CC BY
15
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 58-63
УДК: 615.2 DOI: 10.24411/1609-2163-2018-16060
ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ МАГНИЕВОГО ПРОИЗВОДНОГО ОРГАНИЧЕСКОЙ
КИСЛОТЫ
Е.В. СЕМЕЛЕВА, И.А. ГРОМОВА, Е.В. БЛИНОВА, М.М. ГЕРАСЬКИНА, Д.С. БЛИНОВ, Л.В. ВАНЬКОВА,
А.В. НОВИКОВ, А.Н. ЧУДАЙКИН
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва», ул. Большевистская, 68, г, Саранск, 430005, Россия, e-mail: [email protected]
Аннотация. Исследования проведены на 30 нелинейных белых крысах обоего пола с исходной массой 180-220 г, 36 нелинейных крысах самцах с исходной массой 350-400 г. Использована модель интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии с ее последующей реперфузией. Изучено фармакологическое церебропротекторное действие магниевой соли 2-аминоэтансульфоновой кислоты (лабораторный шифр ЛХТ-317) в виде субстанции. Исследуемое соединение при внутривенном введении в дозах 25 и 50 мг/кг эффективно снижает уровень глутаминовой кислоты крови, являющейся медиатором эксайтотоксичности. Не обнаружено дозозависимости реализации фармакологического эффекта. Подкожное введение соединения в диапазоне доз от 50 до 100 мг/кг не приводит к снижению уровня глутамата в крови. На модели транзиторной ишемии и реперфузии головного мозга внутривенное введение ЛХТ-317 в дозе 25 мг/кг в профилактическом и терапевтическом режимах сопровождается снижением моторного дефицита и объема некроза головного мозга на фоне уменьшения плазменных концентраций глутаминовой кислоты. Полученные результаты указывают на то, что соединение ЛХТ-317 обладает выраженным нейропротективным эффектом при ишемиче-ском повреждении тканей головного мозга, способствует уменьшению симптомов ишемического инсульта, ускоряет восстановление нарушенных функций головного мозга.
Ключевые слова: ЛХТ-317, глутаминовая кислота, эксайтотоксичность, ишемия головного мозга, реперфузия, двигательная функция, зона некроза головного мозга.
Введение. Сосудистые катастрофы головного мозга, травматическое повреждение ЦНС, дегенеративно-дистрофические процессы сохраняют лидирующие позиции по уровню заболеваемости и прогностической значимости в популяции молодых людей и лиц пожилого и старческого возраста [4,6,8]. До настоящего времени не разработано эффективных консервативных методов лечения и профилактики указанных серьезных заболеваний. Вместе с тем, установлена прямая зависимость между уровнем глутаминовой кислоты в экстрацел-люлярной жидкости тканей головного мозга и инсультом, менингитом, травматическим поражением головного мозга, а также хроническими патологическими процессами ЦНС, такими как ВИЧ-ассоциированная деменция, боковой амиотрофический склероз и др. [2,3,7,10]. При всех указанных патологиях предотвращение роста концентрации глутамино-вой кислоты в мозгу позволяет улучшать последствия указанных патологий как у людей, так и в экспериментах на животных [2,10].
Цель исследования - изучение влияния нового органического соединения магния ЛХТ-317 на динамику концентрации глутаминовой кислоты, а также течение ишемии/реперфузии головного мозга в эксперименте.
Материалы и методы исследования. Исследование проведено с соблюдением требований приказа Минздрава России №199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», иными нормативными правовыми актами, регламентирующими доклинические лабораторные исследования, основываясь на принципах гуманного обращения с подопытными животными. Протоколы лабораторных экспериментов прошли этическую экспертизу на заседании Локального этического комитета Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» (21 октября 2017 года, протокол №10). Объектом исследования являлось соединение с лабораторным шифром ЛХТ-317 (магния аминоэтансульфо-нат), синтезированное в АО «ВНЦ БАВ» (Россия) в виде субстанции.
Концентрацию глутаминовой кислоты в крови измеряли у наркотизированных внутривенно уретаном в дозе 400 мг/кг нелинейных белых лабораторных крыс обоего пола массой 180-220 г. У животного осуществляли катетеризацию хвостовых артерии и вены при помощи катетеров G24, которые фиксировали на спине животных. Внутривенное введение ЛХТ-317 осуществляли через первый канал инжектора, отбор образцов крови проводили через второй канал электронного программируемого двух-канального инжектора производства «Kent Scientific» (США). Глутаминовую кислоту (Sigma Aldrich, >98%) вводили внутривенно в дозе 0,015 мкг/кг в 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций в объеме 0,5 мл болюсно. Соединение вводили внутривенно в дозах 50 и 25 мг/кг. Для дозы 25 мг/кг была проведена дополнительная экспериментальная серия с повторным введением вещества в той же дозе через 1 час после первого введения. Крысам контрольной группы вводили соответствующий объем 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Отбор образцов крови осуществляли перед введением и через 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения фармакологического агента в объеме 0,2 мл. Биохимическое определение содержания глутаминовой кислоты в образце проводили флюориметрическим методом по Graham and Aprison [5] на фотометре «Emilite1201» (США) при длине волны активации 350 нм и длине волны регистрации 460 нм.
Фокальную ишемию головного мозга с последующей реперфузией моделировали у нелинейных белых крыс-самцов весом 350-400 г, наркотизированных уретаном в дозе 400 мг/кг внутривенно с помощью интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии по методике, описанном Longa et al. (1989) [9]. В экспериментах для окклюзии средней мозговой артерии были использованы филаменты фирмы «DOCCOL» (США), с помощью силиконового наконечника которым перекрывали устье от-хождения средней мозговой артерии. В экспериментах с реперфузией филамент оставляли на 80 минут, затем его осторожно вынимали. После снятия микрохирургической сосудистой клипсы, рану послойно ушивали, местно обрабатывали раствором антибиотика (гентамици-на). Подкожно в область шва вводили 2% раствор лидокаина для послеоперационного обезболивания. Внутривенно вводили 1 мл физиологического раствора для предупреждения
обезвоживания. Ложно-оперированным животным проводили все вышеописанные манипуляции, кроме установки филамента. Введение ЛХТ-317 осуществляли внутривенно через установленный в хвостовую артерию катетер G24 при помощи электронного программируемого двухканального инжектора производства «Kent Scientific» (США) за 15 мин до окклюзии мозговой артерии («профилактический режим») или через 60 мин после реперфузии мозговой артерии («терапевтический режим») в дозе 25 мг/кг. Образцы крови для определения плазменного уровня глутаминовой кислоты забирали через венозный катетер, установленный в хвостовую вену и фиксированный на спине животного перед воспроизведением патологического процесса, а также через 1, 2 и 3 часа после реперфузии артерии в объеме 0,2 мл, восполняемом внутривенным введением 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Морфологическое определение размеров зоны некроза головного мозга проводили через 1 сутки (по 6 животных в группе) и через 7 сут (по 6 животных в группе) после постановки эксперимента. Определение концентрации глу-таминовой кислоты осуществляли по вышеописанной методике. Оценку степени поражения головного мозга проводили индикаторным методом. Срезы головного мозга (ипсилатерально-го полушария) окрашивали в 2% растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ «Sigma-Aldrich», Германия) в фосфатном буфере. В дальнейшем срезы головного мозга крыс фотографировали цветной видеокамерой CCD IRIS (модель DXC-107AP, SONY, Япония), соединенной с микроскопом (Olympus SZ-CTV, Япония). Каждый срез мозга обрабатывался автоматически с помощью программы «Image J» (National Institute of Health, США). Для расчета объема некроза использовали формулу, учитывающую вклад отека мозга в размер очага поражения. Сенсомотор-ную активность животных оценивали через 7 сут эксперимента с использованием установки «Тест цилиндр» с системой видеорегистрации ООО «НПК Открытая наука» (Санкт-Петербург). Тест «Цилиндр» использовали для выявления асимметрии использования передних конечностей, при одностороннем повреждении сенсо-моторной коры головного мозга крысы. Рассчитывали коэффициент латеральности.
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики [1], использовали параметрический
(Ньюмена-Кейлса) критерий. Нормальность распределения определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа. Использовали пакет программ по статистике BioStat.
Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследования изучили влияние ЛХТ-317 на концентрацию основного медиатора экстайто-токсичности - глутаминовой кислоты в плазме крови. Полученные результаты представлены в табл. 1. В группе животных интактного контроля концентрация глутаминовой кислоты колебалась в диапазоне в среднем от 150 до 163 мкМ/л, не образуя пиковых значений на протяжении суточного наблюдения. Внутривенное однократное введение животным глутаминовой кислоты в дозе 0,015 мг/кг сопровождалось кратковременным ростом её плазменной концентрации до 197 мкМ/л в среднем в течение первого часа наблюдения с последующей нормализацией концентрации уже ко второму часу опыта. При внутривенном введении соединение ЛХТ-317 эффективно снижало концентрацию глутаминовой кислоты в плазме крови. При увеличении дозы соединения с 25 до 50 мг/кг не было выявлено зависимости «доза-эффект». Повторное введение вещества в дозе 25 мг/кг через 1 час после первой инъекции также не сопровождается существенным ростом активности соединения. На основании этого, доза 25 мг/кг при однократном режиме введения была установлена как оптимальная для снижения уровня глутаминовой кислоты в крови и использована в экспериментах по подтверждению ее эффективности в модели ишеми-ческого поражения головного мозга у животных.
Динамика концентрации глутаминовой кислоты (мкМ/л) в крови животных на фоне внутривенного введения ЛХТ-317
№ п/п Фармакологический агент Доза, мг/кг Время регистрации уровня глутаминовой кислоты
Исход 1 ч 2 ч 4 ч 6 ч 24 ч
1. Интактный контроль - 158±7 154±12 150±21 163±8 169±14 151±13
2. Глутаминовая кислота (Контроль К) 0,015 149±9 197±8# 167±11 152±10 144±17 160±10
3. ЛХТ-317 25 156±12 124±12* 96±10* 74±13* 150±12 152±11
4. 25x2 152±7 120±11* 88±7* 69±10* 128±11 153±9
5. 50 149±11 122±9* 94±8* 89±6* 138±16 155±10
Примечание: # - различия при сравнении с интактным контролем статистически значимы при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса); * - различия при сравнении с контролем К статистически значимы при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса)
При подкожном введении ЛХТ-317 в диапазоне доз от 50 мг/кг до 100 мг/кг не наблюдали значимого эффекта по снижению уровня глутаминовой кислоты. Лишь в максимальной вводимой дозе - 150 мг/кг - вещество снижало концентрацию медиатора эксайтотоксичности через 1 ч после внутривенного введения. Полученные результаты позволили нам заключить, что подкожный путь введения является неэффективным для достижения терапевтического эффекта ЛХТ-317 и малоперспективным для дальнейшего исследования на моделях ишеми-ческого повреждения головного мозга при однократном введении.
Нейропротекторную активность соединения ЛХТ-317 при различных режимах введения выявляли на модели ишемии-реперфузии головного мозга на основании исследования динамики уровня глутаминовой кислоты в плазме крови у животных (табл. 2), а также на основе оценки объема поражения головного мозга, измеряемого через 1 сутки и 7 суток после ишемического / реперфузионного повреждения (табл. 3).
Формирование фокальной ишемии головного мозга сопровождается тенденцией к росту уровня глутаминовой кислоты, тогда как ре-перфузия средней мозговой артерии приводит к значительному увеличению концентрации глутамата, через 1 и 2 часа после восстановления мозгового кровотока. При этом, уже к 3 часу наблюдения концентрация глутаминовой кислоты в крови принимает исходные значения (табл. 2).
Профилактическое внутривенное введение ЛХТ-317 в дозе 25 мг/кг предотвращает рост концентрации глутаминовой кислоты у животных с нарушением мозгового кровообращения, о чем свидетельствуют сниженные при сравнении с контрольной группой животных уровни нейромедиатора в крови (табл. 2). Внутривенное введение животным с преходящей ишемией головного мозга исследуемого вещества в дозе 25 мг/кг сразу же после восстановления мозгового кровотока сопровождалось снижением уровня глу-таминовой кислоты в образцах крови, забранных у животных
Таблица 1
10иККЛЬ ОБ ОТШ МЕБТСЛЬ ТЕСЫШШСТЕ8 - 2018 - V. 25, № 3 - Р. 58-63
через 2 и 3 часа после реканализации средней таты (табл. 3). мозговой артерии.
Таблица 2
Динамика концентрации глутаминовой кислоты (мкМ/л) в крови животных с ишемией и реперфузией головного мозга на фоне внутривенного введения ЛХТ-317 при различных режимах введения
№ п/п Фармакологический агент Доза, мг/кг Время регистрации уровня глутаминовой кислоты
Исход Окклюзия 1 ч 2 ч 3 ч
1. Контроль - 157±8 169±10 184±9 179±11 144±17
2. ЛХТ-317 профил. 25 151±5 164±15 94±7* 127±12* 147±15
5. ЛХТ-317 тер. 25 152±10 166±13 157±12 110±10* 134±17
Примечание: профил. - профилактическое введение вещества до формирования ишемии головного мозга, тер. - введение фармакологического агента сразу же после восстановления мозгового кровотока; * - различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса)
Рис. 1. Значения коэффициентов латерально-сти (Ы±БП), рассчитанных для животных в исследуемых группах на 7 сутки после формирования ишемии головного мозга
Таблица 3
На 7-е сутки после окклюзии-реперфузии средней мозговой артерии произвели исследования сенсомоторной активности животных контрольной и опытных групп в «Тесте цилиндр». С помощью системы видеорегистрации вертикальной двигательной активности, было подсчитано общее время прикосновения верхними конечностями стенок цилиндра, а также время, затраченное животным на касание цилиндра лишь одной, непораженной двигательным нарушением, лапой. Был вычислен коэффициент латеральности, свидетельствующий о глубине сенсомоторных нарушений как результата нарушения мозгового кровообращения (рис. 1). В контрольной группе животных значение коэффициента приближалось к 1, свидетельствуя о глубоком нарушении моторной функции одной из верхних конечностей. Внутривенное введение ЛХТ-317 в дозе 25 мг/кг, как в профилактическом режиме, так и после ре-перфузии мозговой артерии приводит к формированию более мягкого сенсомоторного дефицита, что косвенно может свидетельствовать о более легком поражении головного мозга при ишемически-реперфузионном синдроме. Вместе с тем, обращает на себя внимание тот факт, что наименьшее значение коэффициент принимал в группе животных, получавших вещество в профилактическом режиме.
При оценке глубины поражение ипсилате-рального полушария головного мозга крысы при ишемическом процессе и последующей реперфузии были получены следующие резуль-
Показатели объема поражения ипсилате-рального полушария головного мозга при интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии и ее последующей ре-перфузии у животных опытных и контрольной групп (по 6 животных в каждой группе на 1-е и 7-е сутки опыта, в % к общему объему полушария)
№ п/п Фармакологическое воздействие Время измерения
1 сут. 7 сут.
1 Контроль 98±2 69±4
3 ЛХТ 317, 25 мг/кг профил. 63±3* 34±2*
5 ЛХТ-317 25 мг/кг тер. 72±4* 48±3*#
Примечание: * - различия статистически достоверны при сравнении с соответствующим контролем (на 1 сутки, на 7 сутки) при р<0,05; # - различия статистически достоверны при сравнении с группой животных, получавших вещество в профилактическом режиме (на 7 сутки) при р<0,05 (одномерный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена-Кейлса)
При проведении морфологических исследований головного мозга крыс, перенесших окклюзию средней мозговой артерии с ее последующей реперфузией, установлено, что каждое исследуемое фармакологическое воздействие (в профилактическом или терапевтическом режиме) сопровождается снижением объема поражения тканей мозга при сравнении с контрольной группой животных. Наименьший размер некроза установлен при профилактическом введении соединения ЛХТ-317 при оценке состояния головного мозга на 7 сутки после фармакологического воздействия.
Выводы. Полученные результаты указывают на то, что соединение ЛХТ-317 обладает выраженным церебропротективным эффектом при ишемическом повреждении тканей головного мозга, способствует уменьшению сим-
птомов ишемического инсульта, ускоряет восстановление нарушенных функций головного мозга. В основе фармакологического действия
соединения может лежать способность снижать концентрацию глутаминовой кислоты как основного медиатора эксайтотоксичности.
BRAIN-PROTECTIVE ACTIVITY OF MAGNESIUM-CONTAINING COMPOUND OF AN ORGANIC ACID
E.V. SEMELEVA, I.A. GROMOVA, E.V. BLINOVA, M.M. GERASKINA, D.S. BLINOV, L.V. VANKOVA,
A.V. NOVIKOV, A.N. CHUDAJKIN
National Research Ogarev Mordovia State University, 430005, Bolshevistskaya Str., 68, Saransk, Russia,
e-mail: [email protected]
Abstract. The study was conducted in 30 white both sex rats 180-220 g of weight and 36 white male rats 350-400 g of weight with transition ischemic and reperfusion brain injury. We investigated pharmacological brain-protective property of novel magnesium-containing compound of amino-ethane-sulfonic acid (laboratory name LHT-317) as a substance. The substance being introduced at a dose of 25 and 50 mg/kg iv efficiently decreased glutamate blood concentration in dose independent manner. Subcutaneous injection of the substance didn't impact blood glutamate concentration. In experiments in rats with transient ischemic and reperfusion brain injury 25 mg/kg in LHT-317 in preventive and therapeutic regimens decreased motor deficit and brain necrosis volume with accordance of lowering glutamate serum concentration. The obtained results proved the fact that LHT-317 possessed substantial brain-protective property on model of ischemic / reperfusion injury, minimized experimental stroke symptoms, and propelled recovery of brain dysfunction.
Key words: LHT-317, glutamate, excitotoxicity, ischemic and reperfusion brain injury, motor function, brain necrotic zone.
Литература References
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. 1. Glanc S. Mediko-biologicheskaya statistika [Med-
М.: «Практика», 1999. 467 с. ical and biological statistics]. Moscow: «Praktika»;
1999. Russian.
2. Castillo J., Davalos A., Naveiro J., Noya M. Neu-roexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke // Stroke. 1996. Vol. 27, No. 6. P. 1060-1065.
3. Ferrarese C., Aliprandi A., Tremolizzo L. Increased glutamate in CSF and plasma of patients with HIV dementia // Neurology. 2001. Vol. 57, No. 4. P. 671-675.
2. Castillo J, Davalos A, Naveiro J, Noya M. Neu-roexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke. Stroke. 1996;27(6):1060-5.
3. Ferrarese C, Aliprandi A, Tremolizzo L. Increased glutamate in CSF and plasma of patients with HIV dementia. Neurology. 2001;57(4):671-5.
4. Glutamate release and cerebral blood flow after severe human head injury / Zauner A., Bullock R., Kuta A.J. [et al.] // Acta Neurochir. 2006. Suppl. 67. P. 40-44.
4. Zauner A, Bullock R, Kuta AJ, et al. Glutamate release and cerebral blood flow after severe human head injury // Acta Neurochir. 2006;67:40-4.
5. Graham L.T. Jr, Aprison M.H. Fluorometric determination of aspartate, glutamate, and gamma-aminobutyrate in nerve tissue using enzymic methods // Anal Biochem. 1966. Vol. 15(3). P. 487-497.
6. Heart disease and stroke statistics - 2010 update: a report from the American Heart Association / Lloyd-Jones D., Adams R.J., Brown T.M. [et al.] // Circulation. 2010. Vol. 121, No. 7. P. e46-e215. doi:10.1161/CIRCULATI0NAHA. 109.192667
5. Graham LT Jr, Aprison MH. Fluorometric determination of aspartate, glutamate, and gamma-aminobutyrate in nerve tissue using enzymic methods. Anal Biochem. 1966;15(3):487-97.
6. Lloyd-Jones D, Adams RJ, Brown TM, et al. Heart disease and stroke statistics - 2010 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 2010;121(7):e46-215. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA. 109.192667
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 58-63
7. Johnston M.V., Trescher W.H., Ishida A., Nakaji-ma W. Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain // Pediatr. Res. 2001. Vol. 49, No. 6. P. 735-741.
8. Laurer H.L., Lenzlinger P.M., Mcintosh T.K. Models of traumatic brain injury // Eur. J. Trauma. 2010. Vol. 26. P. 95-100.
9. Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats // Stroke; a journal of cerebral circulation. 1989. Vol. 20, No. 1. P. 84-91.
10. Zhang H., Zhang X., Zhang T., Chen L. Excitatory amino acids in cerebrospinal fluid of patients with acute head injuries // Clin. Chem. 2001. Vol. 47, No. 8. P. 1458-1462.
7. Johnston MV, Trescher WH, Ishida A, Nakajima W. Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain. Pediatr. Res. 2001;49(6):735-41.
8. Laurer HL, Lenzlinger PM, Mcintosh TK. Models of traumatic brain injury. Eur. J. Trauma. 2010;26:95-100.
9. Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 1989;20(1):84-91.
10. Zhang H, Zhang X, Zhang T, Chen L. Excitatory amino acids in cerebrospinal fluid of patients with acute head injuries. Clin. Chem. 2001;47(8):1458-462.
