CC BY
89
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 292-302 Биология
УДК 579.6: 544.6:57
Интегральная система для получения электрического тока гидрогеназным электродом, расположенным в биореакторе с микробным консорциумом *
Е. С. Шастик, Н. А. Зорин, А. А. Цыганков
Аннотация. Показана возможность генерации электрического тока в биореакторе с гетеротрофным консорциумом, разлагающим крахмал, путем введения внутрь реактора гидрогеназного электрода,. При увеличении площади поверхности электрода до 4 см2 гидрогеназный электрод может потребить 18,7% от выделившегося водорода. Обсуждаются пути увеличения доли потребленного водорода.
Ключевые слова: Н2, биореактор, получение электричества из органических отходов, гидрогеназный электрод, микробный консорциум.
Введение
С ростом населения в мире остро возникает проблема утилизации техногенных отходов, загрязняющих окружающую среду. Одновременно с переработкой и обезвреживанием промышленных и бытовых отходов, представляется перспективным их использование как вторичных ресурсов для получения энергии. Техногенные отходы, содержащие органические соединения, в частности пищевые и сельскохозяйственные отходы, могут быть преобразованы в энергоносители для промышленности и транспорта. Так, например, широко известно уже использующееся на практике преобразование указанных отходов в метан с помощью микробных консорциумов [1].
Разрабатываются также технологии биологического преобразования органических отходов в Н2 [2]. При этом дальнейшее преобразование биоводорода в электричество является важной практической задачей. В литературе описаны успешные эксперименты по сопряжению топливных элементов на основе платины с биореакторами, образующими водород за
* Работа поддержана Программой РАН: «Химические аспекты энергетики».
счет брожения [3, 4], за счет биофотолиза воды микроводорослями [5, 6], а также пурпурными бактериями при аноксигенном фотосинтезе [7]. Во всех указанных случаях топливные элементы подсоединялись последовательно с биореакторами. Однако такие системы работоспособны лишь в случае, когда биоводород дополнительно очищается от каталитических ядов типа сероводорода, которые неизбежно образуются микроорганизмами. В противном случае электрокаталитическая активность топливных элементов на основе благородных металлов быстро снижается [8]. Совмещение топливного элемента и биореактора, генерирующего водород при разложении органических отходов, в одном пространстве, может дать дополнительные преимущества: за счет снижения парциального давления водорода в биореакторе возможно увеличение скорости выделения водорода, а так же вследствие снижения парциального давления водорода возможно изменение продуктов брожения.
В качестве альтернативы электрокатализу благородными металлами предлагается использовать гидрогеназу — фермент, участвующий в превращениях водорода в природе [9]. Ранее нами показано, что гидрогеназный водородный электрод был стабилен в биореакторе, разлагающем крахмал с выделением водорода, в течение 220 часов
[10]. Однако доля потребления водорода при электрокатализе была незначительной (2,7%). В данной работе описаны результаты экспериментов, в которых доля поглощенного при электрокатализе водорода достигала 18,7% от всего выделившегося.
Материалы и методы
Среда и консорциум микроорганизмов. Все эксперименты проводились с микробным консорциумом, выделенным из силосной ямы
[11]. Он был адаптирован для разложения крахмала при температуре 37°С. Инокулят для экспериментов выращивали в пробирках Тунберга (16 мл) для анаэробного культивирования в атмосфере аргона после предварительном прогреве при 100°С в течение 10 минут на водяной (для удаления водород поглощающих бактерий и метаногенов). В качестве модели органических отходов, содержащих крахмал, использовали следующую среду: 0,9 г л-1 NaCl, 0,2 г л-^СЬ, 0,2 г л-1 CaCh, 7,3 г л-^НРО^ 2,7 г л-1 KH2PO4, 1,0 г л-1 пептона, 20 г л-1 крахмала, 50 мг л-1 FeSO4, 10 мг л-^пС12, 10 мл л-1 микроэлементов, 5 мл л-1 витаминов и 7,4 г л-1 KC1 .
В начале серии экспериментов инокулят (10%) вносили в момент заполнения биореактора питательной средой, при последующих экспериментах инокулятом служили микроорганизмы, оставшиеся в ячейке после удаления культуральной жидкости.
Ферментный электрод. Подложкой для электрода служила углеродная лента марки «УРАЛ» ЛТ2-22-15 (Светлогорское производственное объединение «ХИМВОЛОКНО», Светлогорск, Беларусь) с удельным
поверхностным электрическим сопротивлением 15 Ом/м2. На подложку площадью 1,5 или 4 см2 электрополимеризацией осаждали нейтральный красный (0,4 мМ раствор нейтрального красного в 25 мМ KH2PO4, 0.1 M KNO3, изменение прикладываемого напряжения 40 мВ/сек. в диапазоне от —800 мВ до 800 мВ, 25 циклов) [12]. Затем наносили препарат HydSL гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina BBS (2-4 мг/мл) [13] и инкубировали при 40С, pH = 7, 0 в течение 12 часов в 0,05 М калий-фосфатном буфере в аэробных условиях.
Система для интеграции крахмалразлагающего консорциума и гидрогеназного электрода в биореакторе. Рабочая система (рис.1) состоит из электрохимической ячейки, являющейся одновременно и биореактором (1), а также системы контроля и управления процессом брожения и электрокаталитического поглощения водорода гидрогеназным электродом. Система контроля и управления процессом включает в себя pH электрод (2) (Inpro 3030/120, Mettler Toledo), Pt электрод (3), гидрогеназный водородный электрод (4), вспомогательный электрод (5), контроллер pH и измеритель Eh (6) (QMbox, R-Technology, Россия), потенциостат (7) (IPC- Compact, Volta, Россия). Гидрогеназный электрод подключается по трехэлектродной схеме (AgCl-электрод в качестве электрода сравнения и вспомогательный электрод). Регулирование рН осуществляется подачей щелочи (2 M NaOH) перистальтическим насосом (8) (77120-62 60 RPM, Masterflex, USA) из емкости (9). Система также снабжена системой шлангов (вакуумная резина и ПВХ (taygon)) для подачи в ячейку аргона (от баллона с аргоном), емкостью для сбора газа из ячейки (10), а также газопроводом
(11) и вентилем (12) для подачи, при необходимости, в систему аргона. Вся система располагалась в термостате (на схеме не указан). Все аппараты были подключены к компьютеру (13), на который производилась запись информации о процессе. Накопление газа в градуированном цилиндре, установленном днищем вверх (10), записывалось при помощи видеосъемки (каждые 15 мин, камера (LifeCam VX-1000, Microsoft)). После эксперимента данные о заполнении емкости газом переводились в цифровую форму.
Биореактор (рис.2) состоит из двух камер: рабочей (1) (65 см x 40 см x 32 см) и вспомогательной (2) (52 см x 36 см x 32 см), разделенных ионоселективной мембраной (3) (Nafion 125мкм) для предотвращения попадания продуктов восстановления из вспомогательной камеры в рабочую. В рабочей камере располагаются рабочий (4), pH (5) и Eh (6) (Pt4805-SC-DPAS-K8S/120 combination Redox, Mettler Toledo) электроды. Все три электрода подключены к одному электроду сравнения(Ag|AgCl). Рабочая камера имела штуцеры входа и выхода среды (7), а также вывода газа (8). В рабочей камере размещался магнитный мешальник (9), перемешивающий культуральную жидкость (400 об/мин). Во вспомогательной камере (2) располагается вспомогательный электрод (10) и штуцеры входа-выхода (11). Во время экспериментов вспомогательная
камера заполнялась раствором калий-фосфатного буфера (0,05 мМ) с 7,45 г/л KCl и рН =5,5.
Анализ продуктов брожения. Биогаз, синтезируемый микробным консорциумом, анализировали на процентное содержание Н2 газовым хроматографом (ЛХМ 80) с колонкой длиной 1 м, заполненной молекулярным ситом 5А и детектором по теплопроводности (катарометром) с газом носителем Ar.
6 13 7
11
Рис. 1. Схема интегрированной системы, используемой в экспериментах
Концентрации органических кислот (ацетата, пропионата, бутирата, изобутирата) определяли методом газо-жидкостной хроматографии («Цвет 800», Дзержинск, Россия). Хроматограф был оснащен пламенноионизационным детектором (ПИД), в качестве газа-носителя использовали СО2, который подавался со скоростью 30 мл/ мин. Стеклянная колонка (1 м х 2 мм), заполнялась носителем СЬгошовогЪ W/AW-DMCS с 5 % неопентилгликольсукцината (Ииса). Температура инжектора составляла 145°С, а детектора — 185°С. Температурный режим анализа: 80°С; 3 минуты, температурный градиент 6°С/ мин до 175°С, и 8 минут изотермического режима при 175°С. Пробу подготавливали подкислением до рН < 4,0 30 % раствором фосфорной кислоты и центрифугированием (12000 об/мин в течение 3 минут) до и после подкисления, и хранились в замороженном состоянии [14].
Лактат определяли ферментативным методом при помощи лактатдегидрогеназы по увеличению концентрации NADH при 340 нм [15]. Начальную и конечную концентрацию крахмала измеряли антроновым реагентом с предварительной деполимеризацией крахмала до гексоз в концентрированной серной кислоте [16].
Рис. 2. Биореактор с интегрированным гидрогеназным электродом
Результаты и обсуждение
После инокуляции питательную среду заливали в биореактор. Для создания анаэробных условий ячейку барботировали Аг в течение часа. В течение часа начиналось выделение водорода, а через 3 часа (рис.3) значение pH культуральной жидкости снижалось вследствие образования органических кислот активно метаболизирующим консорциумом до заданного (pH = 5, 5). Затем pH подержался автоматическим титрованием. Это значение pH оптимально для максимального выделения биогаза [11]. Ранее было показано, что гидрогеназный электрод имеет оптимум работы в диапазоне значений pH = 5, 5 — 6, 8 [17], поэтому поддерживаемый pH = 5, 5 является оптимальным для микробного консорциума и ферментного водородного электрода. Выделение водорода длилось 44 часа. При этом поглощения не наблюдалось в течение 16 часов после прекращения выделения Н2. В первые 19 часов синтезировалось 62% от всего Н2. К моменту окончания эксперимента было накоплено 3,0 л водорода/л суспензии. Прекращение выделения биогаза было связанно с исчерпанием доступного субстрата.
В момент стабилизации потенциала гидрогеназного электрода (—544 мВ относительно хлорсеребряного электрода при pH = 5,5) к нему
прикладывали ток 200 мкА (режим гальваностата), который поддерживался в течение всего эксперимента.
Если предположить, что электрокатализ при поглощении водорода проходит со 100% кулоновской эффективностью, то, по нашим расчетам, к окончанию брожения гидрогеназный электрод поглотил 0,085 л Н2 в расчете на литр реактора, что составило 2,7% от всего выделившегося объема. В первые 34 часа работы значение потенциала изменялось незначительно (6 мВ), затем медленно начинало расти и в последние 6 часов работы резко возрастало от —389 мВ до —16 мВ. Очевидно, в момент возрастания потенциала в околоэлектродном пространстве концентрация Н2 была практически нулевой вследствие прекращения выделения водорода микробным консорциумом (рис.3) и поглощения водорода гидрогеназным электродом в приэлектродном пространстве. Поскольку рабочий электрод был включен в режим гальваностата, для поддержания заданного тока 200 мкА, трехэлектродная схема начинала подавать повышенный потенциал, в результате чего происходила полная инактивация фермента на электроде.
В отличие от режима гальваностат, в режиме потенциостат поддерживается постоянный потенциал на электроде и изменение концентрации водорода отражается на изменении электрокаталитического тока. Для проверки, того как в этом режиме отсутствие водорода влияет на электрод, были проведены модельные эксперименты. Гидрогеназный электрод (в 0,05 М растворе калий-фосфатного буфера с 0,1 М КС1 и pH = 5, 5) сначала активировали в атмосфере Н2 затем к нему прикладывали перенапряжение (100 и 200 мВ относительно стандартного водородного электрода). После стабилизации силы тока выключали подачу водорода и включали подачу Аг. После часовой экспозиции ферментного электрода в данных условиях в ячейку начинали подавать Н2. На рис. 4 видно, что при обоих перенапряжениях электрод вел себя сходно. Сначала происходило падение значения силы тока до нуля, а при появлении в среде водорода ток возрастал до первоначального значения, т.е. в режиме потенциостата отсутствие водорода не приводило к инактивации электрода. Поэтому в дальнейших экспериментах было решено использовать режим потенциостата.
Для увеличения электрокаталитического тока за счет поглощения водорода в следующей серии экспериментов применяли электрод с повышенной поверхностью (4 см2). В предварительных экспериментах с данным электродом показано, что он способен генерировать электрокаталитический ток, равный 0,77 мА и 1,59 мА при перенапряжении 50 мВ и 100 мВ окисляя водород, подаваемый от генератора водорода.
На ферментный водородный электрод прикладывали перенапряжение 50 мВ и 100 мВ. Выделение водорода (рис.5) проходило те же стадии что и в режиме гальваностата (200 мкА): 1-2 час начало выделения, через 19 часов синтезировалось около 70% от выделившегося водорода. Значение тока генерируемого ферментным электродом имело сходную тенденцию со
Рис. 3. Выделение водорода с одновременной генерацией тока (200 мкА)
в режиме гальваностата
скоростью выделения водорода: в первые часы ферментации ток возрастал, затем достигал пика, и к концу эксперимента имел наименьшие значения.
Хотя в конце ферментации скорость выделения водорода (детектируемая в цилиндре по изменению уровня жидкости) равнялась нулю, на ферментном электроде генерировался ток. Это может быть связанно как с наличием растворенного водорода в околоэлектродном пространстве, так и с еще не оконченным процессом выделения Н2 иммобилизованным на поверхности электрода клостридиальным консорциумом. При этом в эксперименте с прикладываемым перенапряжением в 50 мВ минимальное значение генерируемого тока было 0,53 мА, максимальное 0,96 мА, среднее 0,81 мА, в то время как в случае с перенапряжением в 100 мВ 0,89 мА, 1,68 мА, 1,3 мА соответственно. Пропорционального увеличения силы тока при масштабирование от 1,5 см2 до 4 см2 на ферментном электроде в модельном эксперименте и в эксперименте с генерацией тока из выделяемого микробным консорциумом водорода не наблюдалось. Даже максимальные значения не достигали расчетных величин (1,5 мА и 3,2 мА при 50 мВ и 100 мВ перенапряжения), что вероятно связано с лимитированием диффузией Н2 к гидрогеназному электроду.
В таблице представлены концентрации и продукты метаболизма крахмалразлагающего консорциума микроорганизмов после завершения выделения водорода при наличии ферментного электрода в биореакторе и без него (по данным рис. 2 и 5). Основными продуктами брожения были ацетат (0,033-0,047 М) и бутират (0,056-0,063 М). В следовых количествах присутствовали: лактат, пропионат, изобутират (данные не приведены).
Количество выделенного водорода варьировало в диапазоне 2,47-3,26 л/л, причем потребление гидрогеназным электродом водорода составило
0,084 л/л (режим гальваностата при I = 200 мкА), 0,201 л/л (режим
О 1000 2000 3000 4000 5000 6000
время, сек.
Рис. 4. Поведение гидрогеназного электрода при приложенном перенапряжении в присутствии водорода и без него
7 ----------------------------------------------------------------------------------Г1-8
0,0 <ж>----------1------------1-----------■------------1------------------------
0 10 20 30 40 50 60
Время,час
Рис. 5. Зависимость тока, генерируемого гидрогеназным электродом, скорости выделения водорода и накопления Н2 от времени
потенциостата при перенапряжении 50 мВ) и 0,412 л/л (режим потенциостата при перенапряжении 100 мВ), что составляло 2,7, 5,7 и 18,7% от всего выделившегося водорода соответственно. Отношение количества углерода в продуктах брожения к количеству в питательной среде, было от 87,5 до 102,8% , что свидетельствует об учете основных метаболитов.
Таким образом, показано, что в биореакторе, разработанном нами, возможно потребление водорода с генерацией электрокаталитического тока. Потребление водорода достигало 18,7% от всего выделившегося культурой. При этом скорость и доля потребления водорода лимитировалась
Таблица
Продукты ферментации
Продукты \ условия ферментации I II III
-ФЕ +ФЕ1 -ФЕ +ФЕ2 -ФЕ +ФЕ3
Начальная глюкоза, М 0,095 0,1 0,1 0,1 0,093 0,093
Остаточная глюкоза, М/л; М/М начальной глюкозы (н. г.) 0,01 0,102 0,012 0,123 0,019 0,193 0,021 0,215 0,006 0,067 0,015 0,165
Ацетат, М/л; М/М н. г. 0,047 0,495 0,041 0,404 0,042 0,42 0,045 0,45 0,035 0,372 0,033 0,359
Бутират, М/л; М/М н. г. 0,058 0,61 0,057 0,56 0,056 0,56 0,062 0,62 0,062 0,67 0,063 0,68
Водород, М/л; л/л; М/М н. г. 0,134 3,26 1,42 0,123 3,1 1,22 0,131 3,2 1,31 0,131 3,51 1,31 0,101 2,47 1,1 0,108 2,64 1,16
Потребленный водород, л/л; % от общего 0 0 0,084 2,7 0 0 0,201 5,7 0 0 0,412 18,5
а н /л М/ /л; л/ /л; О ® О ^ 0,129 3,1 1,35 0,185 4,45 1,84 0,099 2,38 0,99 0,144 3,45 1,44 0,129 3,1 1,39 0,156 3,75 1,68
Количество углерода в продуктах, % от н. г. 90,4 96,1 88,4 103,1 87,5 102,8
Примечания:
I, II, III — серии экспериментов; —ФЕ — ферментация без ферментного электрода; +ФЕ1 — биореактор с ферментным электродом, генерирующим ток (200 мкА); +ФЕ2 — биореактор с ферментным электродом, на который прикладывали 50 мВ перенапряжения; +ФЕ3 — биореактор с ферментным электродом, на который прикладывали 100 мВ перенапряжения
не скоростью его выделения и не электрокаталитической активностью электрода, а доступностью водорода в представленном биореакторе. Выделившийся водород, не вступивший в контакт с электродом, уходил из ячейки и становился недоступным для получения электрического тока. При поглощении выделяющегося водорода ток ограничивался в основном доступностью водорода непосредственно на поверхности электрода, что определялось скоростью диффузии водорода в растворе и скоростью перемешивания. Дальнейшее увеличение доли потребленного водорода возможно путем увеличения эффективности перемешивания в ячейке и организации системы таким образом, чтобы выделяющийся водород был доступен гидрогеназному электроду на протяжении всего эксперимента.
Список литературы
1. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation / R.K. Thauer [et al.] // Nature Reviews Microbiology. 2008. V.6. P.579-591.
2. Tsygankov A.A., Tekucheva D.N. Integration of biological H2-producing processes. In: Levin D., Azbar U., editors. State of the art and progress in production of Biohydrogen. Canada: Bentham Science Publishers, 2012. P.78-94.
3. Semi-continuous biohydrogen production as an approach to generate electricity / E.I. Garcia-Pena [et al.] // Bioresour. Technol. 2009. V.100. P.6369-6377.
4. Performance analysis of a proton exchange membrane fuel cell (PEMFC) integrated with a trickling bed bioreactor for biological high-rate hydrogen production / B.S. Jeon [et al.] // Energy & Fuels. 2008. V.22. P.83-86.
5. Dante R.C. Hypotheses for direct PEM fuel cells applications of photobioproduced hydrogen by Chlamydomonas reinhardtii // Int. J. Hydrogen Energy. 2005. V.30. P.421-424.
6. Rosenbaum M., Schroder U., Scholz F. Utilizing the green alga Chlamydomonas reinhardtii for microbial electricity generation: a living solar cell // Appl Microbiol Technol. 2005. V.68. P.753-756.
7. Hydrogen photosynthesis by Rhodobacter capsulatus and its coupling to a PEM fuel cell / D. He [et al.] // J. Power Sources. 2005. V.141. P.19-23.
8. Hydrogenase electrodes for fuel cells / A.A. Karyakin [et al.] // Biochem. Soc. Trans. 2005. V.33. P.73-75.
9. Development of a solar-powered microbial fuel cell / Y.K. Cho [et al.] // J. of Applied Microbiology. 2008. V.104. P.640-650.
10. Demonstration of hydrogenase electrode operation in a bioreactor / E.S. Shastik [et al.] // Enzyme and Microbial Technology. 2011. V.49. P.453-458.
11. Towards the integration of dark- and photo-fermentative waste treatment. 2. Optimization of starch-dependent fermentative hydrogen production / B.F. Belokopytov [et al.] // Int. J. Hydrog. Energy. 2009. V.34. P.3324-3332.
12. Воронин О.Г. Высокоэффективный электрокатализ гидрогеназами для конверсии органических отходов в электричество: дисс....к. хим. наук. М., 2010. 135 с.
13. Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Кондратьева Е.Н. Очистка и свойства гидрогеназы из фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina // Биохимия. 1976. Т.41. Вып.5. C.836-842.
14. Towards the integration of dark and photo fermentative waste treatment. 1. Hydrogen photoproduction by purple bacterium Rhodobacter capsulatus using potential products of starch fermentation / T.V. Laurinavichene [et al.] // Int. J. Hydrogen Energy. 2008. V.33(23). P.7020-7026.
15. Asatiani V. Enzymatic methods of analysis. M.: Nauka, 1969. 739 p.
16. Hanson R., Phillips G. Chemical composition of bacterial cell: in Gerhardt P, editor. Anual of methods for general bacteriology. M.: Mir, 1984.
17. Measuring the pH dependence of hydrogenase activities / A.A. Tsygankov [et al.] // Biochemistry. 2007. V.72. P.968-973.
Шастик Евгений Сергеевич ([email protected]), аспирант, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.
Зорин Николай Алексеевич, к.б.н., старший научный сотрудник,
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино.
Цыганков Анатолий Анатольевич ([email protected]), д.б.н., зав. лабораторией, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область.
Integrative system for electricity generation via hydrogenase electrode located in bioreactor with microbium consortia
E. S. Shastik, N.A. Zorin, A.A. Tsygankov
Abstract. The opportunity for electricity generation by hydrogenase electrode in bioreactor with heterotrophic consortia decomposing starch was shown. Increasing hydrogenase electrode surface area up to 4 cm2 leads to 18.7% of evolved hydrogen uptake. Variants increasing hydrogen uptake are discussed.
Keywords: hydrogen, bioreactor electricity generation from organic wastes, hydrogenase electrode microbial consortia.
Shastik Evgeny ([email protected]), posgraduate student, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.
Zorin Nikolay, candidate of biological sciences, senior researcher, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.
Tsygankov Anatoly ([email protected]), doctor of biological sciences, head of the laboratory, Institute of Basic Biological Problems of RAS, Pushchino.
Поступила 17.05.2012
