CC BY
0УДК 502/504:582.272
Д.О. Мартыненко1' 2, А.В. Климова1' 3, Т.А. Клочкова1
1 Камчатский государственный технический университет, Петропавловск-Камчатский, 683003;
2 Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский, 683023;
3 Камчатский филиал Тихоокеанского института географии ДВО РАН, Петропавловск-Камчатский, 683000 e-mail: [email protected]
КОМПЛЕКСНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕТАЛЛОВ НА РАННЕЕ РАЗВИТИЕ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ FUCUS DISTICHUS В УСЛОВИЯХ ЛАБОРАТОРНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Исследовано сочетанное воздействие металлов (Cu, Co, Cd и Pb) на развитие проростков бурой водоросли Fucus distichus subsp. evanescens в искусственной среде. Эксперименты проводили в лабораторных условиях в течение 30 суток при температуре 8°С, фотопериоде 10 : 14 и интенсивности освещения 30 мкмоль-фотонов/(м2-с). Показано, что при внесении номинальных концентраций металлов до их нормативных значений 2ПДК абсолютная скорость роста водорослей снижалась в два и более раз по отношению к контрольной группе. Во всех культурах фукуса преобладал I тип морфогенеза: проростки имели хорошо сформированный главный ризоид, аномалии развития отмечались редко. Подавляющим рост водорослей эффектом обладала среда с номинальными концентрациями Cu 5 мкг/л (1ПДК) и Pb 20 мкг/л (2ПДК). При этой комбинации металлов ростовые процессы не восстанавливались даже после перемещение проростков F. distichus в среду без добавления загрязнителей.
Ключевые слова: Fucus distichus subsp. evanescens, Fucales, скорость роста, кобальт, медь, свинец, цинк, номинальные концентрации, ранние стадии развития, тяжелые металлы.
D.O. Martynenko1, 2, A.V. Klimova1, 3, T.A. Klochkova2
1 Kamchatka State Technical University, Petropavlovsk-Kamchatsky, 683003;
2 Institute of Volcanology and Seismology FEB RAS, Petropavlovsk-Kamchatsky, 683023;
3 Kamchatka Branch of Pacific Geographical Institute FEB RAS, Petropavlovsk-Kamchatsky, 683000 e-mail: [email protected]
COMBINED EFFECTS OF METALS ON THE EARLY DEVELOPMENT OF THE BROWN ALGAE FUCUS DISTICHUS UNDER LABORATORY CULTIVATION CONDITIONS
The combined effect of metals (Cu, Co, Cd and Pb) on the development of brown alga Fucus distichus subsp. Evanescens seedlings in an artificial environment was studied. The experiments were carried out in laboratory conditions for 30 days at a temperature of 8°C, a photoperiod of 10 : 14 and an illumination intensity of 30 pmol photons / (m2 s). As shown, the nominal concentrations of metals were introduced up to their standard values of 2MPC, the absolute growth rate of algae decreased by 2 or more times compared to the control group. Type I morphogenesis prevailed in all Fucus cultures: seedlings had a well-formed main rhizoid; developmental anomalies were rare. The inhibitory effect on algal growth was demonstrated by the medium with nominal concentrations of Cu 5 pg/l (1MPC) and Pb 20 pg/l (2MPC). With this combination of metals, growth processes were not restored even after the transfer of F. distichus seedlings to a medium without the addition of polluting heavy metals.
Key words: Fucus distichus subsp. evanescens, Fucales, growth rate, cobalt, cuprum, lead, zinc, nominal concentrations, early stages of development, heavy metals.
Бурая водоросль Fucus distichus subsp. evanescens широко распространена в умеренных широтах Дальнего Востока России, а также в Белом и Баренцевом морях [1-3]. Этот вид обладает высокой устойчивостью к наиболее распространенным загрязнителям морских вод - нефтепродуктам и тяжелым металлам [4, 5]. Кроме того, в акваториях с постоянным антропогенным влияниям F. distichus остается одним из доминирующих видов макрофитобентоса в прибрежных сообществах [3]. Выживаемость фукуса в неблагоприятных условиях среды послужила основой для разработки методов восстановления экологического состояния акваторий и последующего применения этого вида в санитарной марикультуре [4, 6].
В прибрежных районах с развитой транспортной инфраструктурой и активным судоходством уровень загрязнения морских вод высокий [7]. Часто содержание металлов в акваториях, прилегающих к городам-портам России может превышать ПДК в несколько раз [8]. Так, в 2023 г. повышенное содержание меди было зафиксировано в морских водах залива Гренфьорд (пос. Баренцбург, Шпицберген) - 14,3 мкг/л, залива Корсаков (порт Корсаков, Сахалин) -7 мкг/л, Татарского пролива (г. Александровск-Сахалинский) - 5,6 мкг/л и бухте Золотой Рог (г. Владивосток) - 6,2 мкг/л. Также в указанных выше районах в воде и донных отложениях обнаружены в меньших концентрациях кобальт, кадмий и свинец. В прикамчатских водах, даже в Ава-чинской губе, подвергающейся длительному антропогенному воздействию, содержание тяжелых металлов отмечается только в следовых количествах [9]. В то же время в 2009 г. в грунтах северовосточной части этой бухты содержание меди достигало 243 мг/кг, кадмия - 2,3 мг/кг и свинца 241 мг/кг [9]. Вероятно, донные отложения в этих районах могут выступать вторичным источником загрязнения вод металлами и негативно влиять на развитие обитающих здесь гидробионтов.
Ранее нами в лабораторных экспериментах были установлены уровни содержания некоторых металлов (меди, кобальта, кадмия и свинца) в морской воде, которые ингибируют развитие ранних стадий развития F. distichus [5, 10]. При этом среди всех протестированных металлов именно медь обладала наиболее выраженным токсичным эффектом уже при концентрации выше 5 мкг/л. Поскольку в прибрежных акваториях содержание металлов, как и других загрязнителей, в среде часто носит сложный и временный характер, то целью исследования являлась оценка комплексного воздействия нескольких металлов I и II класса опасности на развитие проростков фукуса.
Для получения лабораторных культур F. distichus использовали фертильные образцы водорослей, собранные в приливно-отливной зоне мыса Санникова (Авачинская губа, Юго-Восточная Камчатка) в летний период 2024 г. Проростки фукуса получали согласно методу, детально описанному нами ранее [11, 12]. IMR-среду для культивирования готовили с применением морской воды с соленостью 25%о, отобранной также, как и водоросли, у мыса Санникова. Содержание меди, кобальта, свинца и кадмия в природной морской воде не превышала 1 ppm. В экспериментах использовали IMR-среду, полученную после предварительной фильтрации и стерилизации природной морской воды и добавления необходимых витаминов, микро- и макроэлементов [5, 13]. Для приготовления комбинированных растворов металлов Cu + Cd с номинальными концентрациями 5 мкг/л каждого элемента, Cu + Co с номинальными концентрациями 5 мкг/л Cu и 20 мкг/л Cd и Cu + Pb с номинальными концентрациями 5 мкг/л Cu и 20 мкг/л Pb использовали соли CuSO4-5H2O, Co(NO3)2, CdCl2 и Pb(NO3)2. Полученные среды соответствовали допустимым значения по Cu и Co - 1ПДК, по Cd и Pb - 2ПДК тестируемых элементов в морской воде.
Выращивание проростков проводили в течение 30 суток при температуре +8°С и коротком световом дне (фотопериод 10 : 14), интенсивность освещения составляла 30 мкмоль-фотонов/(м2-с). Помимо испытуемых групп, параллельно выращивали культуры фукуса в средах без добавления металлов. Каждый раствор с комбинацией элементов тестировали в трех повторностях. В экспериментах добавление растворов металлов в среды проводили с шестых по 21 -е сутки, т. е. период экспозиции водорослей в загрязненной среде составил 15 суток.
Наблюдения за развитием проростков F. distichus с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX73 (Olympus, Япония) вели каждые 3-4 сут. Количество измеренных экземпляров составляло 100 и более для каждой группы, водоросли отбирали случайным образом. Линейные размеры проростков состояли из измерений длин их ризоидальной и талломической частей. Абсолютную скорость роста (AGR, мкм/сут) рассчитывали по формуле [14]:
AGR = (L - D/(t2 - g,
где L1 - среднее значение начальной и L2 - среднее значение текущей длины (мкм) проростков;
(t2 - ti) - период времени между начальным и текущим измерениями (сут).
Статистическую обработку и визуализацию результатов выполняли в программе GraphPad Prism ver. 10.2.3. Нормальность распределения полученных данных проверяли с помощью теста Д'Агостино-Пирсона, гомогенность дисперсии - теста Брауна-Форсайта. Для оценки статистических различий между контрольными и испытуемыми группами применяли однофакторный дисперсионный анализ, при выявлении различий между контрольной и испытуемыми группами использовали апостериорное сравнение с помощью критерия Даннетта. Различия между средними значениями считали достоверными при p < 0,05.
Развитие проростков фукуса в первую неделю культивирования во всех группах проходило одинаково - их размеры варьировали от 93 до 154 мкм (рис. 1, А). На 9-е сутки культивирования после добавления металлов в среды различия в линейных размерах между контрольной и испытуемыми группами варьировали от 13 до 21%. При этом заметное отставание в росте наблюдалось в культурах фукуса с добавлением Cu и Pb. В последующие две недели их темпы роста заметно снизились (рис. 1, А). В целом экспонирование водорослей в течение 15 суток в средах с добавлением металлов существенно отразилось на скорости роста (рис. 1, А и Б). За этот период длина проростков в средах без добавления металлов увеличилась в два раза и достигала в среднем 477 мкм при AGR = 16 мкм/сут. Менее интенсивно развивались культуры в средах с совместным добавлением Cu + Cd, их скорость роста достигала 8,5 мкм/сут и в средах с совместным добавлением Cu + Co - 2,7 мкм/сут (рис. 1, Б). Выявлены слабые ростовые процессы для проростков в средах с добавлением Cu и Pb - за период воздействия загрязнителей их средняя длина увеличилась только на 10 мкм, что не превышает значений абсолютной скорости роста - 0,5 мкм/сут.
40-
о
30-
1 20 п
0J
<
Ю-|
Cu+Pb
т 2
Ï-6
acd
Период,сутки
Б
40
о
30
ab
Т
i 20-|
0J
< ю-|
ab
A
О^ х^ /
^
iv
CV
В
ХР
чЛ
¿я о> о> о>
ÎV
a
0
0
Рис. 1. Развитие проростков бурой водоросли Fucus distichus в условиях комплексного воздействия металлов: А - динамика линейного роста, представлены средние арифметические значения и стандартное отклонение, Б - скорость роста (AGR, мкм/сут) в средах с добавлением комбинаций металлов Cu + Cd, Cu + Co и Cu + Pb с 6-х по 21 -е сутки культивирования, В - скорость роста (AGR, мкм/сут) в средах без добавления металлов
за период с 22-х по 30-е сутки культивирования
С 22-х суток эксперимента все проростки культивировали в средах без добавления металлов. За этот период фукусы в контрольной группе сформировали полноценную объемную талломи-ческую часть и развитые ризоиды. Как следствие, скорость роста водорослей значительно снизилась (рис. 1, В). Разница в линейных размерах проростов в испытуемых группах Си + Cd и Си + Со и контрольной группе составляла 12 и 32% соответственно. Фукусы, культивируемые ранее в средах с добавлением Си и РЬ, практически не изменили своих размеров с 6-х суток эксперимента, их талломическая часть была слаборазвитой и состояла из нескольких десятков клеток. Абсолютная скорость роста снизилась во всех группах, кроме культур, выращенных в средах с повышенным содержанием Си и Со (рис. 1, В). Следует отметить, что после двухнедельного воздействия металлов на проростки и их последующее содержание в чистых питательных средах не отразилось отрицательно на ростовые процессы. Вероятно, в естественной среде краткосрочное загрязнение этими металлами существенно не влияет на ранние стадии развития фукуса.
Известно, что развитие фукуса в первые недели сопровождается формированием развитой ризоидальной части и активным делением клеток талломической части проростка. Однако в неблагоприятных условиях развитие органов прикрепления может происходить с нарушениями. Ранее нами были выделены четыре типа морфогенетического развития проростков фукуса [5]: главный ризоид с боковыми выростами или без них (тип I); несколько равнозначных ризоидов (тип II); нарушение оси роста (тип III); отсутствие ризоидов у многослойной талломической части (тип IV). Тип морфогенеза во многом определяет скорость роста и общие линейные размеры проростков. Так, ювенилы, развивающиеся по I типу, имеют наибольшую длину слоевищ, чем представители других морфотипов. Как правило, этот тип развития ризоидов наиболее часто встречается в лабораторных культурах фукуса [5, 10].
К 21-м суткам эксперимента во всех группах преобладали проростки с I типом морфогенеза ризоидальной части. При этом в контрольной группе их доля составляла 70,7%, остальные проростки развивались по II морфотипу (рис. 2). Наличие в культурах проростков с разными типами морфогенеза обусловило их дифференциацию на две размерные группы. Также для этой группы был характерен широкий диапазон линейных размеров водорослей от 150 до 878 мкм. В испытуемых группах диапазоны длин ювенилов были значительно уже (рис. 2, А). На долю I типа морфогенеза приходилось 79% в культурах, выращенных в средах с совместным внесением Си и Cd, 81% - Си и Со, 96% - Си и РЬ. Важно отметить, что в культурах, развивающихся в присутствии Со, у некоторых проростков отмечалось нарушение оси роста (рис. 2, Б).
Cu+Pb-
Cu+Co
Cu+Cd
Контроль"
258 -.АЛ. 417 "^"ЧРт ' 293 А
' ' 394 .. . - .••..... 590 __.-«<»«—» m -я» «» —»ML »»а ■ ■■■ •>—^ \J\J\J -'namîfi Вд^имgfSPtfcVb» -
:• . } .413 a ма •• V* • ■■ •• # . .a* m m _ ••• » --- - •• tiMmSiaii ••aetS • m им •¡мин«« ••• «с • м» •• ПН • • •• • «_• ■ аи • м • • *—* 878
Г
200 400 600 800 1000 1200 Длина проростков, мкм
95.7%
81.4%
78.6%
70.7%
Б
□ I □ II ■
Доля аномалий
0
Рис. 2. Особенности развития проростков бурой водоросли Fucus distichus на 21-е сутки выращивания в средах с добавлением металлов: А - распределение длин проростков (цифрами указаны медианные и максимальные значения), Б - доля аномального развития ризоидов в контрольной и экспериментальных группах
Важно отметить, что развитие проростков фукуса в средах с аналогичным номинальным содержанием только одного из протестированных металлов не влияло на скорость их роста, а в отдельных случаях незначительно ее стимулировало [5, 10]. В то время как совместное при-
сутствие меди и другого металла снижало скорость роста ювенилов фукуса в два и более раз (см. рис. 1). В проведенных экспериментах номинальные концентрации металлов в средах не превышали 2ПДК. Вероятно, совместное присутствие металлов в среде усиливает ингибирова-ние роста водорослей, особенно отчетливо это проявлялась в комбинации Cu и Pb. При этом в последнем случае смена питательных растворов на среды без добавления металлов и последующее выращивание проростков не восстановило у них ростовые процессы. В остальных испытуемых группах темпы роста были сопоставимы с предыдущим периодом (рис. 1, А и В). Проведенный эксперимент выявил устойчивость ранних стадий развития фукуса к совместному содержанию в среде металлов Cu + Cd и Cu + Co в количествах, превышающих их ПДК.
Литература
1. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway, 2024. [Электронный ресурс]. - URL: http://www.algaebase.org (дата обращения: 10.10.2024).
2. Клочкова Н.Г., Королева Т.Н., Кусиди А.Э. Атлас водорослей макрофитов прикамчатских вод. Т. 1. - Петропавловск-Камчатский: КамчатНИРО, 2009. -218 с.
3. Биология развития и экология бурой водоросли Fucus distichus в прибрежных водах Камчатки / Т.А. Клочкова, А.Н. Кашутин, А.В. Климова, Н.Г. Клочкова. - Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2021. - 128 с.
4. Степаньян О.В., Матишов Г.Г., Кулыгин В.В. Устойчивость макроводорослей Баренцева моря к нефтяному загрязнению // Наука Юга России. - 2017. - Т. 13, № 3. -С. 103-108.
5. Климова А.В., Болотова Р.Г., Клочкова Т.А. Развитие проростков бурой водоросли Fucus distichus subsp. evanescens (Fucales, Phaeophyceae) в условиях избыточного содержания свинца и кадмия // Физиология растений. - 2022. - Т. 69, № 4. - С. 427-437.
6. Воскобойников Г.М., Малавенда С.В., Метелькова Л.О. Роль водорослей-макрофитов в биоремедиации от нефтепродуктов Кольского залива Баренцева моря // Морской биологический журнал. - 2021. - Т. 6, № 3. - С. 35-43.
7. Качество морских вод по гидрохимическим показателям. Ежегодник 2021. - М.: Наука, 2022. - 230 с.
8. Обзор о состоянии и загрязнении окружающей среды в Российской Федерации в 2023 году. - М.: Росгидромет, 2024. - 215 с.
9. Воздействие антропогенного загрязнения на состояние макрофитобентоса в бухте Раковая (Авачинская губа, юго-восточная Камчатка) / Н.Г. Клочкова, А.В. Климова, С.О. Очеретяна, А.Э. Кусиди, Е.В. Касперович // Вестник КамчатГТУ. - 2016. - № 35. - С. 53-64.
10. Климова А.В., Клочкова Т.А.,Болотова Р.Г. Воздействие кобальта и меди на рост проростков бурой водоросли Fucus distichus subsp. evanescens (Fucales, Phaeophyceae) // Вестник КамчатГТУ. - 2023.- № 64. - С. 22-31.
11. Motomura T. Electron and immunofluorescence microscopy on the fertilization of Fucus distichus (Fucales, Phaeophyceae) // Protoplasma. - 1994. - Vol. 178. - P. 97-110.
12. Климова А.В., Кашутин А.Н. Раннее развитие камчатских представителей Fucus evanes-cens (Phaeophyceae, Fucales) в условиях лабораторного культивирования // Вестник КамчатГТУ. -2016. - № 37. - С. 50-56.
13. Biology of a terrestrial green alga, Chlorococcum sp. (Chlorococcales, Chlorophyta), collected from the Miruksazi stupa in Korea / T.A. Klochkova, S.-H. Kang, G.Y. Cho, C.M. Pueschel, J.A. West, G.H. Kim // Phycologia. - 2006. - Vol. 45. - P. 349-358.
14. Hunt R. Basic Growth Analysis. - Dordrecht: Springer, 1990. - 112 p.
