CC BY
57
МІКРОБІОЛОГІЯ
© Л. Г. Мироненко, Е. Г. Перетятко
УДК 579. 86:579. 252. 2:577. 213. 3(045)
Л. Г. Мироненко, Е. Г. Перетятко
ИЗУЧЕНИЕ ЖЕЛАТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ НА ГЕНЕТИЧЕСКОМ
И ФЕНОТИПИЧЕСКОМ УРОВНЕ У ENTEROCOCCUS,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ ЭКОТОПОВ
ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова
Национальной академии медицинских наук Украины» (г. Харьков)
Работа выполнена в рамках НИР «Вивчення біологічних властивостей мікроорганізмів роду En-terococcus різного походження та удосконалення методів лабораторної діагностики ентерококових інфекцій», № гос. регистрации 0112U000784.
Вступление. Энтерококки относятся к представителям нормальной микрофлоры человека и животных. В последнее время возросла их роль в возникновении нозокомиальных инфекций [1]. Актуальным является изучение факторов, которые обуславливают переход непатогенных вариантов энтерококков в патогенные. К факторам патогенности, вызывающим токсическое повреждение тканей относятся протеазы, цитолизины, гиалуронидаза, липазы. Одним из наиболее изученных факторов Enterococcus faecalis является ген gelE, который кодирует гидролиз желатина, коллагена, казеина и других пептидов и контролируется FSR двухкомпонентной системой, состоящей из четырех генов (fsrA, fsrB, fsrD, and fsrC) [4, 6]. Выработка двух вирулентных факторов: желатиназы (GelE) и сери-новой протеазы (SprE) является кворум - зависимым процессом [7]. В нескольких независимых исследованиях было показано, что наличие гена gelE обуславливает тяжесть системных заболеваний. Mнoгие исследователи показали, что в клинических штаммах E. faecalis, в отличие от штаммов, выделенных от здоровых людей, gelE обнаруживается, по данным разных авторов, в 55 - 100 % случаев [2, 3, 5]. Исследования последних лет показали, что желатиназа играет важную роль в формировании биопленок энтерококков вида faecalis [6]. Однако роль гена gelE E. faecalis до конца не выяснена, менее изученным остается E. faecium [2].
Целью работы было изучение желатиназной активности энтерококков, выделенных из разных экотопов, на фенотипическом и на генетическом уровне.
Объект и методы исследования. Объектом исследований был 41 штамм Enterococcus, из них к виду faecalis относились - 28 штаммов, к виду faecium - 13 штаммов. E. faecalis выделены: от
больных сахарным диабетом с синдромом «диабетическая стопа», из них 10 штаммов - с поверхности трофической язвы, 10 - из кишечника этих больных; от больных острой кишечной инфекцией (ОКИ) из кишечника выделено 4 штамма, от здоровых лиц из кишечника- 4 штамма. Е. faecium были изолированы из кишечника больных острой кишечной инфекцией -6 штаммов, из кишечника здоровых лиц - 7 штаммов.
Изучение желатиназной активности проводили на среде, содержащей 1 % казеина, путем внесения в лунки диаметром 5-7 мм густой суспензии изучаемых штаммов энтерококков.
Детекцию гена патогенности де1Е энтерококков проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на базе лаборатории медицинской микробиологии с Музеем патогенных для человека микроорганизмов ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского НАМН Украины ».
Бактериальную ДНК для проведения ПЦР-анализа выделяли из суточной культуры энтерококков, для этого использовался коммерческий набор «ДНК-сорб АМ» («Ампли Сенс», Россия). Для детекции де1Е использовали систему праймеров Vankerckhoven е1 а1.:
5ГТАТОАСААТОСТТТТТОООАТ3Г и 5ГАОАТОСАСССОАААТААТАТА3Г!
размер продуктов амплификации составляет 213 п. н. [3]. ПЦР проводили в объеме 50 мкл на амплификаторе, программируемом «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Реакционная смесь имела следующие компоненты: 20 тМ Тпв НС1 (pH 8,3), 2,5 тМ МдС12, 2,5 от Тад-полимеразы («Ампли Сенс», Россия), по 0,1 мкм праймеров де1Е и 5 мкл бактериальной суспензии. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация при температуре 95 °С - 15 мин., 30 циклов денатурации при температуре 94 °С - 1 мин.; отжиг при 56 °С - 1 мин.; элонгация при температуре 72 °С - 1 мин. В последнем цикле амплификации этап элонгации при температуре 72 °С продолжался 10 мин.
Таблица
Изучение желатиназной активности и наличия гена gelE у энтерококков
Вид энтеро- кокков Количество Количество желатиназо-положительных штаммов Количество штаммов, имеющих ген де1Е
абс. М ± т % абс. М ± т %
Б. faecalis 28 18 64,3 ± 9,1 23 82,1 ± 7,2
Б. faecium 13 1 7,7 ± 7,4 5 38,5 ± 13,5
ВСЕГО 41 19 46,3 ± 7,8 28 68,3 ± 7,3
Продукты амплификации разделяли в 1,5 % агарозном геле, окрашенном раствором бромистого ети-дия, визуализировали в ультрафиолетовом свете и фотографировали.
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследований по изучению желатиназной активности на фенотипическом и генетическом уровнях представлены в таблице.
Как видно из таблицы, из 41 штамма изученных энтерококков 28 штаммов (68,3 %) имели ген gelE. На рисунке представлен пример электрофоре-граммы продуктов амплификации ДНК фрагмента генов gelE, asa1, esp, cylA, hyl E. faecalis. Фенотипические проявления желатиназной активности наблюдались у 19 из 41 штаммов (46,3 %), остальные характеризовались «молчащим» геном.
При сравнении патогенотипа по гену gelE у энтерококков, принадлежащих к разным видам, установлено, что наличие штаммов E. faecalis, содержащих ген gelE, достоверно больше, чем штаммов E. faecium, 82,1 % против 38,5 % соответственно. Количество штаммов E. faecalis, характеризующихся экспрессией гена gelE, что выражалось продукцией желатиназы, составляло 18 (78,3 %), что также было достоверно больше, чем штаммов E. faecium, число которых равнялось 1 (20,0 %) (р<0,05).
Аналогичные результаты были получены польскими учеными, согласно их данным количество
штаммов E. faecalis, содержащих ген gelE составило 91 %, из них с «молчащим» геном - 53 % [6]. Другие исследователи в своих работах отмечали фенотипические проявления желатиназной активности у 56 % и 59 % штаммов, при этом наличие гена gelE было обнаружено у 88 % и 92 % соответственно [6, 7]. На современном этапе изучения этого явления, ученые ищут причины отсутствия экспрессии гена gelE при наличии его и FSR двухкомпонентной системы, некоторые исследователи объясняют желатиназо-не-гативный фенотип энтерококков накоплением мутаций в гене fsrC [7].
Нами были проанализированы патофенотипы и патогенотипы по гену gelE разных видов энтерококков в зависимости от экотопа их выделения. Было установлено, что среди штаммов E. faecalis, изолированных с поверхности трофических язв от больных сахарным диабетом, 9 штаммов содержали в геноме ген gelE, что составило 90 % от всех культур. При этом у 3 (33,3 %) штаммов не обнаружили фенотипических проявлений продукции желатиназы. Среди штаммов, выделенных из кишечника тех же больных, 6 штаммов имели ген gelE, что составило 60,0 %, из них 1 (16,7 %) штамм с «молчащим» геном. У всех штаммов E. faecalis, выделенных из кишечника больных с ОКИ и здоровых лиц, обнаружен ген gelE, при этом фенотипических проявлений не было у одного штамма, выделенного от здорового.
Анализируя результаты, полученные при изучении E. faecium, следует отметить, что число штаммов с наличием гена gelE среди штаммов, выделенных из кишечника больных с ОКИ, составляет 4 (66,7 %), при этом с желатиназо-позитивным фенотипом выявлен один штамм. Среди 7 штаммов E. faecium, изолированных из кишечника здоровых лиц, выявлен один штамм с наличием гена gelE (14,3 %) и с желатиназо-негативным фенотипом. Резюмируя полученные данные, следует отметить, что количество штаммов с «молчащим» геном достоверно выше среди E. faecium, чем среди E. faecalis и составляет 80,0 % против 21,7 % (р<0,05).
Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о наличии гена gelE в клинических штаммах энтерококков не только у E. faecalis, но и у E. faecium. Установлено, что из изученных в данном исследовании штаммов, количество E. faecalis, содержащих ген gelE, составило 80,0 %, среди них штаммов с желатиназо-позитивным фенотипом было 78,3 %. Число штаммов E. faeci-um с наличием гена gelE было достоверно меньше и составило 38,5 %, при
Рис. Пример электрофореграммы продуктов амплификации ДНК фрагмента генов gelE, asa1, esp, cylA, Ьу1 Б. faecalis (1 и 10 - маркер молекулярной массы, 2 - 9 - клинические штаммы).
этом штаммов с желатиназо-позитивным феноти- Перспективы дальнейших исследований.
пом выявлено 20,0 % (p<0,05). Считаем целесообразным продолжить исследова-
При оценке этиопатогенетической значимости ния в данном направлении и изучить на фенотипи-
ческом и генетическом уровне желатиназную актив-
энтерококков, выделенных из нестерильных экото-
ность штаммов энтерококков, выделенных из других пов, на наш взгляд, недостаточным является опре- экотопов. Учитывая малоизученность желатиназной
деление гена gelE, необходимо учитывать феноти- активности E. faecium, акцентировать внимание на
пические проявления желатиназной активности. изучении этого вида энтерококков.
Литература
1. Arias C. A. Management of multidrug-resistant enterococcal infections / C. A Arias, G. A. Contreras, B. E. Murray // Clin. Microbiol. Infect. - 2010. - Vol. 16. - P. 555-562.
2. Bills^m H. The Virulence and antimicrobial resistance in clinical Enterococcus faecium / H. Bills^m // Int. J. Antimicrob. Agents. - 2008. - Vol. 32(5). - P. 374-377.
3. Development of a multiplex PCR for the detection of asal, gelE, cylA, esp, and hyl genes in enterococci and survey for virulence determinants among European hospital isolates of Enterococcus faecium / V. Vankerckhoven, T. van Autgaerden, C. Vael [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2004. - № 42(10). - P. 4473-4479.
4. Diversity of the fsr-gelE Region of the Enterococcus faecalis Genome but Conservation in Strains with Partial Deletions of the fsr Operon / R. J. Galloway-Peсa, A. Bourgogne, X. Qin [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - Vol. 77, № 2. -P. 442-451.
5. Giridhara P. M. Comparative study for the presence of enterococcal virulence factors gelatinase, hemolysin and biofilm among clinical and commensal isolates of enterococcus faecalis / P. M. Giridhara B. L. Umapathy, K. L. Ravikumar // J. Lab. Physicians. - 2010. - № 2(2). - P. 100-104.
6. Strzelecki Y Gelatinase-Associated Phenotypes and Genotypes Among Clinical Isolates of Enterococcus faecalis in Poland / Y Strzelecki, W. Hryniewicz, E. Sadowy //Polish Journal of Microbiology. - 2011. - Vol. 60, № 4. - P. 287-292.
7. Teixeira N. The incongruent gelatinase genotype and phenotype in Enterococcus faecalis are due to shutting off the ability to respond to the gelatinase biosynthesis-activating pheromone (GBAP) quorum-sensing signal / N. Teixeira, S. Santos, P. Hancock //Microbiology. - 2012. - № 158. - P. 519-528.
УДК 579. 86:579. 252. 2:577. 213. 3(045)
ВИВЧЕННЯ ЖЕЛАТИНАЗНОЇ АКТИВНОСТІ НА ГЕНЕТИЧНОМУ І ФЕНОТИПІЧНОМУ РІВНІ У ENTEROCOCCUS, ВИДІЛЕНИХ З РІЗНИХ ЕКОТОПІВ
Мироненко Л. Г., Перетятко О. Г.
Резюме. У роботі наведено дані вивчення желатіназної активності і визначення наявності гена gelE методом ПЛР Встановлена наявність гену gelE в клінічних штамах ентерококів не лише в E. faecalis, але і в E. faecium. Кількість E. faecalis, що містять ген gelE, складало 80,0 %, серед них штамів з желатиназо-позитив-ним фенотипом було 78,3 %. Число штамів E. faecium з наявністю гена gelE було достовірно менше і складало 38,5 %, при цьому штамів з желатиназо-позитивним фенотипом виявлено 20,0 % (p<0,05).
Ключові слова: ентерококи, E. faecalis, E. faecium, gelE, ПЛР желатиназна активність.
УДК 579. 86:579. 252. 2:577. 213. 3(045)
ИЗУЧЕНИЕ ЖЕЛАТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ НА ГЕНЕТИЧЕСКОМ И ФЕНОТИПИЧЕСКОМ УРОВНЕ У ENTEROCOCCUS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ ЭКОТОПОВ
Мироненко Л. Г., Перетятко Е. Г.
Резюме. В работе приведены данные изучения желатиназной активности и определения наличия гена gelE методом ПЦР Установлено наличие гена gelE в клинических штаммах энтерококков не только у E. faecalis, но и у E. faecium. Количество E. faecalis, содержащих ген gelE, составило 80,0 %, среди них штаммов с желатиназо-позитивным фенотипом было 78,3 %. Число штаммов E. faecium с наличием гена gelE было достоверно меньше и составило 38,5 %, при этом штаммов с желатиназо-позитивным фенотипом выявлено 20,0 % (p<0,05).
Ключевые слова: энтерококки, E. faecalis, E. faecium, gelE, ПЦР, желатиназная активность.
UDC 579. 86:579. 252. 2:577. 213. 3(045)
Gelatinase Phenotypes and Genotypes among of Enterococcus, Isolated From Different Ecotopes
Myronenko L. G., Peretyatko O. G.
Abstract. Enterococci are include to the normal microflora of human and animals. Recently, increased their role in the occurrence of nosocomial infections. It is important to study the factors causing the transition of non-pathogenic variants enterococci into pathogenic. One of the factors pathogenicity is gelatinase activity enterococci, which is encoded the genome gelE and regulated by the FSR of two-component system which consisting of four genes (fsrA, fsrB, fsrD and fsrC).
In the present study we investigated the phenotypic of gelatinase activity and detection of gelE of enterococci that were allocated from different ecotopes.
The object of the research was 41 strain Enterococcus, of them to E. faecalis treated - 28 strains, to E. faecium - 13 strains. Strains isolated from trophic ulcers and bowel of patients with diabetes mellitus, from the intestine of patients with acute intestinal infection and healthy persons.
The study gelatinase activity conducted on a medium containing 1 % casein. The presence of gelE was determined by polymerase chain reaction (PCR) with primers described by Vankerckhoven et al. [Vankerckhoven et al., 2004]: 5^TATGACAATGCTTTTTGGGAT^ and 5ґ- AGATGCACCCGAAATAATATA -3ґ.
Each 50-ці PCR mixture consisted of 5 ці of bacterial suspension; a 0,1 ц№1 concentration (each) of primers specific for gelE; 25 ці of HotStarTaq master mixture, which consisted of 2Q mM Tris HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgCl2, 2,5 U of HotStarTaq DNA polymerase. An initial activation step at 95°C for 15 min, during which the HotStarTaq DNA polymerase is activated, was followed by 30 cycles of denaturation (94°C for 1 min), annealing (56°C for 1 min), and extension (72°C for 1 min), followed by one cycle consisting of 10 min at 72°C. After amplification, 25 ці of the am-plicon was mixed with 5 ці of gel loading buffer (50 % glycerol, 0,8 mg of bromophenol blue per ml) and electropho-resed in a 1,5 % pronarose D1 gel for 1 h at 150 V in 0,5Ч TBE (Tris-borate-EDTA) containing 0,05 mg of ethidium bromide per liter (positive and negative controls were included in each set of amplifications). A 100-bp DNA ladder was used as a molecular size marker
We tested 41 Enterococcus strains for the presence of one virulence factors. The genes gelE were not detected. Of all 41 (E. faecalis and E. faecium) strains, 28 (68,3 %) were positive for gelE, whereas the gelatinase activity was found in 46,3%.
The gelE gene was found in 23 of 28 (82,1 %) of the E. faecalis isolates, whereas it was found in 5 of 13 (38,5 %) of the E. faecium isolates (P < 0,05).
The gelatinase-positive phenotype was found in 18 of 23 (78,3 %) of the E. faecalis isolates, whereas it was found in 1 of 5 (20,0 %) of the E. faecium isolates (P < 0,05).
The gelE gene was common among E. faecalis isolates from of trophic ulcers in diabetes in 9 of 10 (90 %) and from rectum in 6 of 10 (60,0 %), whereas the gelatinase activity was found in 6 of 9 (66,7 %) and in 5 of 6 (83,3 %) of the E. faecalis isolates, respectively.
The gelE gene was common among E. faecium clinical isolates from rectum in 4 of 6 (66,7 %), whereas the gelatinase activity was found in 1 of 4 (25,0 %) and in 5 of 6 (83,3 %) of the E. faecalis isolates, respectively. Among E. faecium isolates from rectum of human health, gelE was detected in one tested isolates.
In conclusion, the PCR developed and described herein is a convenient and rapid method for the simultaneous detection of potential virulence genes gelE in enterococci. This raises interesting future prospects for further investigating the role of gelE in the biology of Enterococcus.
Key words: enterococci, E. faecalis, E. faecium, gelE, PCR, gelatinase activity.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надійшла 22. 11. 2013 р.
