CC BY
45
▲1
SSM
УДК: 615.015.1/577.352 Код специальности ВАК: 14.03.06, 03.01.02
К ВОПРОСУ О МЕХАНИЗМЕ МЕМБРАННОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ НЕКОТОРЫХ АММОНИЕВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИДОКАИНА И НОВОКАИНА
О.В. Василькина, М.Х.С. Яхья, Д.С. Блинов, Н.А. Курганов, А.Г. Ковышкин, Е.В. Блинова,
ФГБОУ ВО «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва», г. Саранск
Блинова Екатерина Валериевна - e-mail: [email protected]
В опытах по измерению рефрактерности изолированных полосок миокарда правого желудочка сердца крыс было вычислено, что постоянная времени действия четвертичных производных лидокаина (ЛХТ-12-02) и новокаина (ЛХТ-Н204) на препараты сердечной ткани составляет порядка 103 см/с. Однако, чтобы объяснить их проницаемость в ионизированном виде, значение коэффициента проницаемости должно быть не менее 106 см/с, что на несколько порядков выше значений, полученных в экспериментах с билипидными мембранами (БЛМ). Таким образом, транспорт рассматриваемых четвертичных соединений в виде ионов не может обеспечить экспериментально наблюдаемые скорости их входа в сердечную ткань. На основе соотношения между коэффициентом проницаемости БЛМ и коэффициентом распределения в системе октанол -вода, определенным для четвертичных соединений лидокаина и новокаина, провели расчет коэффициентов проницаемости для нейтральной формы (в виде ионных пар) ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204. Полученные значения коэффициентов позволили заключить, что изученные вещества проходят через БЛМ в электронейтральном виде.
Ключевые слова: лидокаин, новокаин, проницаемость, заряженная молекула, ионные пары, билипидные мембраны.
Evaluating isolated rat's heart tissue refractory dynamic, it has been calculated that the time constant of the derivatives action on the heart tissue is approximately 103 cm/s. Therefore the value of the coefficient of permeability must be no less than 106 cm/s to explain the derivatives effect on refractory whereas it is higher than the values obtained in experiments with bilipid membranes (BLM). Thus, transport of quaternary derivatives LHT-12-02 and LHT-N204 as ions cannot provide experimentally observed speed their entrance into cardiac tissue. On the basis of the relationship between the coefficient of permeability of the BLM and the coefficient of distribution in octanol-water system for quaternary ammonium compounds of Lidocaine and Procaine, we calculated permeability coefficients for neutral form (in the form of ion pairs) of LHT-12-02 and LHT-N204. Obtained coefficients allowed to conclude that the derivatives of Lidocaine and Procaine likely pass through the cardiac cell membrane in electro neutral form.
Key words: Lidocaine, Procaine, permeability, charged derivative,
ion pairs, and bilipid membranes.
Введение
Согласно современным представлениям о взаимодействии молекул местноанестезирующих и некоторых антиаритмических средств с билипидными мембранами, фармакологическое действие заряженных молекул при их экстрацеллюлярном приложении ничтожно мало, т. к. они плохо проникают через мембрану, тогда как терапевтический эффект указанных веществ развивается за счет блокады натриевых каналов с внутренней (внутриклеточной) стороны цитоплазматической мембраны [1, 2, 3, 4]. В частности, Sunami и соавт. (2000) было показано, что четвертичное аммониевое производное лидокаина QX-314 (N-этил-лидокаин) в отличие от своего структурного предшественника не способно подавлять входящий натриевый ток волокон изолированного нерва [5]. Позже, в работе по изучению механочувствительности NaV1.5-каналов Beyder и соавт. (2012), были получены аналогичные результаты [6]. Однако, в 2007 году была опубликована статья Lim и соавт., в которой авторы описывали местноанестезирующую активность вещества QX-314 при его внеклеточном применении у мышей и свиней гвиней-
ской породы, характеризующуюся длительным латентным периодом и значительной продолжительностью эффекта [7]. Tsuchiya и Mizogami подтвердили справедливость этих результатов в опытах на модельных мембранах [8].
В нашей стране на протяжении ряда лет изучаются фармакологические свойства четвертичных аммониевых производных тримекаина, лидокаина, новокаина и новокаи-намида [9, 10, 11]. В серии работ была показана высокая антиаритмическая активность новых соединений, их гемо-динамическая безопасность [10]. В опытах на изолированных мышечных полосках сердца крыс и клетках нервных ганглиев было установлено, что в основе механизма действия соединений лежит ингибирование натриевого тока, в то время как не было отмечено влияния соединений на активность калиевых каналов [9]. Однако, оставался открытым вопрос, а каков же возможный механизм мембранной проницаемости для представителей веществ подобной химической природы. Попытка ответить на этот вопрос или хотя бы приблизиться к ответу составляет основную цель настоящего исследования.
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Материал и методы
Поскольку четвертичные аммониевые производные являются постоянно заряженными соединениями, плохо проникающими через липидные мембраны, вопрос о механизме их проникновения внутрь клетки является чрезвычайно важным. Если не предполагать существование каких-либо переносчиков, то можно думать, что четвертичные аммониевые соединения могут проходить через мембрану в виде положительно заряженных ионов по градиенту концентрации и потенциала либо в электронейтральном виде вместе с анионами. Чтобы оценить реальность подобных механизмов, нами были измерены коэффициенты проницаемости бислойных липидных мембран (БЛМ) для четвертичных производных лидокаина и новокаина в виде ионов. Проницаемость БЛМ для исследуемых веществ в виде ионных пар (нейтральных соединений) оценивалась теоретически - на основе предположения о том, что так же, как и для неэлектролитов, проницаемость липидного бислоя определяется гидрофобностью соединения. О проницаемости судили по изменению реф-рактерности изолированных препаратов сердечной ткани правого желудочка крыс-самцов. Животные были получены из питомника Филиала «Электрогорский» ФГБУН НЦБМТ ФМБА. Исследование проводилось в соответствии с заключением Локального этического комитета МГУ им. Н.П. Огарёва от 15.02.2015 г. (протокол № 5). Проницаемость липидной мембраны для ионов - четвертичных производных новокаина и лидокаина - определялась по величине тока короткого замыкания, возникающего в ответ на добавление соединения с одной стороны мембраны. Значение коэффициента проницаемости Р+ вычислялось по формуле:
Р+=I/(FxSxC),
где I - ток короткого замыкания, F - число Фарадея, S - площадь мембраны, С - концентрация соединения, добавленного в раствор с цис-стороны мембраны.
Бислойные липидные мембраны формировались из раствора липидов мозга быка в гептане на отверстии 0,8 мм в тефлоновом стаканчике. Измерение рефрактер-ности проводилось на сердечной ткани крыс, помещенной эндокардом вверх в камеру для перфузии. Перфузия проводилась оксигенированным карбогеном раствором Тироде. Препараты стимулировались с периодом 500 мс прямоугольными импульсами тока. В качестве величины рефрактерности принимался минимальный период стимулирования, когда в ответ на каждый стимул возникала распространенная волна возбуждения. Коэффициент экстракции исследуемых соединений в двухфазной среде октанол-вода, принятый за меру гидрофобности, определялся по равновесному распределению соединений между двумя фазами при комнатной температуре.
Результаты и их обсуждение
Результаты измерения рефрактерности под действием лидокаина, новокаина и их производных - ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204, показаны на рис.
В использованных концентрациях все соединения (кроме новокаина) после часа перфузии заметно увеличивали рефрактерность ткани желудочка. Видно, что через
РИС.
Относительное увеличение рефрактерности ткани желудочка сердца крысы (в% к исходному значению) под действием: 15 мкМ лидокаина (п=5), 50 мкМ новокаина (п=4), 5 мкМ ЛХТ-12-02 (п=6) и 30 мкМ ЛХТ-Н204 (п=5). Среднее значение рефрактерности в контроле: 92±3 (лидокаин), 90±7 (новокаин), 94±8 (ЛХТ-12-02) и 96±4 мс (ЛХТ-Н204). Приведены средние значения и среднеквадратичные отклонения. По оси абсцисс - время регистрации параметров в минутах.
▲1
5щ
60-80 мин после начала перфузии лидокаином ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204 значения рефрактерности возрастали в 1,5-2 раза, а для лидокаина и ЛХТ-12-02 выходили на стационарный уровень. За то же время рефрактерность новокаина повышалась в среднем на 30%. При использовании в три раза большей концентрации препарата (1,5х10-4 М) рефрактерность увеличивалась в существенно большей степени. Однако эти изменения, как правило, были необратимыми.
При изменении тока короткого замыкания БЛМ в ответ на добавление ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204 в концентрации больше 0,2 мМ с цис-стороны мембраны в растворе, содержащем 90 мМ №С1, 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, наблюдалась медленная релаксация тока и эффект насыщения зависимости тока короткого замыкания от концентрации добавляемого вещества. По этой причине измерения коэффициентов проницаемости Р+ проводились при концентрации исследуемых соединений 0,05-0,2 мМ (таблица).
Для оценки проницаемости необходимо сопоставить скорость изменения рефрактерности сердечной ткани с оценкой скорости входа изучаемых соединений в клетку, предполагая, что липидный бислой клеточной мембраны лимитирует поток исследуемого соединения. Поток заряженного соединения в клетку, если мембрана представлена симметричным энергетическим барьером, описывается уравнением [12]:
{/5=Р+(свнешехр-2Рф/2-свнутехр2|5ф/2), (1),
где ] - поток вещества, S - площадь поверхности клетки, свнеш и свнут - внеклеточная и внутриклеточная концентрации вещества, Z - валентность соединения, ф - трансмембранный потенциал, p=F/RT=40 В-1. Так как ]^Мсвнут/ dt), где (V - объем клетки), при свнеш=Co=const
свнут=с0 ехр-2вф (1 - ехр */т), (2),
где т^ ехр-^ф/2/Р+5. Для сердечной клетки размером 100-150x10-20 мкм и ф= -80 мВ [13] Р+т^2х10-3 см. Необходимо обратить внимание на то, что полученная оценка Р+т«2х10-3 см верна с точностью до порядка величины, так как, например, не учитывает неравномерного распределения молекул внутри клетки и их избыточного
накопления в каких-либо клеточных органеллах. Данное обстоятельство, теоретически, может в несколько раз увеличить величину Р+т.
Как видно на рис., постоянная времени действия исследованных четвертичных соединений на препараты сердечной ткани порядка 103 с. Поэтому, исходя из формулы (2), значения Р+ должны быть не менее 106 см/с, что на несколько порядков выше значений, полученных в экспериментах с билипидными мембранами (таблица). Таким образом, транспорт четвертичных соединений - производных новокаина и лидокаина - в виде ионов не может обеспечить экспериментально наблюдаемые скорости входа ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204 в сердечную ткань.
Как мы уже упоминали ранее, возможен и иной вариант транспорта четвертичных производных - перенос в электронейтральном виде. Подобная возможность неоднократно обсуждалась в литературе [5, 8], однако единой точки зрения на данную тему не было. Экспериментально было показано, что проницаемость для ионных пар может быть больше, чем проницаемость для одиночного иона [8]. При таком подходе к оценке мы рассматривали ионные пары в мембране как нейтральные молекулы неэлектролита, образованные исследуемым четвертичным соединением и основным анионом электролита - хлором. Сегодня для большого числа органических соединений показано, что коэффициент проницаемости мембраны для неэлектролитов коррелирует со степенью гидрофобности соединения. За меру гидрофобности принимают величину коэффициента распределения соединения между органическим растворителем и водой. Соотношение между коэффициентом проницаемости БЛМ Р и коэффициентом распределения в системе октанол - вода Ков описывается уравнением:
Р=а Ков, (3)
где а=4х10-3 см/с для билипидных мембран из лецитина, а=6х10-4 см/с для билипидных мембран из лецитина с холестерином [14]. Соотношение (3) можно применить для оценки коэффициентов проницаемости нейтральной формы (ионные пары) четвертичных соединений, изучаемых нами. В формуле (3) Ков - это отношение концентраций нейтральных форм в октаноле и в водном растворе, а для исследуемых заряженных соединений концентрация ионных пар в водном растворе неизвестна. Miekisz и соавт. было показано, что это не мешает оценкам [12].
Вычисляя коэффициенты проницаемости по формуле (3), мы предполагали, что указанное соотношение в одинаковой степени должно выполняться как для неэлектролитов (для которых и были получены), так и для нейтральной формы четвертичных соединений, учитывая, что измеренные величины Ков лежат в пределах величин Ков неэлектролитов. В отличие от коэффициентов проницаемости Р+ для ионов полученные нами значения коэффициентов проницаемости Рт ионных пар достаточно велики, чтобы объяснить наблюдаемые в эксперименте изменения электрофизиологических характеристик сердечной ткани (рис.). Более того, величины т=10 и 20 с для ЛХТ-12-02 и ЛХТ-Н204, полученные из соотношения Р+т=2х10-3 см (если вместо Р+ подставить Рт) даже заметно меньше
ТАБЛИЦА.
Значения коэффициентов проницаемости лидокаина, новокаина и их четвертичных аммониевых производных через липидные мембраны
Соединение п Р+х109, см/с Кэ св Ртх104, см/с
ЛХТ-12-02 8 6,8±1,3 8,5±0,8 2,2
ЛХТ-Н204 8 3,4±1,1 4,3±0,4 1,3
Лидокаин 5 0,6±0,1 0,37±0,05 0,09
Новокаин 5 1,1±0,2 0,22±0,04 0,04
Примечание: Р+ - коэффициент проницаемости БЛМ для данного органического катиона; Кэ св - коэффициент экстракции данного соединения в октанол; Рт - теоретическая оценка значения коэффициента проницаемости бислоя для электронейтральной формы соединения; цифры в скобках - число измерений.
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
величины 103 с, характерной для экспериментальных данных на рис. Последние различия, однако, несущественны. Как уже упоминалось выше, соотношение Р+т=2х10-3 см верно с точностью до порядка, а экспериментальная величина т=103 с в значительной степени может быть обусловлена диффузией веществ в толще сердечной ткани.
Таким образом, на основании приведенных рассуждений представление об ионных парах позволяет количественно объяснить механизм проницаемости четвертичных аммониевых производных новокаина и лидокаина через биологическую мембрану.
ЛИТЕРАТУРА
1. Becker D.E., Reed K.L. Essentials of local anesthetic pharmacology. Anesthesia Progress. 2006. Vol. 53. № 3. P. 98-109.
2. Mike A., Lukas P. The enigmatic drug binding site for sodium channel inhibitors. Curr. Mol. Pharmacol. 2010. Vol. 3. P. 129-144.
3. Pless S.A., Galpin J.D., Frankel A., Ahern C.A. Molecular basis for class Ib antiarrhythmic inhibition of cardiac sodium channels. Nat. Commun. 2011. Vol. 2. P. 351.
4. Tsuchiya H., Mizogami M. Membrane interactivity of charged local anesthetic derivative and stereoselectivity in membrane interaction of local anesthetic enantiomers. Local and Regional Anesthesia. 2008. Vol. 1. P. 1-9.
5. Sunami A., Glaaser I.W., Fozzard H.A. A critical residue for isoform difference in tetrodotoxin affinity is a molecular determinant of the external access path for local anesthetics in the cardiac sodium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000. Vol. 97. № 5. P. 2326-2331.
6. Beyder A., Strege P.R., Bernard C., Farrugia G. Membrane permeable local anesthetics modulate NaV1.5 mechanosensivity. Channels. 2012. Vol. 6. № 4. P. 308-316.
7. Lim T.K.Y., MacLeod B.A., Ries C.R., Schwarz S.K.W. The quaternary lidocaine derivative, QX-314, produces long-lasting local anesthesia in animal models in vivo. Anesthesiology. 2007. Vol. 107. № 2. P. 305-311.
8. Tsuchiya H., Mizogami M. Interaction of local anesthetics with biomembranes consisting of phospholipids and cholesterol: mechanistic and clinical implications for anesthetic and cardiotoxic effects. Anesthesiology Research and Practice. 2013. Vol. 13. 18 p. Article ID 297141.
9. Балашов В.П., Блинов Д.С., Казаченко В.Н. и др. Мембранные механизмы антиаритмического действия кватернидина. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 139. № 6. С. 656-659.
Balashov V.P., Blinov D.S., Kazachenko V.N. i dr. Membrannie mahanizmi antiaritmicheskogo deistvia kvaternidina. Bulleten' eksperimental'noy biologii I meditzini. 2005. T. 139. № 6. S. 656-659.
10. Блинов Д.С., Сингх Л.Н., Елизарова Ю.Н. и др. Сравнительное изучение токсичности и антиаритмической активности некоторых органических соединений диметилацетамида. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т. 77. № 5. С. 20-22.
BlinovD.S., Singh L.N., Elizarova Yu.N. idr. Sravnitel'noeizuchenie toksichnosti i antiaritmicheskoy aktivnosti nekotorih organicheskih soedinenij dimetilazetamida. Eksperimental'naja I klinicheskaja farmakologija. 2014. T. 77. № 5. S. 20-22.
11. Костин Я.В., Блинов Д.С., Моисеева И.Я. Противоаритми-ческая активность аммониевого производного тримекаина на фоне ишемического повреждения сердца. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. Т. 66. № 5. С. 29-31.
Kostin Ya.V, Blinov D.S., Moiseeva I.Ya. Protivoaritmicheskaja aktivnost' ammonievogo proizvodnogo trimekaina na fone ishemicheskogo povregdenija serdcza // Eksperimental'naja I klinicheskaja farmakologija. 2003. T. 66. № 5. S. 29-31.
12. Miekisz J. Mathematical models of ion transport through membrane channels / J. Miekisz, J. Gomulkiewicz, S. Miekisz // Matematica Applicanda. 2014. Vol. 42. № 1. P. 39-62.
13. Irisawa H. Modulation by intracellular ATP and Cyclic AMP of the slow inward current in isolated single ventricular cells of the guinea-pig / H. Irisawa, S. Kokubun // J. Physiol. 1983. Vol. 338. P. 321-337.
14. Zocher F. Local partition coefficients govern solute permeability of cholesterol-containing membrane / F. Zocher, D. van der Spoel, P. Pohl, J.S. Hub // Biophysical Journal. 2013. Vol. 105. P. 2760-2770. —_
