CC BY
18
диагностика
УДК 616.932:616-07
Д.А.Агафонов, С.П.Заднова, Ю.В.Лозовский, Н.И.Смирнова
конструирование пцр-тест-системы для дифференциации генетически измененных токсигенных штаммов vibrio cholerae биовара эль тор с разным эпидемическим потенциалом
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
Разработана мультилокусная ПЦР-тест-система, позволяющая дифференцировать токсигенные генетически измененные штаммы Vibrio cholerae биовара Эль Тор на штаммы с высоким и низким эпидемическим потенциалом на основе определения структуры одного из генетических маркеров возбудителя 7-й пандемии холеры -острова пандемичности VSP-II. В рамках данной работы были подобраны три гена-мишени, расположенные в центральной и краевой областях этого мобильного генетического элемента. Разработанная ПЦР-тест-система позволяет выявлять штаммы, содержащие интактный VSP-II, VSP-II с короткой делецией, а также VSP-II с протяженной делецией. Штаммы с интактным VSP-II или имеющие короткую делецию в острове пандемичности относятся к вариантам с низким эпидемическим потенциалом, в то время как штаммы, содержащие VSP-II с протяженной делецией относятся к вариантам с высоким эпидемическим потенциалом. экспериментально доказана специфичность и эффективность тест-системы при анализе 28 токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор и 6 штаммов близкородственных видов и энтеробактерий. Полученные результаты совпадают с данными монолокусного ПЦР анализа и в ряде случаев подтверждены секвенированием.
Ключевые слова: Vibrio с^Ьгае биовара Эль Тор, мультилокусная ПЦР-тест-система, дифференциация, эпидемический потенциал, остров пандемичности.
D.A.Agafonov, S.P.Zadnova, Yu.V.Lozovsky, N.I.Smirnova
Construction of PCR Test-System for Differentiation between Genetically Altered Toxigenic Vibrio cholerae Strains, Biovar El Tor, with Varied Epidemic Potential
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Designed is a multi-locus PCR test-system that allows for differentiation between genetically altered Vibrio cholerae strains, biovar El Tor, with high and low epidemic potential respectively, based on identification of genetic marker structure in the agent of the seventh cholera pandemic - pandemicity island VSP-II. In the course of investigations selected have been three target genes allocated in the central region and terminal end of the mobile genetic element. This test-system offers the possibility to identify the strains containing intact VSP-II, the ones containing VSP-II with a short-length deletion, and the strains with VSP-II with extended deletion. The first two are classified as the variants with low epidemic potential, while the last ones - as the variants with high epidemic potential. Specificity and efficacy of the test-system is shown by the experiments with 28 toxigenic genetically altered V. cholerae strains, biovar El Tor, and 6 strains of closely related species and enterobacteria. The results obtained coincide with the data on mono-locus PCR assay and in a number of instances are verified by sequencing.
Key words: Vibrio cholerae strains, biovar El Tor, multi-locus PCR test-system, differentiation, epidemic potential, pandemicity island.
Возбудителем текущей, 7-й, пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, является V. сЫ1егае биовара Эль Тор, геном которого в процессе эволюции претерпел значительные изменения. Современный период пандемии (с 1991 г. по настоящее время) характеризуется глобальным распространением в мире высокопатогенных генетически измененных штаммов (геновариантов) V. с^1егае биовара Эль Тор [6]. Установлено, что более высокая вирулентность геновариантов по сравнению с типичными штаммами связана в основном с иной структурой оперона СхАВ, кодирующего холерный токсин (ХТ) - ключевой фактор вирулентности возбудителя холеры [5]. Геноварианты, вытеснившие типичные штаммы во многих эндемичных по холере регионах,
различаются между собой эпидемическим потенциалом, т.е. способностью к эпидемическому распространению. Изменение эпидемического потенциала геновариантов обусловлено изменчивостью их генетических свойств, связанных как с вирулентностью, так и с адаптацией возбудителя к меняющимся условиям окружающей среды.
К настоящему времени известно, что важную роль в широком распространении возбудителя холеры Эль Тор играют два острова пандемичности -VSP-I (от англ. Vibrio seventh pandemic island) и VSP-II [7]. Остров пандемичности VSP-I состоит из 11 генов и является одним из наиболее стабильных генетических маркеров штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. В то же время остров пандемичности VSP-II, со-
держащий 30 открытых рамок считывания (vco489-vco517), продукты которых, видимо, определяют высокий уровень устойчивости возбудителя холеры к стрессовым воздействиям, является вариабельным. К настоящему времени, помимо интактного VSP-II, известно о пяти его вариантах, обнаруженных в штаммах, изолированных в разных странах и отличающихся от интактного VSP-II наличием делеций разной протяженности [8]. Анализ распространенности штаммов с разными вариантами VSP-II показал, что среди эпидемических штаммов, изолированных в последнее десятилетие, доминируют изоляты, содержащие в VSP-II протяженную делецию, захватывающую сегмент ДНК, включающий 21 ген из 30 известных. Глобальное распространение штаммов с такой структурой VSP-II означает наличие у них высокого эпидемического потенциала. Вытеснение этими штаммами ранее возникших геновариантов с ин-тактным VSP-II или геновариантов, имеющих в VSP-II короткие делеции, захватывающие лишь 2-4 гена, указывает на снижение эпидемического потенциала последних. в связи с тем, что в эндемичных очагах холеры циркулируют штаммы с разным эпидемическим потенциалом, способные нанести в разной степени ущерб здоровью населения и экономике страны, актуальным является дифференциация штаммов с высоким и низким эпидемическим потенциалом.
Разработанные к настоящему времени ПЦР-тест-системы позволяют быстро и эффективно определять биовар, серогруппу, токсигенность возбудителя холеры, способны выявлять токсигенные генетически измененные штаммы возбудителя текущей пандемии холеры [1, 2, 3]. Эти изобретения не способны дифференцировать токсигенные генова-рианты с разным эпидемическим потенциалом, что является необходимым для совершенствования методов молекулярно-эпидемиологического мониторинга возбудителя холеры.
Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке информативного и быстрого способа, а также тест-системы для дифференциации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по их эпидемическому потенциалу.
Материалы и методы
В работе использовали 28 генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, содержащих в геноме профаг CTX с геном ctxB классического типа, которые были изолированы в России с 1993 по 2011 год, 3 вида энтеробактерий и 3 штамма бактерий близкородственных видов рода Vibrio. Для культивирования применяли бульон и агар LB (рН 7,6).
подготовку проб осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Огранизация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение
ДНК проводили методом нуклеосорбции на силика-геле в присутствии гуанидинизотиоцианата.
Амплификацию ДНК проводили с использованием программируемого термостата «Терцик» (ДНК-технология, Россия).
Анализ и оценку результатов осуществляли путем сравнения полученных ПЦР-ампликонов с аналогичными фрагментами типичных штаммов V. cholerae.
Результаты и обсуждение
Выбор ДНК-мишеней осуществляли на основании анализа нуклеотидных последовательностей острова пандемичности VSP-II у токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, изолированных в современный период 7-й пандемии и содержащих разные типы этого геномного острова. в качестве первой мишени был выбран ген vco514, кодирующий метил-акцепторный белок хемотаксиса, наличие которого характерно для всех типов VSP-II. в качестве второй мишени был выбран ген vco502, кодирующий пили IV типа, присутствующий в геноме штаммов с интактным островом пан-демичности и штаммов, несущих короткую делецию VSP-II. в качестве третьей мишени был выбран ген vco497, кодирующий регулятор транскрипции и присутствующий только в геноме штаммов с интактным VSP-II. Праймеры сконструированы авторами с помощью программы Oligo 6.0.
В ходе работы экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦр.
Специфичность разработанной тест-системы была подтверждена на основе использования штаммов энтеробактерий - E. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri, а также близкородственных видов - V. mimicus, V. para-haemolyticus, V. anguillarum. Был получен отрицательный результат при проведении ПЦр-тестирования указанных штаммов (рисунок, дорожки 1-6).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Электрофореграмма штаммов с разным эпидемическим потенциалом, полученная с использованием разработанной мультило-кусной ПЦР тест-системы:
1 - E. coli M17; 2 - S. enteritidis ВОЗ; 3 - Sh. flexneri 26 «С»; 4 - V. mimicus АТСС 33653; 5 - Vparahaemolyticus 745; 6- V albensis 37263; 7 - V cholerae M1430; 8 - V. cholerae P18899; 9 - V. cholerae Л-3225; 10 - V. cholerae Л-4150; 11 - V. cholerae 301; 12 - V cholerae M1326; 13 - V cholerae M1293; 14 - V. cholerae M1266; 15 - V. cholerae M1275; 16 - V. cholerae P17647; 17 - ПК-М818 (V. cholerae M818); 18 - ПК-Р17644 (V. cholerae Р17644); 19 - ПК-Л3226 (V. cholerae Л-3226); 20 - ОКВ, К-
ДИАГНОСТИКА
Специфичность и эффективность сконструированной мультилокусной ПЦР-тест-системы
Штамм Год выделения Место выделения Тестируемые гены Тип Эпидемический
vco497 vco502 vco514 VSP-II потенциал
E. coli M17 неизвестен Неизвестно - - - О н/o
S. enteritidis ВОЗ неизвестен Неизвестно - - - О н/o
Sh. flexneri 26 «С» неизвестен Неизвестно - - - О н/o
V mimicus АТСС 33653 неизвестен Институт Пастера - - - о н/o
V. parahemolyticus 745 неизвестен Новороссийск - - - О н/o
V. albensis 37263 неизвестен Ставрополь - - - О н/o
V cholerae M1275 1993 Респ. Дагестан + + + П н
V cholerae M1297 1993 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1278 1993 Респ. Дагестан + + + П н
V cholerae M1279 1993 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1264 1993 Краснодар + + + П н
V. cholerae M1272 1993 Сочи + + + П н
V. cholerae M1299 1993 Сочи + + + П н
V. cholerae M1271 1993 Респ. Татарстан + + + П н
V. cholerae M1270 1993 Респ. Татарстан + + + П н
V. cholerae М1298 1993 Сочи + + + П н
V. cholerae М1266 1994 Пермь + + + П н
V. cholerae M1295 1994 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1287 1994 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1288 1994 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1286 1994 Респ. Дагестан + + + П н
V cholerae M1293 1994 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1269 1994 Магнитогорск + + + П н
V. cholerae P17647 1997 Ачинск - + + КД н
V. cholerae M1326 1998 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1328 1998 Респ. Дагестан + + + П н
V. cholerae M1345 2001 Респ. Татарстан + + + П н
V cholerae M1349 2001 Респ. Татарстан + + + П н
V. cholerae M1429 2004 Респ. Башкирия - - + ПД В
V cholerae M1430 2005 Тверь - - + ПД В
V. cholerae P18899 2006 мурманск - - + ПД В
V cholerae Л-3225 2010 москва - - + ПД В
V. cholerae Л-4150 2010 москва - - + ПД В
V. cholerae 301 2011 Таганрог - - + ПД В
ПК-М818 (V. cholerae M818) 1970 Саратов + + + П н
ПК-Р17644 (V cholerae Р17644) 1997 Ачинск - + + КД н
ПК-л3226 (V. cholerae л-3226) 2010 москва - - + ПД В
Примечания: «-» — отсутствие гена; «+» - наличие гена ; О - отсутствует VSP-II; П - прототипный VSP-II; КД - VSP-II с короткой делецией; ПД - VSP-II с протяженной делецией; H - низкий эпидемический потенциал (неспособность штаммов с указанным генетическим маркером к эпидемическому распространению в современный период); В - высокий эпидемический потенциал (способность штаммов с указанным генетическим маркером к эпидемическому распространению в современный период); н/o - не определяется.
Эффективность сконструированной тест-системы подтверждена исследованием 28 генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. Данные по ПЦР-тестированию представлены в таблице и на рисунке. При оценке структуры их острова пандемичности с помощью разработанной тест-системы было установлено, что у 21 штамма определяется образование трех фрагментов размером 761, 604 и 320 п.н., как и у штамма М818, взятого в качестве контрольного; у 1 штамма, выделенного в Ачинске в 1997 г., двух фрагментов размером 761 и 604 п.н., как у контрольного штамма Р17644. Из этого следует, что данная группа штаммов, изолиро-
ванных в 1993-2001 гг., относится к геновариантам возбудителя холеры с низким эпидемическим потенциалом. Вторая группа состоит из 6 штаммов, VSP-II которых имеет протяженную делецию, поскольку для них характерно образование в ПЦР только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего гену vco514, общему для всех вариантов. Эти штаммы, изолированные в последние годы (2004-2012 гг.), являются геновариантами с высоким эпидемическим потенциалом, о чем свидетельствует их глобальное распространение и вытеснение в эндемичных очагах холеры геновариантов с низким эпидемическим потенциалом. Полученные нами данные методом муль-
тилокусной ПЦР впоследствии были подтверждены методом секвенирования [4].
Таким образом, разработанная мультилокусная ПЦР-тест-система для дифференциации геновариан-тов возбудителя холеры Эль-Тор с высоким и низким эпидемическим потенциалом специфична и эффективна. показанная возможность быстрого обнаружения недавно сформированных вариантов V. cholerae с высоким эпидемическим потенциалом, глобальное распространение которых во многих странах мира стало реальным фактом, позволяет рекомендовать эту пцр-тест-систему для использования в качестве дополнительного метода при проведении эпидемиологических расследований.
Подана заявка № 214100736 от 09.01.2014 г. о выдаче патента на изобретение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М., Захарова Т.Л., Осин А.В., Смирнова Н.И. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ 2404257, опубл. 20.11.2010 г. Бюл. 32.
2. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов Эль Тор ctx- и ctx+ и полимераз-ной цепной реакции. Журн. эпидемиол., микробиол. и иммуноби-ол. 2001; 6:11-6.
3. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В., Заднова С.П., Кутырев В.В. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ 2458141, опубл. 10.08.2012 г. Бюл. 22.
4. Черкасов А.В., Краснов Я.М., Агафонов Д.А., Шашкова А.В., Смирнова Н.И. Вариабельность структуры острова панде-мичности VSP-II штаммов Vibrio cholerae, выделенных на территории России. Инфекция и иммунитет. 2013; 3(2):185.
5. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser S.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99:1556-61.
6. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44:4211-3.
7. O'Shea Y.A., Finnan S., Reen F.J., Morrissey J.P., O'Gara F., Boyd F. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26,9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and O139 serogroup isolates that shows homology to a 43,4 kb genomic island in V. vulnificus. Microbiology. 2004; 150:4053-63.
8. Taviani E., Grim C.J., Choi J., Chun J., Haley B., Hasan N.A., Huq A., Colwell R.R. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett. 2010; 308:130-7.
References
1. Zadnova S.P., Livanova L.F., Krepostnova I.M., Zakharova T.L., Osin A.V., Smirnova N.I. [Complex gene- and immune-diagnostic test-system for identification of cholera vibrios belonging to O1 and O139 serogroup; and assessment of their virulence]. RF Patent 2404257.
2. Smirnova N.I., Kirillina O.A., Cheldyshova N.B., Kutyrev V.V. [Differentiation of Vibrio cholerae eltor according to their epidemic significance using novel diagnostic cholera bacteriophages El Tor - ctx- and ctx+ and polymerase chain reaction]. Zh. Epidemiol. Mikrobiol. Immunobiol. 2001; 6:11-6.
3. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Shubina A.V., Zadnova S.P., Kutyrev V.V [Method of detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains, identification of their biovar affinity, and differentiation of the strains belonging to biovar El Tor onto typical and genetically altered ones using multiplex poly-merase chain reaction and a test-system necessary to perform the assay]. RF Patent 2458141.
4. Cherkasov A.V., Krasnov Ya.M., Agafonov D.A., Shashkova A.V., Smirnova N.I. [Variability of structure of VSP-II pandemicity island in Vibrio cholerae strains isolated in the territory of Russia]. Infektsiya i Immunitet. 2013; 3(2):185.
5. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser S.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: Genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99:1556-61.
6. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.M., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44:4211-3.
7. O'Shea Y.A., Finnan S., Reen F.J., Morrissey J.P., O'Gara F., Boyd F. The Vibrio seventh pandemic island-II is a 26,9 kb genomic island present in Vibrio cholerae El Tor and O139 serogroup isolates that shows homology to a 43,4 kb genomic island in V. vulnificus. Microbiology. 2004; 150:4053-63.
8. Taviani E., Grim C.J., Choi J., Chun J., Haley B., Hasan N.A., Huq A., Colwell R.R. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol. Lett. 2010; 308:130-7.
Authors:
Agafonov D.A., Zadnova S.P., Lozovsky Yu.V., Smirnova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected]
об авторах:
Агафонов Д.А., Заднова С.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 28.03.14.
