CC BY
19
ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 615.01
DOI 10.21685/2072-3032-2019-1-9
М. О. Дудина, Е. В. Блинова, И. Я. Моисеева, Е. А. Самышина, М. O. Краско, И. Р. Суслова
К ВОПРОСУ О БЕЗОПАСНОСТИ 4-АЛКИЛ-ЗАМЕЩЕННОГО СО ЕДИНЕНИЯ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ
Аннотация.
Актуальность и цели. Цели исследования: исследовать острую токсичность соединения АХ-554 при внутрижелудочном введении, а также определить его эффективные цитотоксические концентрацию и дозу
Материалы и методы. Исследование выполнено на 76 белых беспородных лабораторных мышах обоего пола весом 18-22 г, 150 мышах-самцах C57Bl/6, культуре опухолевых клеток LCC. Острая токсичность 4-алкил-замещенного соединения АХ-554 в виде гранулята таблеточной массы изучена при внутри-желудочном введении с анализом результатов по Личфилду и Уилкоксону. Эффективная доза вещества определена в сингенной опухолевой модели на мышах-самцах C57Bl/6 с перевитой карциномой легкого Льюис, эффективная концентрация - в культуре опухолевых клеток.
Результаты. Исследование острой токсичности АХ-554 при внутрижелу-дочном введении в виде гранулята таблеточной массы показало, что оно является нетоксичным веществом. В диапазоне доз от 21,2 до 384 мг/кг вещество подавляет рост опухоли у мышей с сингенной карциномой легкого от 20 до 90 %, при этом высшая терапевтическая доза превышает минимально действующую более чем в 18 раз. Полученная закономерность сохраняется и при использовании вещества в культуре опухолевых клеток. Результаты исследования могут быть использованы при создании лекарственного средства на основе соединения АХ-554.
Выводы. Производное 2-амино-4Н-хромена АХ-554 обладает оптимальным профилем безопасности, поскольку является нетоксичным веществом с большой широтой противоопухолевого действия.
Ключевые слова: соединение 2-амино-4Н-хромена, острая токсичность, путь введения, широта противоопухолевого действия, карцинома легкого Льюис.
M. O. Dudina, E. V. Blinova, I. Ya. Moiseeva, E. A. Samyshina, M. O. Krasko, I. R. Suslova
ON A SAFETY OF 4-ALKYL SUBSTITUTED COMPOUND WITH ANTI-TUMOR ACTION
© Дудина М. О., Блинова Е. В., Моисеева И. Я., Самышина Е. А., Краско М. O., Суслова И. Р., 2019. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.Org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
Abstract.
Background. To study the acute toxicity of compound AH-554 after intragastric administration, as well as to determine its effective cytotoxic concentration and dose.
Materials and methods. The study was performed on 76 white outbred laboratory mice of both sexes weighing 18-22 g, 150 C57Bl / 6 male mice, and LCC tumor cell culture. The acute toxicity of 4-alkyl-substituted compound AH-554 as granulate tablet mass was studied after intragastric administration by Lichfield and Wil-coxon. The substance effective dose was determined in C57Bl/6 male mice syngeneic tumor model with inoculated Lewis lung carcinoma. AH-554 effective concentration was evaluated in the tumor cell culture.
Results. The study of acute toxicity of AH-554 as granulate of tablet mass administered intragastrically showed that the compound is non-toxic. In the dose range from 21.2 to 384 mg / kg, the substance inhibits tumor growth in mice with syngeneic lung carcinoma from 20 to 90%, while the highest therapeutic dose exceeds the minimum effective more than 18 times. The resulting pattern is the same when cultivating the substance in the culture of tumor cells. The results of the study can be used to create novel medicine based on the compound AH-554.
Conclusions. The 2-amino-4H-chromene AH-554 derivative has an optimal safety profile, since it is a non-toxic substance with a large range of antitumor action.
Keywords: 2-amino-4H-chromene AH-554 derivative, acute toxicity, route of administration, range of therapeutic action, Lewis lung carcinoma.
Введение
Одним из наиболее существенных обстоятельств, ограничивающих клиническое использование противоопухолевых лекарственных средств, является их высокая токсичность и низкая широта терапевтического действия. Низкая безопасность химиопрепаратов диктует необходимость поиска новых молекул, подходов, позволяющих обеспечивать высокую активность и хорошую переносимость при курсовом введении. Одним из перспективных классов веществ с небольшой прямой цитотоксической активностью, селективно подавляющих синтез структурного онкогена в опухолевых клетках - тубулина-бета класса 3 [1], а также ингибирующих внутриклеточные рецепторные киназы [2], является класс производных 2-амино-4Н-хроменов [3]. В нашей стране была разработана экономически обоснованная химическая технология получения веществ рассматриваемой химической природы с высокой степенью выхода конечного продукта [4]. Одним из достоинств представителей 2-амино-4Н-хроменов является их хорошая биодоступность из желудочно-кишечного тракта, что открывает заманчивые перспективы для создания пероральной лекарственной формы. Цели настоящего исследования: изучить острую токсичность 4-алкил-замещенного соединения класса аминохроменов АХ-554 при внутрижелу-дочном введении, а также определить его эффективные цитотоксические концентрацию и дозу в аспекте анализа безопасности оригинального отечественного вещества.
1. Материалы и методы исследования
Исследование выполнено в соответствии с этическими требованиями к работе с экспериментальными животными - Федеральным законом «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 и приказом Мини-
стерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (введен в действие 01.07.2016) и одобрены Локальным этическим комитетом при ФГБОУ ВО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва». Работа выполнена на 76 белых беспородных лабораторных мышах обоего пола весом 18-22 г, полученных из филиала «Андреевка» Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России, на 150 мышах-самцах C57B1/6, полученных из питомника SPF-лабораторных животных - филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» Российской академии наук (г. Пущино), и в культуре опухолевых клеток LCC.
Использовали гранулят таблеточной массы (готовая лекарственная форма) вещества АХ-554 производства Всесоюзного научного центра по безопасности биологически активных веществ (Россия). В опытах in vivo гранулят вводили животным через зонд G24 в 2 % крахмальном геле. При исследовании в культуре клеток применяли субстанцию соединения (чистота 98,56 %) того же производителя.
Острая токсичность АХ-554 изучена при однократном внутрижелудоч-ном введении беспородным белым лабораторным мышам (по 6 особей обоего пола в группе) в диапазоне доз от 1000 до 7500 мг/кг. Индивидуальный объем вводимой дозы для каждого животного рассчитывался исходя из значения массы тела и корректировался после каждого взвешивания. Наблюдение за животными проводили в течение 14 сут после введения. О токсичности соединений судили по гибели животных и общей картине интоксикации. Расчет показателей ЛД100, ЛД50, а также доверительного интервала проводили методом Личфилда и Уилкоксона в соответствии с действующими методическими рекомендациями [5, 6].
Эффективную дозу вещества определяли на сингенной опухолевой модели - карциноме легкого Льюис (LLC) из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный исследовательский медицинский центр онкологии им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. Модель воспроизводили трехступенчатой перевивкой клеток опухолевого штамма [7]. Эффективную дозу находили в соответствии с международными рекомендациями [8].
Эффективные концентрации фармацевтической субстанции АХ-554 определяли в культуре клеток LLC при 72-часовой инкубации в среде с добавлением АХ-554 в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-3 М на основе анализа содержания лактатдегидрогеназы в среде культивирования методом количественного ИФА с использованием исследовательского диагностического набора ЛДГ-2 производства «Ольвекс Диагностикум» (Россия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием дисперсионного и пробит-анализа [9]. Использовали пакет программ по статистике SPSS.
2. Результаты и обсуждение
При внутрижелудочном введении показатель ЛД50 гранулята таблеточной массы АХ-554 составил 5228 ± 115 мг/кг, следовательно, вещество относится к 4 классу токсичности и опасности - нетоксичным соединениям [10].
Для определения диапазона эффективных противоопухолевых доз АХ-554 были использованы дозы, составляющие 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 и 10 % от показателя ЛД50, определенного при внутрижелудочном введении мышам. Для каждой дозы определяли максимальный противоопухолевый эффект по индексу торможения роста опухоли (ТРО) на 7-е сут после прекращения введения вещества. С помощью построения графика «доза - эффект» (рис. 1) определяли эффективные дозы (effective dose) ЕД20, ЕД50 и ЕД90 - расчетные
дозы, вызывающие торможение роста опухоли на 20, 50 и 90 % соответственно.
ТРО, %
—95,..- -•
49
7 23
• 12
96
10 60 110 160 210 260 310 360 410 460
Доза, мг/кг
Рис. 1. Кривая «доза - эффект» (по значению индекса ТРО на 7-е сут после завершения внутрижелудочного введения АХ-554 в диапазоне доз от 0,25 до 10 % от ЛД50 мышам C57Bl6 с LLC
При вычислении эффективных доз готовой лекарственной формы АХ-554 ЕД2о составила 21,2 мг/кг, ЕД50 составила 137,6 мг/кг, в то время как ЕД90 равнялась 384,0 мг/кг.
Следовательно, для дальнейшего доклинического исследования специфической противоопухолевой активности и механизмов антибластомного действия необходимо использовать следующие дозы: минимально-действующая - 21,2 мг/кг, среднетерапевтическая - 137,6 мг/кг и высшая терапевтическая - 384,0 мг/кг. Поскольку доза 384 мг/кг соответствует 7,68 % от показателя ЛД50, определенного для данного пути введения у мышей, она соответствует условиям, согласно которым высшая терапевтическая доза не должна превышать 10 % от показателя ЛД50 [7].
При расчете терапевтических индексов (ТИ20, ТИ50 или ТИ90 как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз) нами были получены следующие показатели: 94,3; 36,3 и 23,4 соответственно (рис. 2). На основании полученных данных можно судить о широте терапевтического действия исследуемого соединения, в частности, значение высшей терапевтической дозы в 18 раз превышает показатель минимально-действующей дозы.
Исследование эффективных концентраций фармацевтической субстанции АХ-554 определено в культуре клеток карциномы легкого Льюис при их инкубировании в среде с добавлением фармацевтической субстанции АХ-554 в семи концентрациях: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 М. По результатам
in vitro исследований были вычислены показатели ЭК20, ЭК50 и ЭК90 - расчетные концентрации, вызывающие гибель 20, 50 и 90 % клеточной популяции в культуре соответственно (рис. 3, 4).
Отношение соответствующих значений ЛД и ЕД
100 94,3
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Терапевтический индекс ТИ20 SSTM50 nil ТИ90
Рис. 2. Значения терапевтических индексов (ТИ) на 7-е сут после завершения внутрижелудочного введения АХ-554 в диапазоне доз от 0,25 до 10 % от ЛД50 мышам C57Bl6 с LLC
Процент гибели клеток в культуре
100 90 80
70
60 50 40
30
> ____J 20 10 —e—
■9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
Рис. 3. Кривая «концентрация - эффект» (по значению процента гибели клеток культуры LLC при ее 24-часовом инкубировании с фармацевтической субстанцией АХ-554 в диапазоне концентраций от 10-9 до 10-3 М (по оси абсцисс - степень концентрации, М)
При вычислении показателей ЭК20, ЭК50 и ЭК90 нами были получены следующие результаты (рис. 4): 10-8, 2*10-7 и 10-4 М.
Таким образом, диапазон эффективных цитотоксических концентраций в отношении опухолевых клеток карциномы легкого Lewis находится в пределах от 10-9 до 10-4 М, при этом средняя эффективная концентрация составляет 2*10-7 М, что сопоставимо с концентрациями фармацевтической субстанции вещества в плазме крови и легочной ткани при ее внутрижелудочном введении нелинейным мышам в ЕД20, ЕД50 и ЕД90 и внутривенном введении
в ЕД50 в рамках проведения фармакокинетических исследований фармацевтической субстанции.
Рис. 4. Значения показателей эффективных концентраций фармацевтической субстанции АХ-554, определенных по цитотоксическому действию в культуре клеток LLC
Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемое вещество в виде готовой лекарственной формы и фармацевтической субстанции обладает оптимальным профилем безопасности, характеризующимся крайне низкой острой токсичностью, большой широтой терапевтического действия и высокой противоопухолевой активностью в отношении сингенной опухоли легких мышей.
Выводы
1. При исследовании острой токсичности готовой лекарственной формы 4-алкил-замещенного производного 2-амино-4Н-хромена при внутриже-лудочном введении гранулята таблеточной массы установлено, что вещество является нетоксичным.
2. В диапазоне доз от 21,2 до 384 мг/кг и концентраций от 10-9 до 10-4 М АХ-554 подавляет соответственно рост опухоли в модельной системе у мышей и вызывает гибель злокачественных клеток карциномы легкого Льюиса в опытах in vitro от 20 до 90 %.
3. Высшая терапевтическая доза АХ-554 превышает минимально действующую более чем в 18 раз, что свидетельствует о большой широте терапевтического действия вещества.
Библиографический список
1. Seve, P. Is class III beta-tubulin a predictive factor in patients receiving tubulin-binding agents? / P. Seve, C. Dumontet // Lancet Oncol. - 2008. - Vol. 9, № 2. -P. 168-175.
2. 4-Aryl-4H-chromene-3-carbonitrile derivatives: evaluation of Src kinase inhibitory and anticancer activities / A. Fallah-Tafti, R. Tiwari, A. N. Shizari, T. Akbarzadeh, D. Mandel, A. Shafiee et al. // Med. Chem. - 2011. - Vol. 6. - P. 11-22.
3. Patil, S. A. Chromenes: potential new chemotherapeutic agents for cancer / S. A. Patil, R. Patil, L. M. Pfeffer, D. D. Miller // Future Med. Chem. - 2013. - Vol. 5, № 14. - P. 1647-1660.
4. Bardashov, I. N. One-pot synthesis of 4-alkyl-2-amino-4H-chromene derivatives / I. N. Bardashov, A. U. Alekseeva, O. V. Ershov, D. A. Grishanov // Heterocycl. Commun. - 2015. - Vol. 21, № 3. - P. 175-177.
5. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств / Е. В. Арзамасцев, И. В. Березовская, О. Л. Верстакова, Т. А. Гуськова, А. Д. Дурнев // Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / под ред. А. Н. Миронова. - Москва : Гриф и Ко, 2012. -С. 13-51.
6. Animal models in toxicology / еd. by S. C. Gad. - Second ed. - New York : Taylor and Francis, 2007. - 950 p.
7. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Е. М. Трещалина, О. С. Жукова, Г. К. Герасимова и др. // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. I. - Москва : Гриф и Ко, 2012. - С. 640-654.
8. Protocols for screening chemical agents and natural products against tumor and other biological systems / R. I. Geran, N. H. Greenberg, M. M. MacDonald, A. M. Schumacher, B. J. Abbott // Cancer Chemother. Rep. - 1972. - Vol. 3. - P. 1-103.
9. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - Москва : Практика, 1999. - 467 с.
10. Березовская, И. В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения / И. В. Березовская // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 32-34.
References
1. Seve P., Dumontet C. Lancet Oncol. 2008, vol. 9, no. 2, pp. 168-175.
2. Fallah-Tafti A., Tiwari R., Shizari A. N., Akbarzadeh T., Mandel D., Shafiee A. et al. Med. Chem. 2011, vol. 6, pp. 11-22.
3. Patil S. A., Patil R., Pfeffer L. M., Miller D. D. Future Med. Chem. 2013, vol. 5, no. 14, pp. 1647-1660.
4. Bardashov I. N., Alekseeva A. U., Ershov O. V., Grishanov D. A. Heterocycl. Commun. 2015, vol. 21, no. 3, pp. 175-177.
5. Arzamastsev E. V., Berezovskaya I. V., Verstakova O. L., Gus'kova T. A., Durnev A. D. Rukovodstvo po doklinicheskomu izucheniyu lekarstvenykh sredstv [Guidance for preclinical study of drugs]. Moscow: Grif i Ko, 2012, pp. 13-51. [In Russian]
6. Animal models in toxicology. Ed. by S. C. Gad. Second ed. New York: Taylor and Francis, 2007, 950 p.
7. Treshchalina E. M., Zhukova O. S., Gerasimova G. K. et al. Rukovodstvo po provedeni-yu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv. Ch. I. [Guidance for conducting preclinical studies of drugs. Part 1]. Moscow: Grif i Ko, 2012, pp. 640-654. [In Russian]
8. Geran R. I., Greenberg N. H., MacDonald M. M., Schumacher A. M., Abbott B. J.
Cancer Chemother. Rep. 1972, vol. 3, pp. 1-103.
9. Glants S. Mediko-biologicheskaya statistika [Biomedical statistics]. Moscow: Praktika, 1999, 467 p. [In Russian]
10. Berezovskaya I. V. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal [Chemical pharmaceutical journal]. 2003, vol. 37, no. 3, pp. 32-34. [In Russian]
Дудина Марина Олеговна соискатель, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва (Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)
E-mail: [email protected]
Dudina Marina Olegovna Applicant, National Research Mordovia State University (68 Bolshevistskaya street, Saransk, Russia)
Блинова Екатерина Валериевна доктор медицинских наук, доцент, профессор, кафедра факультетской хирургии, заведующий лабораторией специфической фармакологической активности Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва (Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)
E-mail: [email protected]
Blinova Ekaterina Valerievna Doctor of medical sciences, associate professor, professor, sub-department of faculty surgery, head of laboratory specific pharmacological activities of the Center for Advanced Studies of innovative medicines, National Research Mordovia State University (68 Bolshevistskaya street, Saransk, Russia)
Моисеева Инесса Яковлевна доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии, декан лечебного факультета, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)
E-mail: [email protected]
Moiseeva Inessa Yakovlevna Doctor of medical sciences, professor, head of the sub-department of general and clinical pharmacology, dean of the faculty of medicine, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)
Самышина Елена Александровна
кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, лаборатория специфической активности Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва (Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)
E-mail: [email protected]
Samyshina Elena Aleksandrovna Candidate of medical sciences, senior staff scientist, of laboratory specific pharmacological activities of the Center for Advanced Studies of innovative medicines, National Research Mordovia State University (68 Bolshevistskaya street, Saransk, Russia)
Краско Мария Олеговна аспирант, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва (Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)
E-mail: [email protected]
Суслова Ирина Рудольфовна
соискатель, кафедра факультетской хирургии, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва (Россия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)
E-mail: [email protected]
Образец цитирования:
К вопросу о безопасности 4-алкил-замещенного соединения с противоопухолевым действием / М. О. Дудина, Е. В. Блинова, И. Я. Моисеева, Е. А. Самышина, М. O. Краско, И. Р. Суслова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2019. - № 1 (49). -С. 83-91. - DOI 10.21685/2072-3032-2019-1-9.
Krasko Mariya Olegovna Postgraduate student, National Research Mordovia State University (68 Bolshevistskaya street, Saransk, Russia)
Suslova Irina Rudol'fovna
Applicant, sub-department of faculty
surgery, National Research
Mordovia State University
(68 Bolshevistskaya street, Saransk, Russia)
