CC BY
16
УДК 544.47
А.А. Горенберг1, А.Н. Костров2,1, О.М. Саркисов1, В.А. Надточенко1,
В.В. Никандров3
1 Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН 2 Московский физико-технический институт (государственный университет)
3 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Каталитические реакции на поверхности мезопористых пленок диоксида титана с иммобилизованном гидрогеназой
В работе электрохимическими методами исследованы каталитические реакции восстановления протонов среды до водорода и окисления молекулярного водорода на электроде ХЮ2 с иммобилизованной гидрогеназой из пурпурных бактерий Thiocapsa roseopersicina. Показано, что происходит реакция прямого переноса электрона от твёрдого тела — полупроводника ^С2 — к активному каталитическому центру гидрогеназы из пурпурных бактерий Thiocapsa roseopersicina. Установлено, что при использовании метилвиологена (МВ2+) в качестве переносчика электронов ток обмена составляет 78 мкА/см2.
Ключевые слова: каталитические реакции, ферментативный катализ, мезопори-стые плёнки, иммобилизованная гидрогеназа, диоксид титана, полупроводник ^С2, метилвиологен (МВ2+).
I. Введение
Сопряжение наночастиц неорганических полупроводников с ферментами и/или фотоферментами открывает новые возможности для использования фото- и электрохимически генерированных в полупроводнике зарядов в многоэлектронных ферментативных каталитических реакциях или для сенсибилизированной инжек-ции электрона из возбуждённого фотофермента в зону проводимости полупроводника. Этот подход позволяет создавать каталитические системы нового типа, способные селективно вести многоэлектронные каталитические реакции, разрабатывать сенсоры и преобразователи света в химическую энергию и электричество [1-3].
В настоящей работе сообщается о разработке новой системы на основе фермента гидрогеназы, иммобилизованного в ме-зопористую плёнку ТЮ2. Фермент гидро-геназа способен катализировать реакцию окисления молекулярного водорода, а также реакцию восстановления протонов до водорода:
2Н+ + 2е
Интерес к исследованию систем, основанных на ферменте гидрогеназы, связан с
тем, что молекулярный водород считается сегодня наиболее перспективным химическим топливом, в частности, для топливных ячеек. Таким образом, ферментативный катализ на основе фермента гидро-геназы является одним из перспективных способов получения молекулярного водорода.
Выбор мезопористых плёнок диоксида титана в качестве подложки для иммобилизации фермента был обусловлен тем, что за счёт пористости диоксида титана достигается высокая площадь поверхности, многократно (~ 1000) превышающая геометрическую площадь [4]. Эта большая поверхность с порами размеров, схожих с размером молекул фермента, позволяет адсорбировать большое количество фермента без потери его структурных свойств и активности.
Ключевыми вопросами в работе таких систем являются возможность иммобилизации фермента на полупроводник без потери структуры и активности фермента, а также возможность эффективного переноса заряда с полупроводника на активный центр фермента.
Целью данной работы является исследование электрохимическими методами нанобиокатализаторов на основе мезо-
пористых плёнок из нанокристаллов TiO2 с иммобилизованными белковыми глобулами фермента гидрогеназы из бактерий Thiocapsa roseopersicina.
II. Экспериментальная часть
II.1. Материалы
В работе использовалась гидрогена-за из пурпурных бактерий Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS (молекулярный вес 63Кда, состоит из двух субъединиц, содержит два редокс-центра: кластер Fe4 S4 и Ni-центр).
II.2. Приготовление мезопористых плёнок TiO2
Для получения мезопористых плёнок TiO2 использовали промышленный порошок окиси титана: Aeroxide P25 (Degussa, Германия). Данный порошок, представляющий собой кристаллическую фазу, на 85% состоит из анатаза, на 15% из рутила. Средний размер частиц порошка 25 нм, удельная поверхность около 50 м2/г.
Приготовление плёнок TiO2 включает в себя следующие стадии.
1. Приготовление пасты: порошок окиси титана смешивали с полиэтилен гликолем (молекулярная масса 20 000) и ацетил-ацетоном C5H8O2 (1 • 10_8 моль/л) на основе 0,25% водного раствора ПАВ (Triton X-100). Массовая доля окиси титана в пасте составляла 40%. В качестве порообра-зующего агента использовали полиэтилен гликоль PEG 20 000, в количестве 10% от массы TiO2. Ацетилацетон брали в количестве 3% от массы TiO2.
2. Ультразвуковое диспергирование: приготовленную пасту подвергали ультразвуковому диспергированию в течение 1 часа.
3. Нанесение пасты: полученную пасту наносили на проводящее стекло ITO методом наката.
4. Отжиг плёнок: для предотвращения растрескивания плёнок высушивали их на воздухе в течение 5-15 минут. Затем для удаления органических примесей плёнки отжигали в муфельной печи при 450 °С в течение 1 часа.
Таким образом, были получены полупрозрачные плёнки TiO2 толщиной около 8 мкм (рис. 1,2).
Рис. 1. Схема рабочего электрода с иммобилизованной гидрогеназой: 1 — стекло, 2 — проводящее покрытие ІТО, 3 — фермент, 4 — ме-зопористая плёнка диоксида титана
Рис. 2. Морфология мезопористых плёнок диоксида титана. Снято на сканирующем электронном микроскопе ЛЯМЗБС (ЛЕОЬ). Длина маркера на фотографии — 1 мкм
Далее на полученные плёнки адсорбировалась гидрогеназа. Адсорбция происходила при выдерживании плёнки в растворе гидрогеназы в течение 2-4 суток при температуре 4 °С.
Н.Э. Электрохимическая ячейка
Используемая в работе электрохимическая ячейка представляет собой стеклянный сосуд, закрытый от падающего света металлической фольгой, герметично закрытый резиновой крышкой и заполненный электролитом. В качестве раствора
электролита во всех проведённых экспериментах использовался раствор pH = 7,2, содержащий 0,1 М КС1 и трис-буфер. Часть экспериментов была проведена с добавлением в раствор дополнительного переносчика зарядов метилвиологена МВ2+. Концентрация метилвиологена в растворе составляла 10_3 М.
III. Результаты и их обсуждение
Ш.1. Электрохимические измерения
Все эксперименты в работе были проведены по трёхэлектродной схеме, где в качестве рабочих электродов использовались мезопористые плёнки диоксида титана, приготовленные, как описано выше, с иммобилизованной на них гидрогеназой, а также мезопористая плёнка диоксида титана без иммобилизованной гидрогена-зы. В качестве электрода сравнения нами был использован каломельный электрод ЭСр-10101, потенциал которого составлял 202 ± 3 мВ относительно нормального водородного электрода. Все окислительновосстановительные потенциалы в работе представлены относительно каломельного электрода ЭСр-10101. В качестве противо-электрода использовалась платиновая сетка. Внутри ячейки в течение опыта, благодаря непрерывному продуву, поддерживалась водородная или аргоновая атмосфера в зависимости от эксперимента. Все эксперименты были проведены при комнатной температуре. Электрохимические измерения проводились при помощи потенциоста-та РБ-7.
Основной задачей электрохимических измерений в работе было получение циклических вольт-амперных характеристик при разных скоростях развёртки потенциала в аргоновой или водородной атмосферах.
Ш.2. Эксперименты с использованием метилвиологена в качестве дополнительного переносчика заряда
Предварительно нами была измерена активность нашего рабочего электрода. Активность измеряли по восстановлению
метилвиологена водородом в реакции, катализируемой гидрогеназой, на поверхности рабочего электрода при продуве ячейки водородом. В контрольном эксперименте нами было показано, что метилвиоло-ген не восстанавливается водородом в отсутствие активной гидрогеназы. В реальном времени измеряли спектры поглощения раствора, и по кинетике окрашивания раствора вычислялась скорость реакции, Л = 610 нм. Скорость реакции восстановления метилвиологена составила 7,25 • 10_1° моль/с • см2 • л.
Рис. 3. Циклические вольт-амперометрические характеристики, снятые на электроде с иммобилизованной гидрогеназой в присутствии метилвиологена: (а) — в атмосфере водорода; (б) — в атмосфере аргона; (в) — циклическая вольт-амперная характеристика электрода без иммобилизованной гидрогена-зы. Все потенциалы даны относительно каломельного электрода, pH раствора составлял 7,2
На рис. 3 изображены характерные циклические вольт-амперные характеристики электродов диоксида титана с иммобилизованной гидрогеназой, снятые в аргоновой (рис. 3б) и в водородной (рис. 3а) атмосферах, а также циклическая вольт-амперная характеристика плёнки диоксида титана в водородной атмосфере (рис. 3в), при скорости развёртки потенциала 2 мВ/с. Как видно из этой картинки, иммобилизация фермента приводит к существенному изменению тока в системе, что свидетельствует о каталитическом окислении/восстановлении (при соответствующем потенциале) водорода/протонов на электроде при катализе на гидрогеназе. Как видно из рис. 3, как в аргоновой, так и в водородной атмосфере наблюдается появление катодного тока, который свидетельствует о каталитической реакции восстановления протонов
водной среды. Из рис. З видно, что присутствие в эксперименте водорода существенно изменяет вид характеристики для электрода с ферментом. Наблюдается появление анодного тока в области от —6OO мВ до —45O мВ относительно каломельного электрода. В этом диапазоне потенциалов в эксперименте, проведённом в аргоновой атмосфере, анодный ток не наблюдается. Анодный ток, зафиксированный в эксперименте в атмосфере водорода, хорошо согласуется с полученными для различных подложек каталитическими токами окисления водорода гидрогеназой [5]. Таким образом, можно сделать вывод, что регистрируемый анодный ток характеризует реакцию окисления водорода ферментом гид-рогеназой на поверхности нашего электрода в присутствии метилвиологена в растворе. То есть, в этом эксперименте зафиксирован каталитический ток окисления водорода на поверхности мезопористой плёнки диоксида титана с иммобилизованной гидрогеназой в присутствии метилвиологе-на, который выступает в качестве переносчика электрона между электродом и ферментом. По плотности тока, зарегистрированного в эксперименте, нами была оценена скорость реакции окисления водорода. Она составила 6,25 • Ю-10 моль/с • см2 • л. Этот результат хорошо согласуется с результатом, полученным для реакции восстановления метилвиологена.
Одним из основных параметров, характеризующих кинетические возможности электрода, является ток обмена. Этот параметр характеризует равенство скоростей реакции в прямом и обратном направлениях и отображается силой тока, отнесённой к единице поверхности (плотностью тока). Анализ был проведён в рамках исследования таффелевской зависимости. Была построена зависимость ln /кат от сдвига потенциала по отношению к равновесному согласно уравнению
/кат = /0 exp(anFn/RT),
ln /кат = ln /0 + anFn / RT,
где п = Ep — E — сдвиг потенциала электрода по отношению к его равновесному значению, а — эмпирическая постоянная, называемая коэффициентом переноса (O ^ а ^ І), T — абсолютная температура, F — постоянная Фарадея, R — газовая постоянная.
Ток обмена был рассчитан по экстраполяции таффелевского сегмента этой зависимости и составил I0 = 78 мкА/см2. Известные из литературы токи обмена для электродов на основе угольных электродов с иммобилизованной гидрогеназой из пурпурных бактерий Thiocapsa roseopersicina составляют порядка 40 мкА/см2 электрода [5].
III.3. Эксперименты без использования дополнительного
переносчика заряда
На рис. 4 представлена циклическая вольт-амперная характеристика электрода с ферментом в водородной атмосфере, однако этот эксперимент был проведён без метилвиологена. На этом рисунке видно, что нам также удалось зафиксировать как ток окисления водорода, так и ток восстановления протонов среды. Отличие от предыдущего эксперимента состоит лишь в значениях полученных сил токов. По сравнению с предыдущим экспериментом значения сил токов упали в 2-3 раза. Этот результат имеет принципиальное значение, так как в этом опыте зафиксирован прямой перенос электрона от твёрдого тела — полупроводника TiO2 — к активному каталитическому центру гидрогеназы.
Потенциал, мВ
Рис. 4. Циклические вольт-амперометрические характеристики, снятые на электроде с иммобилизованной гидрогеназой в атмосфере водорода в отсутсвие метилвиологена
III.4. Повторная активация электрода
Как известно, фермент может терять свою активность при окислении активного центра кислородом воздуха [б]. Этот вопрос имеет важное значение для исполь-
зования гидрогеназы в технических приложениях. Поэтому интересным представлялся также вопрос о возможной повторной его активации при воспроизводимости активности фермента. Нами был проведён эксперимент, когда после снятия циклических вольт-амперных характеристик электрод оставлялся на воздухе на сутки, происходила его дезактивация, затем электрод помещался в водородную атмосферу на три часа, после чего вновь проводился эксперимент. Как видно на рис. 5, в течение трёх дней нам удавалось реактивировать электрод без потери его активности.
Потенциал, мВ
Рис. 5. Циклические вольт-амперометрические характеристики, снятые на электроде с иммобилизованной гидрогеназой в атмосфере водорода, 1-й день — сплошная линия, 2-й день — точки, 3-й день — пунктир
IV. Выводы
В настоящей работе впервые электрохимическими методами показано, что гидрогеназа из пурпурных бактерий ТЫоеарэа гс^еорегеюта, иммобилизованная на мезопористую плёнку диоксида титана, проявляет каталитическую активность. Продемонстрирована каталитическая реакция восстановления протонов среды до водорода, которая протекает как в атмосфере аргона, так и в атмосфере водорода, то есть водород как продукт реакции не подавляет активность гидро-геназы из пурпурных бактерий ТЫоеарэа гоэеорегэюта по отношению к реакции восстановления. Показана реакция окисления молекулярного водорода при потенциалах более положительных по сравнению с равновесным потенциалом Н+/Н2.
Установлено, что при использовании метилвиологена в качестве переносчика электронов, ток обмена составляет 78 мкА/см2.
Показано, что происходит реакция прямого переноса электрона от твёрдого тела — полупроводника TiO2 — к активному каталитическому центру гидроге-назы из пурпурных бактерий Thiocapsa roseopersicina.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Никандров В.В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность // Успехи биологической химии. — 2000. — Т. 40. — С. 357-396.
2. Nikandrov V.V., Shlyk M.A., Zorin N.A., Gogotov I.N., Krasnovsky A.A. Efficient photoinduced electron transfer from in organic semiconductor TiO2 to bacterial hydrogenase // FEBS Letters. — 1988. — V. 234. — P. 111-114.
3. Pardo-Yissar V., Katz E.,
Wasserman J., Willner I. Acetylcholine Esterase-Labeled CdS Nanoparticles on Electrodes: Photoelectrochemical
Sensing of the Enzyme Inhibitors // J. Am. Chem. Soc. — 2003. — V. 125. -P. 622-623.
4. Topoglidis E., Campbell C.J., Cas A.E.G., Durrant J.R. Factors that Affect Protein Adsorption on Nanostructured Titania Films. A Novel Spectroelectrochemical Application to Sensing // Langmuir. — 2001. — V. 17. — P. 7899-7906.
5. Воронин О.Г., Морозов С.В., Карякин А.А. Водородные топливные электроды на основе различных гидрогеназ // Биотехнология будущего. — 2006. — № 10-12.
6. Van der Zwaan J.W., Albracht S.P.J., Fontijn R.D., Slater E.C. Monovalent nickel in hydrogenase from Chromatium vinosum Light sensitivity and evidence for direct interaction with hydrogen // FEBS Letters. — 1984. — V. 179. — P. 271-277.
Поступила в редакцию 28.12.2007.
