CC BY
175
УДК 581.085
Н.А. Вечернина, O.K. Таварткиладзе, С. В. Жаркова
Каллусогенез и регенерационная способность тканей и органов Allium cepa L. in vitro
Для повышения эффективности селекционной работы на разных ее этапах все чаще привлекаются нетрадиционные методы. Одним из них является культивирование изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro. Однако основным препятствием на пути использования этого направления исследований может стать отсутствие регенерационной способности у культивируемых in vitro тканей. Поэтому одной из основных задач экспериментаторов традиционно считается решение проблемы управления процессами регенерации.
В большинстве случаев способность к регенерации обнаруживается не у первичного эксплан-та, а в возникшем от него каллусе. Успех получения высокоморфогенного каллуса зависит от наличия в первичном экспланте митотически активных клеток. Для индукции каллуса, особенно у традиционно сложных в отношении регенерационной способности in vitro объектов исследования - однодольных [1; 2], в том числе и представителей семейства Alliaceae, чаще всего используют завязи и семяпочки [3] .
Возможность управления процессами регенерации in vitro растений Allium cepa L. позволит относительно быстро получать гомозиготный материал из обогащенных в генетическом отношении гибридов и использовать его в гетерозис-ной селекции.
Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали лук сорта Ермак. Первичными эксплантами являлись изолированные семяпочки и завязи, которые вычленяли из цветков, находящихся в нераскрывшихся соцветиях диаметром 2-2,5 см. Поверхностную стерилизацию соцветия проводили 0,1% раствором сулемы в течение 30 минут с последующим промыванием в четырех порциях стерильной дистиллированной воды. Затем снимали с соцветия покрывало и вычленяли семяпочки и завязи.
Экспланты культивировали на агаризованной питательной среде. В качестве минеральной основы использовали среду по прописи BDS [4] . Среды дополняли регуляторами роста и развития растений: 6-бензиламинопурином (БАЛ) ,
кинетином (К), 1-нафтилуксусной кислотой (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), 4-амино-3,5, 6-трихлорпиколиновой кислотой (АТХП), рН среды доводили до значения 5,6-5,8 и
стерилизовали в автоклаве при давлении 0, 9+0,1 атм в течение 15 минут. Все операции, требующие соблюдения асептических условий, проводили в ламинар-боксе.
Каллус индуцировали в условиях темноты, а процессы регенерации - в условиях фотопериода 16/8 часов. Культивирование проводили при 24+1° С.
для вычленения семяпочек и завязей, а также при наблюдении ранних стадий развития морфогенных структур в каллусе, использовали стереомикроскоп МБС- 9. В каждом варианте опыта культивировали 15-20 эксплантов.
Результаты и обсуждения. При индукции каллуса от семяпочек лука было испытано 12 вариантов питательных сред, различающихся по составу и концентрации регуляторов роста: БАЛ (1, 2 и 5 мкМ) в сочетании с 2,4-Д или АТХП (10 и 20 мкМ) . Оказалось, что использование БАЛ в сочетании с АТХП было неэффективно, так как не удалось индуцировать развитие каллуса. Тогда как 50% семяпочек на среде ВББ + БАП 2мкМ + 2,4-Д 10мкМ пролиферировали каллус. Повышение концентрации 2,4-Д до 20 мкМ при той же концентрации цитокинина снизило эту способность до 6%. Увеличение концетрации БАП с 1 до 5 мкМ при использовании 10 мкМ 2,4-Д изменило количество пролиферирующих семяпочек с 14 до 9%.
Каллус от завязей индуцировали на 20 вариантах питательных сред. Результаты этого эксперимента приведены в таблице 1.
Представленные данные показывают, что интенсивность каллусогенеза завязей, так же, как и семяпочек, зависела от природы и концентрации используемых ауксинов. Наиболее индуктивными были среды, дополненные 2,4-Д и АТХП. Комбинация 1 мкМ БАП с 10 мкМ 2,4-Д
Таблица 1
Влияние регуляторов роста на интенсивность каллусогенеза (%) завязей лука (п = 20)
Цитоки- нин мкМ Ауксин, мкМ
НУК 2,4-Д АТХП
5 20 5 10 20 5 10 20
БАП 1 14 - 7 75 - З8 0 50
2 - 40 - 50 40 - 55 27
5 - - - - 0 - ЗЗ 12
к 1 0 - ЗЗ - - 29 - -
2 - З5 - - 56 - - 44
БИОЛОГИЯ
позволила индуцировать каллус у 75% эксплан-тов. Полученные в условиях темноты каллусы по морфологическим характеристикам не различались и представляли собой плотный каллус желтого цвета.
Каллусы, помещенные на регенерационные среды и в условия фотопериода, уже через две недели культивирования можно было разделить на три морфотипа: I - белые, рыхлые, мелкозернистые; II - белые с зелеными очагами, плотные; III - желтые, рыхлые, глобулярные. Причем каллус, индуцированный от семяпочек, был представлен только третьим морфотипом, тогда как каллус от завязей был всех трех морфотипов.
Регенерационную способность каллусов проверяли на четырех типах питательных сред (табл. 2).
Наибольшая частота образования морфоген-
Таблица 2
Влияние регуляторов роста на регенерационную способность и морфогенез каллуса завязей лука
Регуляторы роста, мкМ Общее количество каллусов, шт. Морфогенез, %
почки корни
БАП8 + АХТП3 44 4 0
БАП8 + 2,4-Д3 23 13 0
БАП4 + НУК0,5 22 18 26
БАП8 15 0 46
ного каллуса наблюдалась в среде с БАП 8 мкМ, однако происходила регенерация только корней. Высокий процент морфогенеза отмечен на среде ВББ + БАП 4 мкМ + НУК 0, 5 мкМ, причем более половины каллусов регенерировали почки. Использование в составе среды 2,4-Д индуцировало регенерацию только почек, не было отмечено ни одного каллуса с ризогенезом. АТХП быта менее эффективна по сравнению с 2,4-Д, так как только у 4% каллусов происходила регенерация почек. Питательные среды, в которых происходила индукция ризогенеза, в последующих экспериментах не использовались, так как при последующем культивировании происходил интенсивный синтез эндогенного ауксина, который стимулировал процессы вторичной дедифференциров-ки организованных структур. Однако ряд исследователей отмечают, что именно сочетание БАП и НУК являлось одним из оптимальных факторов, способствующих регенерации почек и побегов у лука [5] . Вероятно, следует учитывать и влияние генотипа на регенерационную способность каллусов [6; 7] .
При изучении влияния морфотипа каллуса на регенерационную способность оказалось, что только каллусы II и III типов быши способны к регенерации. В таблице 3 представлены данные, отражающие влияние морфологических осо-
Таблица 3
Влияние морфологии каллуса завязей лука на регенерационную способность
Регуляторы роста, мкМ Морфотип каллуса Интенсивность морфогенеза, %
почки корни
БАП8 + АТХП3 II 40 20
III 0 33
БАП8 + 2,4-Д3 II 60 30
III 0 11
бенностей каллуса на его морфогенетический потенциал.
Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что большей регенерационной способностью обладал белый каллус с зелеными очагами. Причем в среде с 2,4-Д его морфогенетический потенциал был выше, чем в среде с АТХП.
Каллус, индуцированный от семяпочек, на протяжении всего периода культивирования по морфологии был желтым, рыхлым, оводненным. Такие типы каллусов для многих культур, в том числе и для лука, являются неморфогенными или проявляют очень низкий морфогенетический потенциал.
Наблюдая за динамикой изменения морфогенетических процессов, которые представлены в таблице 4, можно отметить, что с увеличением срока культивирования происходит уменьшение регенерационной способности каллуса, индуцированного от завязей лука, начиная с 3-го пассажа на регенерационной среде с АТХП и с 4-го пассажа - на регенерационной среде с 2,4-Д.
Снижение частоты регенерации с увеличением срока культивирования свидетельствует о том, что каллусы лука в основном реализуют свой морфогенетический потенциал на 9-14 неделе культивирования, т.е. получать растения-регенеран-ты лука целесообразно не позднее 2-3 пассажей. Такой же подход предпринимали и другие исследователи, работающие с растениями лука. Кроме того, отменено, что частота регенерации растений выше при использовании в качестве эксплантов завязей, чем семяпочек [8] .
Таблица 4 Частота регенерации (%) плотного белого каллуса с зелеными очагами в зависимости от длительности культивирования
Регуляторы роста, мкМ Пассаж
1 2 3 4
БАП8 + АТХП3 8 60 0 0
БАП8 + 2,4-Д3 32 92 89 30
Выводы
1. Морфогенетический потенциал каллусных тканей завязей выше, чем у семяпочек.
2. Установлено, что плотный белый каллус с зелеными очагами обладает наивысшей способностью к регенерации почек.
3. Преобладание в среде цитокинина БАП
над ауксинами индуцирует морфогенез в каллус-ной культуре завязей.
4. Частота регенерации растений из кал-лусных культур уменьшается с увеличением периода культивирования: наиболее интенсивно процессы морфогенеза происходят на 9-14 неделе культивирования.
Литература
1. Копертек Л. Г., Бутенко Р. Г. Нативные фитогормоны экспланта и морфогенез пшеницы in vitro / / Физиол. раст. 1995. Т. 42. №4.
2. Кучеренко Л.А. О некоторых параметрах технологии регенерации риса in vitro // С/х биология. 1994. №1.
3. Smith B.M., Codwin R.M., Harvey E., Werner C.P.Gynogenesis from whole flowerbuds in bulb onions (Allium cepa L.) and luks (A.purrumL.) // J.Genet. and Breed. 1991. V. 45. №4.
4. Калинин Ф.М., Сарнацкая В.В., Полищук Е.В. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.
5. Gemesni J.A., Mantinovich L. In vitro gynogenesis
induction in Hungarion lines of onion (Allium cepa L.) // Loldsegtermesztesi hut. intez. bull. 1995. V. 27.
6. Чернышова В.Г., Долгих Ю.И. Влияние генотипа на способность к морфогенезу в культуре тканей кукурузы // Биология культивируемых клеток и биотехн: Тез. докл. междунар. конф. Новосибирск, 1988.
7. Ралдугина Г.Н. ,Соболькова Г.И. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса // Физиол. раст. 1995. Т. 42. №6.
8. Bohanes B., JakseМ., IhanA., Javornik B. Studies of gynogenesis in onion (Allium cepa L.) : Induction procedurus and genetic analysis of regenerants // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 40. №3.
