CC BY
23
УДК 616.932:575(471)
А.В.Шашкова, Д.А.Агафонов, А.В.Черкасов, С.П.Заднова, Н.И.Смирнова
ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННОГО ТОКСИГЕННОГО ШТАММА VIBRIO CHOLERAE 301 БИОВАРА ЭЛЬТОР, ИЗОЛИРОВАННОГО В 2011 ГОДУ В РОССИИ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Фенотипический и молекулярно-генетический анализ штамма Vibrio cholerae 301 О1 серовара Инаба биовара эльтор, выделенного в 2011 г. из морской воды в рекреационной зоне Таганрога, показал, что данный изолят относится к геновариантам возбудителя холеры эльтор. Установлено присутствие в его геноме гибридного профага СТХф, содержащего ген ctxB классического типа и ген rstR эльтор типа, а также измененных острова патогенности VPI-1 и острова пандемичности VSP-II. Показано, что исследованный штамм продуцирует значительно больше холерного токсина (0,12 мкг/мл) по сравнению с типичными штаммами этого возбудителя.
Ключевые слова: Vibrio cholerae биовара эльтор, геноварианты, профаг СТХф,*УР1-1, VSP-II.
A.V.Shashkova, D.A.Agafonov, A.V.Cherkasov, S.P.Zadnova, N.LSmirnova
Phenotypic and Molecular-Genetic Analysis of Genetically Modified Toxigenic Vibrio cholerae El Tor Strain 301, Isolated in 2011 in Russia
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
The phenotypic and molecular-genetic analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor Inaba strain 301, isolated in 2011 from sea water in recreation zone in Taganrog, demonstrated this isolate to be a genetic variant of El Tor cholera causative agent. Its genome was shown to carry a hybrid prophage, containing gene ctxB of classical type and gene rstR of El Tor type, as well as altered pathogenicity island VPI-1 and pandemicity island VSP-II. This strain produced much more cholera toxin (0,12 mcg/ml) than typical strains of this causative agent.
Key words: Vibrio cholerae biovar El Tor, gene-variants, prophage СТХф, VPI-1, VSP-II.
Возбудителем холеры, особо опасной инфекции, являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы классического и эльтор биовара, а также V. cholerae О139 серогруппы. Холерные вибрионы классического биовара вызвали первые шесть пандемий холеры, тогда как возбудителем текущей, 7-й, пандемии, самой длительной из известных (с 1961 г. по настоящее время) является V. cholerae биовара эльтор. Холерные вибрионы О139 серогруппы вызывают спорадические случаи заболевания. В результате эволюции возбудителя холеры эльтор почти 20 лет назад возникли генетически измененные штаммы, или гено-варианты, несущие в геноме профага СТХф, кодирующего холерный токсин (ХТ), ген ctxB холерных вибрионов классического биовара (ctxB1) [11]. Современный период развития 7-й пандемии холеры характеризуется дальнейшим изменением генома V. cholerae био-вара эльтор, что выражается в появлении дополнительной мутации в гене ctxB, нового аллеля гена tcpA, ответственного за биосинтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии, необходимых на первом этапе развития инфекционного процесса -колонизации, а также протяженной делеции в острове пандемичности VSP-II [8]. К настоящему времени ге-новарианты вытеснили типичные штаммы возбудителя холеры эльтор на многих эндемичных территориях Юго-Восточной Азии и Африки.
Что касается России, то установлено, что начиная с 1993 г. все эпидемические вспышки и еди-
ничные случаи холеры были вызваны геноварианта-ми [4]. Поскольку показано, что измененные варианты генетически неоднородны, большой интерес представляют генетические особенности штаммов V. cholerae биовара эльтор, выделенные на территории Российской Федерации в последние годы.
Цель работы состояла в проведении фенотипического анализа и исследовании структуры генома штамма V. cholerae 301 серовара Инаба биовара эльтор, выделенного в 2011 г. из морской воды в рекреационной зоне Таганрога.
Материалы и методы
В работе использовали следующие штаммы, выделенные от больных или из внешней среды: 3 типичных штамма V. cholerae биовара эльтор (V cholerae М818 (Саратов, 1970), Р14376 (Ростов-на-Дону, 1990), М1259 (Ставрополь, 1990)) и два генетически измененных (V cholerae М12б9 (Дагестан, 1994), Л3226 (Москва, 2010)), а также изучаемый штамм V. cholerae 301. Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий. Для культивирования штаммов использовали агар LB (рН 7,2). Определение лизабельности диагностическими фагами (классический и эльтор) проводили согласно инструкции производителя. Определение чувствительности к поли-миксину В и способности к продукции ацетилметил-карбинола в реакции Фогес-Проскауэра определяли
согласно методическим указаниям [2].
Продукцию ХТ изучали с помощью иммунофер-ментного анализа GM;ELISA [15]. Для детекции ХТ штаммы выращивали в условиях, оптимальных для продукции данного белка эльтор вибрионами - бульон AKI (1,5 % Бакто-пептона, 0,4 % дрожжевого экстракта Дифко, 0,5 % NaCl, 0,3 % NaHCO3), рН 7,6, при температуре 37 °С [9]. Измерение оптической плотности проводили на фотометре «Stat Fax 2100» (США) при длине волны 405 нм. Количество продуцируемого ХТ рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием очищенного ХТ. Гемолитическую активность исследуемого штамма, способность к продукции растворимой ге-магглютинин/протеазы (РГА/П) и фосфолипазы изучали на плотных средах по методикам, описанным ранее [7, 13, 16]. Подвижность определяли на полужидком (0,6 %) LB агаре.
Чувствительность к антибиотикам устанавливали при посеве штамма V. cholerae 301 на среды, содержащие соответствующие антибиотики [6]. Результат учитывали после инкубирования посевов в течение суток при температуре 37 °С по наличию/ отсутствию роста на пластинках агара.
Для изучения генетической организации штамма использовали блот-гибридизацию по Саузерну, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование. Подготовку и обеззараживание образцов для ПЦР и секвенирования проводили согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Рестрикцию и блот-гибридизацию по Саузерну осуществляли по методу, описанному в пособии по молекулярному клонированию [1]. Для фрагментирования хромосом использовали рестрик-тазу PstI. ПЦР проводили в микропробирках объемом 600 мкл на аплификаторах «БИС» (Россия) и «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Анализируемую ДНК добавляли в количестве 10 мкл в приготовленную реакционную смесь объемом 15 мкл (2,5 мкл стандартного 10х буфера; 2,5 мкл смеси 2 мМ дНТФ («Сибэнзим»); 0,25 мкл 5 ед/мкл Taq-полимеразы («Бионем»); по 0,5 мкл специфических праймеров и 8,75 мкл деионизованной воды).
Секвенирование генов проводили на приборе «CEQ8000» (Beckman Coulter, США). Полученные последовательности изучаемых генов сравнивали с последовательностями, представленными в GenBank для референс-штаммов V. cholerae N16961 эльтор биовара и V. cholerae О395 классического биовара. Анализ последовательностей ДНК осуществляли с использованием программ «Genetic Analysis System Software Version 9.0», «Mega4» и «BioEdit 7.1.3».
Результаты и обсуждение
При изучении фенотипических свойств установлено, что штамм V. cholerae 301 обладает всеми
признаками, характерными для холерных вибрионов биовара эльтор: лизируется до ДРT диагностическим фагом эльтор и не чувствителен к классическому фагу, растет на среде с добавлением 50 ед/мл поли-миксина В, образует ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра и продуцирует гемолизин при выращивании на плотных питательных средах с добавлением 1 % эритроцитов барана.
На следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ продукции основных (холерного токсина) и дополнительных (ферменты патогенности, подвижность) факторов патогенности у изучаемого штамма. Было показано, что в условиях in vitro данный штамм синтезирует и секретирует в среду выращивания 0,12 мкг/мл холерного токсина, что значительно превышает данный показатель у взятых для контроля типичных вибрионов биовара эльтор: V. cholerae М818 - 0,03 мкг/мл, Р14376 - 0,04 мкг/мл, М1259 - 0,02 мкг/мл. Вместе с тем уровень продукции XT этим штаммом соответствует таковому, характерному для измененных вариантов - V. cholerae М1269 - 0,1 мкг/мл, L3226 - 0,4 мкг/мл. Приведенные результаты полностью согласуются с данными литературы [14] и полученными нами ранее сведениями о повышенной продукции XT измененными вариантами, выделенными на территории России [4].
При оценке уровня продукции ферментов патогенности установлено, что штамм 301 обладает слабой фосфолипазной активностью (зона просветления на агаре с яичным желтком - 0,5 мм), а также синтезирует в небольшом количестве секретируемый белок РГАП (средняя зона просветления на агаре с молоком - 1,0 мм). Вместе с тем клетки исследуемого штамма оказались более подвижными по сравнению с ранее изученными типичными и генетически измененными штаммами. Cредний радиус распространения клеток в макроколонии на полужидком агаре составил 7,0 мм.
Далее нами была исследована устойчивость штамма V. cholerae 301 к антибактериальным препаратам. При этом минимальная ингибирующая доза для хлорамфенкола составила 50 мкг/мл, тетрациклина - 2 мкг/мл, триметаприма - 100 мкг/мл, ампициллина - 10 мкг/мл, спектиномицина - 20 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл. Анализ полученных данных позволил сделать вывод, что штамм устойчив к спектиномицину, стрептомицину и триметаприму, но чувствителен к тетрациклину, хлорамфениколу, кана-мицину, ампициллину и рифампицину.
Taким образом, изучаемый штамм V. cholerae 301 по фенотипическим свойствам, включая биовар-специфические, в целом не отличается от типичных штаммов холерных вибрионов биовара эльтор. В то же время установлено выраженное отличие между ним и типичными штаммами по продукции XT -основного фактора патогенности.
Повышенный уровень продукции XT штамма 301 может служить указанием на его принадлежность к геновариантам. Однако для решения этого вопроса
необходимо изучение его молекулярно-генетических особенностей. В этой связи далее была исследована структура генома его профага CTXф, содержащего оперон ctxAB, кодирующий синтез XT. C помощью сконструированной нами ранее диагностической ПЦР тест-системы, дифференцирующей типичные и генетически измененные штаммы [5], было показано, что в геноме штамма 301 присутствует профаг CTXф, содержащий ген ctxB холерных вибрионов классического биовара (ctxBl).
Учитывая, что гены ctxAB, кодирующие продукцию XT, входят в состав профага CTXф, нами была исследована структура данного мобильного генетического элемента. При ПЦР-тестировании 6 генов коровой части и 3 генов RS2-облaсти установлено, что штамм V. cholerae 301 содержит полноценный профаг CTXф. Поскольку в настоящее время измененные варианты холерных вибрионов биовара эль-тор могут нести разные аллели гена ctxB - ctxBl или ctxB? [3], нами было проведено секвенирование этого гена у штамма V. cholerae 301. В результате показано наличие цитозина в положениях 58, 115 и 206, что подтверждает присутствие в геноме профага CTXф аллеля ctxBl, который характерен для классических вибрионов. Поскольку в профаге CTXф измененных вариантов могут содержаться разные аллели гена rstR, далее нами было проведено его секвенирование. Оказалось, что в CTXф имеется эльтор аллель гена rstR. Это означает, что штамм 301 действительно является геновариантом возбудителя холеры эль-тор и содержит в геноме гибридный профаг CTXф (ctxB1, rstREltor).
Учитывая ранее полученные нами данные о вариабельности количества гептаповторов TTTTGAT в промоторной области оперона ctxAB (от 3 до 5) у измененных вариантов, нами было проведено секве-нирование промоторной области штамма V. cholerae 301. Установлено, что исследуемый штамм содержит 4 копии гептаповторов, как и большинство типичных и изученных измененных вариантов холерного вибриона биовара эльтор.
На следующем этапе была определена копий-ность профага CTXф у штамма 301, которую устанавливали с помощью блот-гибридизации по Caузерну с использованием CT-зонда, созданного на основе амплифицированного фрагмента гена ctxA (564 п.н.). Xромосомa фрагментировалась с помощью эндонуклеазы рестрикции PstI. В результате было показано, что в штамме V. cholerae 301 содержится одна копия профага CTXф, расположенная на PstI-фрагменте размером около 5,4 п.н.
Для установления локализации профага CTXф было проведено ПЦР-тестирование с праймерами CIIF-CIIR на участки хромосомы, соседние с dif-сайтом на малой хромосоме. Cуть данного анализа заключается в следующем: если профаг CTXф находится на малой хромосоме, то сайт рекомбинации занят и образование ампликона размером около 800 п.н. не происходит [10]. При проведении ПЦР нами был
обнаружен указанный ампликон. Это означает отсутствие профага CTXф в dif-сайте на малой хромосоме и указывает на его локализацию на большой хромосоме, что характерно для типичных штаммов возбудителя холеры эльтор.
Принимая во внимание тот факт, что генова-рианты могут отличаться от типичных штаммов по структуре генома острова патогенности VPI-1 и острова пандемичности VSP-II, мы изучили структуру этих мобильных элементов. В первую очередь была определена нуклеотидная последовательность гена tcpA, входящего в состав острова патогенности VPI-1. Было показано, что ген tcpA содержит однонуклеотидную замену - в положении 266 аденин был заменен на гуанин (А на G). Эти данные указывают на присутствие в VPI-1 аллеля tcpА, который ранее был обнаружен в штамме V cholerae CIRS101, выделенном в 2002 г. в Бангладеш, и обозначен как tcpETCIRS [8, 12]. Эти данные соответствуют ранее полученным нами результатам о наличии аллеля tcpETC1RS в штаммах геновариантов V. cholerae, вызвавших спорадические случаи холеры на территории России в 2004-2010 гг.
При изучении структуры острова пандемично-сти VSP-II с помощью ПЦР показано наличие протяженной делеции - из 13 исследованных отсутствовали 7 генов (VCO495-VCO512), локализованных в центральной части этого острова. Последующее секвенирование VSP-II данного штамма подтвердило наличие делеции. При этом было показано, что делеция затрагивает часть гена VCO495 и заканчивается в межгенном пространстве между генами VCO512 и VCO513. Кроме того, было обнаружено, что на месте делетированных генов присутствует нуклеотидная последовательность размером около 1,25 т.п.н., соответствующая генам, кодирующим А и В-субъединицы транспозазы OrfAB. Огоит отметить, что подобная нуклеотидная последовательность острова пандемичности VSP-II характерна для гено-вариантов, выделяемых в настоящее время в странах Юго-Восточной Азии и Восточной Африке [8].
Taким образом, фенотипический и молекулярногенетический анализ штамма V. cholerae 301, завезенного на территорию России в 2011 г., показал, что исследованный изолят относится к геновариантам V. cholerae биовара эльтор, содержит в геноме гибридный профаг CTXф с геном ctxB классического типа и геном rstR эльтор типа. Исследуемый штамм, как и другие геноварианты возбудителя холеры эль-тор, продуцирует in vitro повышенное количество XT. Установлено также присутствие в геноме измененного острова патогенности VPI-1, а также измененного острова пандемичности VSP-II. Эти данные свидетельствуют о том, что генетическая организация штамма V. cholerae 301 полностью соответствует штаммам, выделяемым в настоящее время в ряде эндемичных по холере стран Юго-Восточной Азии, являющимся высокопатогенными и имеющим высокий эпидемический потенциал.
Работа выполнена по государственному контракту № 53-Д от 04.06.2012 в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности (2009-2013 годы)» и гранту РФФИ 12-04-00285а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М; 1984. 480 с.
2. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания МУК 4.2.2218-07. М.; 2007.
3. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2010; 4:11-9.
4. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2011; 3:3-10.
5. Шашкова А.В., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Конструирование ПЦР-тест системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов эльтор на типичные и измененные. Пробл. особо опасных инф. 2011; 4(110):49-52.
6. Bani S., Mastromarino P.N., Ceccarelli D., Le Van A., Salvia A.M., Ngo VietQ.T. etal. Molecular characterization of ICEVchVie0 and its disappearance in Vibrio cholerae O1 strains isolated in 2003 in Vietnam. FEMS Microbiol. Lett. 2007; 266:42-8.
7. Finkelstein R.A., Atthasampunna P., Chulasamaya M., Charunmethee P. Pathogenesis of Experimental Cholera: Biologic Activities of Purified Procholeragen A. J. Immunol. 1966; 96(3):440-9.
8. Grim C.J., Choi J., Chun J., Jeon Y.S., Taviani E., Hasan N.A. et al. Occurrence of the Vibrio cholerae seventh pandemic VSP-I island and a new variant. OMICS. 2010; 14(1):1-7.
9. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986; 30(11):1075-83.
10. Maiti D., Das B., Saha A., Nandy R.K., Nair G.B., Bhadra R.K. Genetic organization of pre-CTX and CTX prophages in the genome of an environmental Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strain. Microbiology. 2006; 152(12):3633-41.
11. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296-9.
12. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Nusrin S., Murphy D., Nicol C. et al. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; (44):4211-3.
13. Singh D.V, Matte M.H., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N. et al. Molecular analysis of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67(2):910-21.
14. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(11):3739-49.
15. Svennerholm A.M., Stromberg G.J., Holmgren J. Purification of Vibrio cholerae soluble hemagglutinin and development of enzyme-linked immunosorbent assays for antigen and antibody quantitations. Infect. Immun. 1983; 41(1):237-43.
16. Tan N.H., Tan C.S. Acidimetric assay for phospholipase A using egg yolk suspension as substrate. Anal. Biochem. 1988; 170(2):282-8.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. [Molecular Cloning]. M.; 1984. 480 p.
2. [Laboratory Diagnosis of Cholera: Methodological regulations. MR 4.2.2218-07]. M.; 2007.
3. Smirnova N.I., Goryaev AA., Kutyrev VV [Evolution of Vibrio cholerae genome during the modern period]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2010; 4:11-9.
4. Smirnova N.I., GoryaevA.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V, KutyrevV.V. [Genetic characterization of Vibrio cholerae strains emerging in the Russian Federation during the 7th cholera pandemics]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2011; 3:3-10.
5. Shashkova A.V, Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I., KutyrevV.V. [Construction of the PCR test-system for the detection of Vibrio cholerae O1 toxigenic strain, for identification of their biovar and for differentiation between typical and altered El Tor vibrio strains]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; (110):49-52.
Authors:
Shashkova A.V., Agafonov D.A., Cherkasov A.V., Zadnova S.P., Smirnova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Шашкова А.В., Агафонов ДА., Черкасов А.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 28.06.12.
