CC BY
121
© Мироненко Л. Г., Перетятко Е. Г. УДК 615. 015. 8:616-078 Мироненко Л. Г., Перетятко Е. Г.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ
МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА ЕШегососсив ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова Национальной академии медицинских наук Украины» (г. Харьков)
Работа выполнена в рамках договора НН/2/2013 «Пщтримання та розвиток фт1алу Музею-Депозита-рю патогенних для людини мкрооргаызм1в».
Вступление. Энтерококки являются представителями нормальной микрофлоры человека, популяционный уровень их в толстом кишечнике составляет 106-108 жизнеспособных клеток в 1 грамме фекалий [6]. В последнее время возросла роль этих микроорганизмов в возникновении гнойно-септических и внутрибольничных инфекций. Основными нозологическими формами, при которых выделяют энтерококки, являются инфекции мочевыводящих путей, затем следуют раневые и интраабдоминальные инфекции, далее - ангиогенные инфекции [3, 4, 5]. Несмотря на это данные об этиопатогенетической значимости микроорганизмов рода ЕМвюсоссиз в патологии человека крайне ограничены. Пересмотру оценки роли энтерококков в патогенезе энтерококковых инфекций способствовало обнаружение у них факторов патогенности [7, 8]. Однако этот вопрос является не до конца изученным. Основным аргументом в пользу их патогенетической роли является высокая частота обнаружения генов патогенности у штаммов, выделенных при инфекционных процессах, и практически полное отсутствие у штаммов, выделенных из кишечника здоровых лиц и из окружающей среды. В связи с этим актуальными являются исследования по изучению биологических свойств, в том числе факторов патогенности, клинических штаммов энтерококков, выделенных из разных экотопов. Немаловажное значение имеет создание коллекции актуальных штаммов энтерококков для дальнейшего их использования в научных исследованиях.
До 2005 года коллекция микроорганизмов рода ЕпЮгососсиэ Музея микроорганизмов ГУ «ИМИ им. И. И. Мечникова НАМН Украины» была представлена тремя штаммами Е. faecalis, находящимися на хранении с 1955 года. С 2006 года коллекция пополнилась актуальными штаммами и сейчас насчитывает 53 штамма.
Целью работы явилась проверка жизнеспособности и проведение патофенотипирования музейных штаммов микроорганизмов рода Eпterococcus, находящихся на длительном хранении в лиофилизиро-ванном состоянии.
Объект и методы исследования. Объектами исследования были 45 музейных штаммов Eпterococcus, выделенных из разных экотопов: из
толстого кишечника здоровых детей - 7; из толстого кишечника детей с острой кишечной инфекцией (ОКИ) - 13; из содержимого трофических язв у больных сахарным диабетом с синдромом «диабетическая стопа» - 14; из толстого кишечника этих же больных - 11. Распределение энтерококков по видовой принадлежности согласно данным паспортов штаммов представлено на рис. 1.
Культуры хранились в лиофилизированном состоянии при температуре 6-8 оС. Для проведения исследований содержимое ампул суспендировали в сахарном бульоне и высевали на энтерококкагар (Оболенск), посевы инкубировали 48 часов при температуре 37 оС. Для проверки стабильности биохимических свойств использовали EN-COCCUStest производства PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехия. В рамках исследования определяли адгезивную, жела-тиназную, казеиназную и гемолитическую активности энтерококков [1, 2, 4]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel 2007, «Biostat-4».
Результаты исследований и их обсуждение.
В ходе исследования установлено, что все, взятые в опыт лиофилизированные образцы Enterococcus были жизнеспособными. Для установления соответствия первичным характеристикам были изучены биохимические свойства энтерококков и проведена их видовая идентификация. Анализ результатов показал соответствие биохимических свойств исследуемых энтерококков исходному фенотипу, указанному в паспортах штаммов (рис. 1
Рис. 1. Распределение энтерококков по видовой принадлежности.
1 группа 2 группа з группа 4 группа
ЕЗ желатиназная активность Вказеиназная активность □ гемолитическая активность
Рис. 2. Пенентрантность желатиназной, казеиназной и гемолитической активностей энтерококков.
Примечание: 1 группа - штаммы, выделенные из кишечника здоровых детей; 2 группа - штаммы, выделенные из кишечника детей с ОКИ; 3 группа - штаммы, выделенные из кишечника у больных сахарным диабетом; 4 группа - штаммы, выделенные из трофических язв у больных сахарным диабетом.
Следует отметить, что доминирующими среди изученных нами штаммов энтерококков были виды E. faecalis и E. faecium, с меньшей частотой встречались другие виды, а именно: E. mundtii, E. cecorum, E. avium, E. raffinossus, E. durans. При этом из кишечника здоровых детей выделены E. faecalis, E. faecium, а также E. avium и E. raffinossus. Видовой состав энтерококков, выделенных от детей с ОКИ, представлен E. faecalis, E. faecium, E. mundtii, E. cecorum. Среди энтерококков, выделенных из толстого кишечника у больных сахарным диабетом, идентифицированы виды E. faecalis, E. faecium, E. raffinossus, E. durans. Штаммы, выделенные из трофических язв у больных сахарным диабетом, представлены видом faecalis.
Следующим этапом нашей работы было определение факторов патогенности у музейных энтерококков и проведение сравнительного анализа патогенного потенциала штаммов в зависимости от экотопа их выделения.
Установлено, что все взятые в опыт штаммы характеризовались адгезивной активностью, при этом экспрессивность ее зависела от экотопа ве-гетирования энтерококков. Следует отметить, что высокими адгезивными свойствами характеризовались штаммы, выделенные из кишечника детей с ОКИ. Индекс адгезивности (ИАМ) у этих
штаммов составлял (6,7 ± 0,5), что в 1,4 раза превышало аналогичный показатель штаммов, выделенных от здоровых детей (4,7 ± 0,8) (р < 0,05). Высокой степенью адгезивности обладали штаммы, выделенные от больных сахарным диабетом, при этом средний показатель ИАМ у штаммов из трофических язв составлял (10,3 ± 0,4), что в 1,5 раза выше аналогичного показателя кишечных штаммов, выделенных у этих же больных (6,8 ± 0,3) (р < 0,05).
При анализе протеолитической активности энтерококков установлено,что ее пенентрант-ность зависела от наличия воспалительного процесса в экотопе вегетирования штаммов (рис 2). Так, желатиназная и казеиназная активность почти в 2 раза чаще регистрировалась у штаммов, выделенных из кишечника детей с ОКИ и из трофических язв у больных сахарным диабетом, нежели в группах сравнения (р < 0,05). Также в этих группах определена большая экспрессивность казеиназной активности.
При анализе гемолитической активности энтерококков, выделенных из кишечника здоровых детей и детей, больных ОКИ, достоверных различий не выявлено. Следует отметить, что среди энтерококков, изолированных из трофических язв у больных сахарным диабетом, штаммов, обладающих гемолизом, выявлено в 2,6 раз больше, чем среди кишечных штаммов (р < 0,05).
Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что все штаммы энтерококков, находящихся на длительном хранении в лиофилизиро-ванном состоянии были жизнеспособными.
Установлена более выраженная пенентрантность и экспрессивность факторов патогенности (адгезивной, желатиназной, казеиназной и гемолитической активностей) среди штаммов, выделенных из экотопов, характеризующихся наличием гнойно-воспалительного процесса. Проведенные нами исследования позволили дополнить паспорта музейных штаммов микроорганизмов рода Е^вгососсиэ данными их патофенотипирования.
Перспективы дальнейших исследований. Считаем целесообразным продолжить исследования в данном направлении и провести патогенотипиро-вание музейных штаммов энтерококков, выделенных из разных экотопов.
Литература
Брилис В. И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В. И. Брилис // Лабораторное дело. -1986. - № 4. - С. 210 - 212.
Герхардт Ф. Методы общей бактериологии / Ф. Герхардт ; [пер. с англ.]. - М.: Мир, 1984. - Т. 2. - 472 с. Мироненко Л. Г. Видовий склад та антибютикорезистентнють ентерокоюв, ¡зольованих вщ хворих на нейрох1рурпчну патолопю / Л. Г. Мироненко, I. П. Ткачик, О. Г. Перетятко // Лабораторна д1агностика. - 2013. - № 1. - С. 39 - 43. Мироненко Л. Г. Протеол1тична активнють ентерокоюв, вилучених з вмюту троф1чних виразок хворих на цукровий д1абет / Л. Г. Мироненко, О. Г. Перетятко // Лабораторна д1агностика. - 2008. - № 1. - С. 67 - 70.
Сисин Е. И. Возбудители внутрибольничных инфекций: энтерококки / Е. И. Сисин // Уход. - 2013. - № 3. - С. 47-48. Янковский Д. С. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления / Д. С. Янковский. - К. : Эксперт ЛТД, 2005. - 362 с.
М1КР0Б10Л0Г1Я
7. AhrC and Eep Are Biofilm Infection-Associated Virulence Factors in Enterococcus faecalis / Kristi L. F. [et al.] // Infect. Immun. -2013. - Vol. 81, № 5. - P. 1696-1708.
8. Teixeira N. The incongruent gelatinase genotype and phenotype in Enterococcus faecalis are due to shutting off the ability to respond to the gelatinase biosynthesis-activating pheromone (GBAP) quorum-sensing signal / N. Teixeira, S. Santos, P. Hancock // Microbiology. - 2012. - № 158 - P. 519-528.
УДК 615. 015. 8:616-078
Б10Л0Г1ЧН1 ВЛАСТИВ0СТ1 МУЗЕЙНИХ ШТАМ1В М1КР00РГАН13М1В РОДУ Enterococcus Мироненко Л. Г., Перетятко 0. Г.
Резюме. Наведено результати перев1рки життездатносп 45 люфУтзованих зразюв кглычних штам1в MiKpo-opraHi3MiB роду Enterococcus, що знаходяться на збеpеженнi в МузеУ мiкpoopганiзмiв. Пpoаналiзoванo екс-пpесивнiсть та пенентрантнють фaктopiв пaтoгеннoстi (адгезивно!, желатиназноУ, казеУназноУ та гемoлiтичнoi активностей) ентерокоюв у зaлежнoстi вiд екотопу вегетування. Уточнено та доповнено паспорти штaмiв. Ключов1 слова: ентерококи, адгезивна, желатиназна, казеУназна та гемoлiтичнa aктивнoстi.
УДК 615. 015. 8:616-078
БИ0Л0ГИЧЕСКИЕ СВ0ЙСТВА МУЗЕЙНЫХ ШТАММ0В МИКР00РГАНИ3М0В Р0ДА Enterococcus Мироненко Л. Г., Перетятко Е. Г.
Резюме. Приведены результаты проверки жизнеспособности 45 лиофилизированных образцов микроорганизмов рода Enterococcus, выделенных из клинического материала и находящихся на хранении в Музее микроорганизмов. Проанализирована экспрессивность и пенентрантность факторов патогенности (адгезивной, желатиназной, казеиназной и гемолитической активностей) энтерококков в зависимости от экотопа ве-гетирования. Уточнены и дополнены паспорта штаммов.
Ключевые слова: энтерококки, адгезивная, желатиназная, казеиназная и гемолитическая активности.
UDC 615. 015. 8:616-078
Biological Properties of the Microorganisms Museum Strains from the Enterococcus Genus Myronenko L. G., Peretyatko E. G.
Abstract. Enterococci are representatives of the normal human intestinal microflora, but in the recent years the role of these microorganisms increased the causing of the suppurative-septic and nosocomial infections. The main nosological forms, where enterococci are released, are urinary tract infections, wound, intraabdominal and angiogenic infections. In this regard studies on the biological properties including risk factors, clinical strains of enterococci released from different ecotopes are relevant.
The purpose of the study was vitality testing and pathofenotyping of the microorganisms museum strains from the Enterococcus genus, located on the long-term storage at the Microorganisms Museum in the freeze-dried state.
The objects of the study were 45 museum strains of the Enterococcus, released from different ecotopes: from the intestines of the healthy children and children with acute intestinal infections, from the intestines and the lining of the trophic ulcers from patients with diabetes mellitus.
For the research the contents of the vials were suspended in sugar broth and plated on enterokokkagar, platings were incubated 48 hours at the temperature of 37 °C. The reidentification of enterococci was performed using EN - COCCUStest produced by PLIVA - Lachema Diagnostika, Czech Republic. Adhesive, gelatinase, caseinase and hemolytic activities of the enterococci were determined by conventional methods.
Analysis of the results for species identification of the enterococci demonstrated the compliance of the biochemical properties with the original phenotype specified in the strains passport. Dominant among the strains that we study were species E. faecalis (83,1 %) and E. faecium (17,4 %), less frequently occurred other species, namely: E. mundtii (4,3 %), E. cecorum (2,2 %), E. avium (2,2 %), E. raffinossus (4,3 %), E. durans (2,2 %), Enterococcus species (4,3 %). All strains used in the experiment were characterized by adhesive activity, with its expressiveness depended on enterococci vegetation ecotope. The adhesiveness index (AI) for the strains released from children with acute intestinal infections and from trophic ulcers from patients with diabetes mellitus 1,4 - 1,5 times higher than the same value of the strains from the comparison group.
In the analysis of the enterococci proteolytic activity was found that its penentrantce was dependent on the presence of the inflammation in strains vegetation ecotope. Thus, the gelatinase and caseinase activity almost 2 times more often was registered in strains released from intestines of the children with acute intestinal infections and from trophic ulcers from patients with diabetes mellitus, rather than in the comparison group. Also in these groups is determined greater expressiveness of the caseinase activity. Strains having hemolytic activity, were determined 2,6 times greater among the enterococci released from trophic ulcers from patients with diabetes mellitus than among intestinal strains from the same patients (p < 0,05). The results of the conducted studies demonstrate that all strains of enterococci that are on long-term storage in a lyophilized state were viable. Was conducted their pathophenotiping. Was established more evident penentrantce and expressivity of pathogenicity factors among strains isolated from ecotopes characterized by the presence of inflammatory processes.
Keywords: enterococci, adhesive, gelatinase, caseinase and hemolytic activities.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 15. 09. 2014 р.
