокинов прилипающими к стеклу при температуре 32-37°С, а строма эритроцитов, включившая менадион и обработанная этанолом (СЭВМОЭ), влияла на выделение хелперных цитокинов как прилипающими, так и неприлипающими клетками селезенки охлажденных животных. Более выраженный иммуномодулирующий эффект вызывает СЭВМОЭ.
Имеющиеся в доступной литературе данные свидетельствуют, что природные витамины К и их аналоги обладают антиоксидан-тыми свойствами и энергезирующей активностью [1, 17, 29].
Нафтохиноны усиливают развитие иммунного ответа при различных поражениях печени, физических нагрузках [22], холодо-вом стрессе [3], токсических формах анемии [11].
Полученные результаты позволяют рекомендовать применение малых доз этанола и менадиона с целью адекватной коррекции иммунометаболических нарушений при охлаждении.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авакумов В.М., Ковлер М.А., Кругликова-Ивовен Л.П. Лекарственные средства метаболической терапии на основе витаминов и ко-ферментов // Вопр. мед. химии. - 1992. -Т. 38, вып. 4. - С. 69.
2. Алиев Н.А. Иммунопатология алкоголизма // Иммунология. - 1989. - № 1. - С. 7-11.
3. Быстрова Н.А., Бровкина И.Л., Прокопенко Л.Г., Утешев Б.С. Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов К и его усиление рибоксином при остром холодовом стрессе // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2000. - Т. 63, № 5. - С. 50-53.
4. Генинг Т.П., Колкер Н.И., Жумадилов Ж.Ш. Использование форменных элементов крови для направленной доставки химиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения // Антибиотики и химиотерапия. -1988. - № 11. - С. 867-871.
5. Гублер Е.В. Вычислительные меры анализа и распознавание патологических процессов. -Л.: Медицина, 1978. - 294 с.
6. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медикобиологических исследованиях. - Л.: Медицина, 1973. - 141 с.
7. Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Ме-ер, 1970. - 252 с.
8. Жумадилов Ж.Ш., Макаренкова Р.В. Особенности включения некоторых антибиотиков в эритроцитарные тени - систему целенаправленной доставки химиотерапевтических препаратов // Антибиотики и химиотерапия. -1990. - Т. 35, № 11. - С. 54-56.
9. Иванов К.П. Изменение физиологических функций и температурные границы жизни при гипотермии // Успехи физиол. наук. -1996. - Т. 27, № 3. - С. 84-105.
10. Кобзев Т.В., Троицкая Н.А., Куприенко В.И., Кобзева О.М. Методика разделения эритроцитов на возможные группы // Патол. системы крови и кровообращения. - Симферополь, 1978. - 38 с.
11. Конопля А.А., Бровкина И.Л. Иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов при токсических формах анемий // Метабол. иммуномодуляция / Под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. -С. 112-120.
12. Лакин Г.Ф. Биометрия - М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.
13. Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизированные биопрепараты в медицине. - М.: Медицина, 1980. - 126 с.
14. Мальберг К., Зигль Э. Метод локального гемолиза // Иммунологические методы; пер. с нем. / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С. 57-72.
15. Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - № 2. - С. 19-20.
16. Меньшиков В.В., Делектарская Л.Н. Методы клинической биохимии // Лабораторные методы исследования в клинике. - М.: Медицина, 1987. - С. 174-276.
17. Назаров Л.В., Лидер В.А. К механизму мембраностабилизирующего действия витаминов К и Е в условиях хронической интоксикации белых крыс фенолом // Вопр. питания. -1996.- № 2.- С. 11-14.
18. Павлова М.В., Бровкина И.Л., Быстрова Н.А., Гаврилюк В.П. Иммунометаболические нарушения в условиях экспериментальной эта-нольной интоксикации // Вестн. новых медицин. технологий. - 2007. - Т. XIV, № 2. -С. 9-11.
19. Прокопенко Л.Г., Быстрова Н.А., Бровкина И.Л. и др. Иммунометаболические ас-
пекты холодового стресса. - Курск, 1999. -112 с.
20. Прокопенко Л.Г., Конопля А.И. Метаболическая иммуномодуляция. - Курск, 2000. -308 с.
21. Родионов С.М., Патним В.И., Макаренко И.Г., Земсков В.М. Новый подход к изучению гетерогенности макрофагов // Иммунология. - 1985. - № 3. - С. 34-37.
22. Рыбников В.Н., Ласкова И.Л., Прокопенко Л.Г. Нафтохиноны как иммуномодуляторы при интенсивных физических нагрузках // Антибиотики и химиотерапия. - 1997. -№ 3. - С. 6-10.
23. Стальная Н.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Соврем. методы в биохимии / Под. ред. В.Н. Ореховича - М., 1977. - С. 63-64.
24. Стальная Н.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью
тиабарбитуровой кислоты // Соврем. методы в биохимии / Под. ред. В.Н. Oрeхoвича - М., 1977.- С. 66-6S.
25. Тривен М. Иммобилизированные ферменты / пер. с англ. - М.: Мир, 19S3. - 213 с.
26. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. - М.: Мир, 1988. - 568 с.
27. Щербаков В.И. Применение НСТ-теста для оценки чувствительности нейтрофилов к стимуляторам // Лаб. дело. - 19S9. - № 2. -С.30-33.
2S. Beutler B., Vilsark J., Cermal A. Cachection tumor necrosis factor: production, distribution and metabolic fate in vivo. - 19S5. - Vol. 135. -Р.3972-3977.
29. Griffith H.W. Vitamin, herb, minerals and supplements. - London: Fisher books, 2002. -1052 p.
