К МЕТОДИКЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ ИЗ ВОДЫ Текст научной статьи по специальности «Математика»

Чувствительность определения технического карбина 1 мкг, химически чистого карбина 2 мкг, ИФК 10 мкг, превенола (50%) 6 мкг в анализируемом (спектрофотометрируемом) объеме.

Очевидно, наряду с карбином, ИФК и превенолом возможно спектрофотометр ическое определение и других ядохимикатов, имеющих характерные спектры в н-гексановых растворах в ультрафиолетовой области спектра.

ЛИТЕРАТУРА

Клисенко М. А., Лебедева Т. А. Определение малых количеств ядохимикатов в воздухе, продуктах питания, биологических и других средах. Киев, 1964, с. 32; 57; 62; 120. —Jain N. С., Fontan С. R., Kirk Р. L., J. Pharm. (Lond.), 1965, v. 17, p. 362.

Поступила 29/X1I 1967 P.

УДК в 14.777:576.SSI.214(Enterococcus).093.1

К МЕТОДИКЕ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОКОККОВ ИЗ ВОДЫ

Л. Е. Корш, Н. Г. Киченко

Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва

В нашей стране энтерококк как санитарно-показательный организм изучался сравнительно мало; только в последние годы была разработана методика исследования воды на энтерококки и предложены питательные среды для их выделения (Г. П. Калина). К настоящему времени насчитывается довольно значительное количество селективных сред и методов выделения энтерококков из воды.

В связи с работой по унификации методов исследования качества вод, которая проводится в рамках СЭВ (1966), нами были испытаны некоторые методы и среды, предложенные учеными ГДР для выделения энтерококков из воды. Были испытаны жидкая полимиксиновая среда Г. П. Калины и глюкозо-пептонный бульон как первоначальные среды для накопления энтерококков, жидкая и плотная среды КФ, предложенные Kenner с соавторами (1960, 1961), и плотная среда с кристаллическим фиолетовым и ТТХ, разработанная Г. П. Калиной, как подтверждающие среды.

Схема испытаний следующая:

1-й метод. Посев исследуемой воды в нисходящих количествах различных 10-кратных разведений делают в пробирки с глюкозо-пептонным бульоном (по примеру посева на среду Эйкмана) с инкубацией посевов в течение 18—24 часов при 37° и последующим высевом среды из всех засеянных пробирок по 1 мл в пробирки с жидкой средой КФ. Через 18—24 часа инкубации в условиях указанной температуры при наличии энтерококков среда КФ желтеет, что расценивается как положительный результат.

2-й метод. Посев той же пробы воды в тех же количествах производят по тому же принципу, что и в 1-м методе, но в пробирки с жидкой поли-миксиновой щелочной средой Калины и с инкубацией посевов в течение 48 часов при 37° с последующим высевом из всех пробирок через 24 и 48 часов на плотную подтверждающую сахарно-дрожжевую среду Калины. Посев делают в виде штриха на чашку, разделенную на сектора. При положительном результате на подтверждающей среде вырастают колонии, характерные для энтерококков.

С целью проверки элективности испытанных сред этих 2 методов мы провели дополнительные исследования, которые сводились к характеристке наличия энтерококков, выделяемых с подтверждающих сред. Для этого

из каждой пробирки с пожелтевшей средой КФ и из каждого положительного посева с подтверждающей среды Г. П. Калины делали мазок, окрашивали его по Граму, микроскопировали и при наличии грамположительных овальных кокков изучали выделенные чистые штаммы по «тестам Шермена». Испытания показали, что большинство (24 из 36) проб совпадало. В 11 пробах установлена большая чувствительность 1-го метода, когда делали посев из воды на глюкозо-пептонный бульон с пересевом на среду КФ; только в одном случае отмечена большая чувствительность 2-го метода. При наличии энтерококков всегда быстрее проявляется рост их на глюкозо-пептонном бульоне — через 18—20 часов, тогда как на полимиксиновой щелочной среде изменение окраски (в желто-зеленый цвет) и появление мути наступают в большинстве случаев только через 40—48 часов. Такая задержка роста энтерококков на полимиксиновой среде объясняется ее высокой щелочностью, что и подтверждено нами в ряде опытов. В последующем pH среды был снижен до 7,8, что значительно ускоряло рост энтерококков, в результате чего время первого этапа сокращалось до 24—36 часов. Но и это время является несколько более продолжительным, чем при использовании 1-го метода.

Таким образом, приведенные данные говорят о некоторых преимуществах 1-го метода по сравнению со 2-м в отношении как его чувствительности, так и времени анализа. Кроме того, нашими исследованиями подтверждено, что глюкозо-пептонный бульон может одновременно служить средой накопления как для кишечной палочки, так и для энтерококка без заметного угнетения роста одного вида другим. После 18—20-часового одновременного роста энтерококков и кишечной палочки из глюкозо-пептонного бульона мы делали высев на селективные среды для этих микроорганизмов. В результате такого совмещения значительно упрощался и удешевлялся санитарно-бактериологический анализ воды без ущерба для его результатов. В пропись среды КФ входят глицерофосфат натрия и азид натрия, которые являются дефицитными реактивами. Однако исследования, проведенные В. В. Ильиным и В. С. Касторским, Raibaud с соавторами и затем нами, показали, что пропись среды КФ можно изменить без ущерба для ее селективности, исключив глицерофосфат натрия и заменив импортный протеозный пептон и дрожжевой экстракт отечественными.

Для установления селективности сред в отношении выделения энтерококков из воды как в 1-м, так и во 2-м методе мы выделили с подтверждающих сред и идентифицировали по «тестам Шермена» 350 штаммов. Результаты идентификации показали, что все испытанные штаммы, выделенные из воды как в 1-м, так и во 2-м методе, в основном удовлетворяют почти всем «признакам Шермена», за исключением небольшого процента штаммов отклонявшихся от «теста Шермена» по какому-либо одному и редко двум признакам. И все же, несмотря на отсутствие у некоторых изученных штаммов одного и реже двух «признаков Шермена», наличие остальных и характерный вид бактерий в мазках, окрашенных по Граму, указывают на принадлежность этих микроорганизмов к группе энтерококков.

Результаты испытания «признаков Шермена» позволяют нам отнести к наиболее определенным признакам, характеризующим энтерококк, рост его в щелочном бульоне с высоким pH (9,6), рост в 40% желчном бульоне, а также рост при 45°. Следует также согласиться с теми исследователями (Houston; Graham и Bartley; Г. П. Калина), которые полагают, что рост энтерококка в желчном бульоне в виде цепочек, иногда длинных, можно принять как дифференциально-диагностический признак, присоединив его к «тестам Шермена». Таким образом, дополнительные исследования по установлению селективности подтверждающих сред 2 методов путем идентификации выделенных штаммов по «тестам Шермена» позволяют считать обе среды достаточно селективными в отношении энтерококков, а методы ненадежными для выделения их из воды.

С целью установления процентного содержания выделенных из воды энтерококков по их видовой принадлежности было идентифицировано 230

штаммов. Идентификацию проводили по способности к гемолизу, способности разжижать желатину и расти на среде с 0,04% теллуритом калия, редукции 2-3-5-трифенилтетразол хлорида (ТТХ), ферментации некоторых углеводов — арабинозы, раффинозы, сахарозы и сорбита, ферментации маннитаи глицерина. Из всех перечисленных признаков основными при определении принадлежности выделенных штаммов к видам или вариантам группы энтерококков в соответствии с классификацией 1966 г. (Hartman с соавторами) можно считать редукцию ТТХ, способность роста в присутствии 0,04% теллури-та калия, разжижение желатины, ферментацию маннита и сорбита (А. П. Калина). Процентное содержание Str. faecalis и его вариантов по отношению ко всему количеству выделенных энтерококков составляет 72. Часть (3%) штаммов была отнесена нами к нетипируемым. В основном эту группу составили штаммы, ферментирующие сорбит, но не редуцирующие ТТХ и (или) не растущие на среде с теллуритом калия или показывающие обратные отношения. Вместе с тем эти штаммы удовлетворяли «признакам Шермена» и имели характерную морфологию при микроскопировании мазков, окрашенных по Граму.

Параллельно с испытанием жидких сред для определения энтерококков на той же воде были проведены испытания плотных сред с применением мембранных фильтров и использованием азиднатриевой среды Сланеца и Берт-лея (1955, 1957) и сахарно-дрожжевого агара с кристаллическим фиолетовым, ТТХ и полимиксином (Г. П. Калина).

Титры энтерококков на испытанных плотных средах Сланеца и Калины в большинстве проб были одного порядка, но с несколько большей чувствительностью (в пределах одного порядка среды Калины). Вместе с тем выборочная идентификация колоний, снятых с испытанных сред, показала, что через 48 часов инкубации как на среде Сланеца, так и на среде Калины вырастают наряду с энтерококками грамположительные кокки и споровые палочки, правда, в сравнительно небольшом проценте (15—18). Отличить эти колонии по внешнему виду от колоний энтерококков не представляется возможным. Поэтому, хотя метод с применением мембранных фильтров проще и быстрее, он требует еще уточнения и доработки в отношении идентификации выращенных колоний.

Выводы

1. Глюкозо-пептонный бульон является хорошей накопительной средой для культивирования энтерококков с инкубаций посева при 37° в течение 18—24 часов.

2. Полимиксиновая щелочная среда обладает высокими селективными свойствами для энтерококков, но она уступает глюкозо-пептонному бульону по скорости размножения в ней этих микроорганизмов, в связи с чем срок анализа воды с применением последней среды удлиняется на сутки.

3. Сочетание глюкозо-пептонного бульона как накопительной среды и среды КФ в качестве селективной является хорошим и быстрым методом выделения энтерококков из воды (срок 36—40 часов).

4. Метод непосредственного посева воды на плотные среды, предложенные Г. П. Калиной и Сланецем и Бертлеем, требует еще уточнения и доработки в отношении учета и оценки вырастающих колоний.

ЛИТЕРАТУРА

Ильин В. В. .Касторский В. С. Гиг. и сан., 1966, № 5, с. 59. — Калина А. П. Биология и систематика энтерококков. Автореф. дисс. канд. М., 1968. — Калина Г. П. Методы санитарно-бактериологических исследований внешней среды. М., 1966. — Унифицированные методы исследования качества вод. Ч. 4. Методы биологического и микробиологического анализа вод. Раздел 3. М., 1966.— Graham N., Bart-ley Е., J. Hyg. (Lond.), 1939, V. 39, p. 538. — Hartman P., Reinbold G., S a r a s w a t D., Int. J. sistem. Bact., 1966, v. 16, p. 197. — Houston Th., Ulster.

med. J., 1934, v. 3, p. 224. — Kenner В., С 1 а г к Н., К а Ы е г Р., Am. J. publ. Hlth, 1960, v. 50, р. 1553. — I d е m, Appl. Microbiol., 1961, v. 9, р. 15. — R a i b a u d Р., С а u 1 e t M., Galpin I., J. appl. Bact., 1961, v. 24, p. 285.

Поступила 29/X11 1967 г.

Г —-

УДК 616-008.849.5:668.74

НОМОГРАММА РАСЧЕТА СОДЕРЖАНИЯ 3,4-БЕНЗ(А)ПИРЕНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

Е. М. Панов, С.'И. Василов, Б. Н. Манучарьян Кафедра физики Ростовского-на-Дону медицинского института

При обработке спектрограмм, характеризующих концентрацию 3,4-бенз-(а)пирена в растворе, измеряемую люминесцентным методом, приходится прибегать к построению графика, выражающего зависимость интенсивности Ь-свечения раствора от его содержания. На основе геометрических соотношений между элементами графика выводится расчетная формула:

А1

X = С

h, —h2

где х — искомая концентрация 3,4-бенз(а)пирена, с — добавка изменения его концентрации, И1 — пик спектрограммы для исследуемого раствора без добавки, к2 и Л3 — пики для раствора с добавками с и 2с. л/) п

Ввиду того что при оценке концентрации 3,4-бенз(а)пирена в растворе кратность разведения последнего, а также величина используемой навески могут быть различными, в приведенную выше расчетную формулу необходимо ввести поправки и для этих величин, в результате чего она примет следующий вид:

PS

h1n Ah-P

С,

го

где п — кратность разведения раствора, Р — величина навески (в кг).

Формула получилась громоздкой и вычисления искомой концентрации х потребуют за-траты большого количества времени, особенно когда измерения проводятся многократно. Однако процесс вычислений может быть значительно упрощен, если воспользоваться номограммой, которую можно легко и быстро построить. Для вычислений по формулам, подобным тем, которые приведены нами, может быть применена номограмма с 3 равномерными шкалами, построенными на параллельных прямых. Так как в формуле для расчета концентрации содержится 5 переменных величин и 6-я искомая, на каждой шкале должны отсчитываться значения 2 величин. Ввиду того что одни из величин, входящих в формулу, являются множителями, а другие — делителями, одну из шкал (среднюю) строят с направлением отсчета, противоположным 2 другим.

-os

Номограмма для расчета содержания 3,4-бенз(а)пирена.