CC BY
10
SCIENCE TIME
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНДУКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА ЛАККАЗА
Лебеда Михаил Вячеславович, Марковин Роман Юрьевич, Кузнецова Елизавета Николаевна, Санкт-Петербургский государственный технологический
институт (технический университет),
г. Санкт-Петербург
E-mail: [email protected]
Аннотация. В данной статье рассмотрено влияние трех различных факторов на активность фермента лакказа. Анализ был проведен на базе однофакторного эксперимента по изучению влияния меди и трехфакторного эксперимента типа Ионы меди - Чай - Виноградные гребни.
Ключевые слова: лакказа, Funalia trogii, фермент, активность, индукторы, медь, зеленый чай.
I
Лакказа - медьсодержащая оксидаза, катализирующая окисление широкого ряда фенольных соединений с восстановлением кислорода до воды [1].
В настоящее время данный фермент может найти применение в таких отраслях как: тексильная промышелннность, целлюлозно-бумажная промышленность, пищевая промышленность, область ферментативных биотопливных элементов и очистка воды [2].
Однако для использования фермента в производственных масштабах требуется отработанная технология его производства. Для этого же требуется определить исходное сырье, которое требуется в процессе культивирования.
Для этого нами были проведены эксперименты по изучения влияния различных индукторов фермента.
Первым изучаемым веществом были выбраны ионы меди в составе сульфата меди. Поскольку лакказа является медь содержащим ферментом было предположено, что повышение концентрации меди в составе питательной среды повысит активность.
Вторым и третьим индукторами были виноградные гребни и зеленый чай. Поскольку в них присутствует большое содержание фенольных соединений, которые повышают активность фермента, было также предположено что их добавление положительно скажется на выход фермента
Для подготовки культуры к эксперименту образец из коллекции кафедры ТМС СПБГТИ(ТУ) в пробирке со скошенным агаром был пересеян в колбы Эйленмейлера с керамическими бусами.
1 SCIENCE TIME 1
В качестве объекта исследования были лакказы содержащиеся в культуральной жидкости, полученной в ходе глубинного культивирования штамма гриба-продуцента ГппаНа trogii ТИ035. Культивирование проводилось в лабораторных условиях глубинным методом на глюкозо-пептонной среде (табл.
1) [3].
Таблица 1
Состав питательной среды для глубинного культивирования
Компонент Концентрация, г/л
Глюкоза 10
Пептон 3
КН2РО4 0,6
К2НРО4 0,4
MgSO4 0,5
ZnSO4*7H2O 110-4
FeSO4*7H2O 510-4
Для определения активности в нативном растворе культуральной жидкости использовался спектрофотометрический метод анализа изменения оптической плотности среды вследствие окисления субстрата ферментом, при длине волны 410 нм. Для измерения активности использовался спектрофотометр марки APEL PD-303 (Япония). В качестве хромогенного субстрата используется 0,01 М раствор пирокатехина в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,96. Для его приготовления брали 2.1г лимонной кислоты и 20мл 1н №ОН, после доводили рН буфера до 4,96 и растворяли в нем 0,11г пирокатехина. Лакказа попадая в такой раствор начинала разрушать пирокатехин тем самым меня оптическую плотность раствора. Кювету толщиной 10 мм заполняют 100 мкл культуральной жидкости, 3,4 мл раствора субстрата и определяют изменение оптической плотности за 1 мин [3].
За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего окисление субстрата в ходе которого образуется 1 моль продукта за одну минуту.
Для определения общей оксидазной активности использовалась формула
(1) [4]:
Чмл/
ДР-У(мл)-ЮСЮ
с(л*м0ль'см~1)*и(мл)*г(м) (1)
где ДD - измеренное значение, характеризующее ферментативную активность (изменение оптической плотности);
V - объём реакционной смеси, в которой протекает ферментативная реакция, мл;
1 SCIENCE TIME 1
1000 - фактор пересчета моль/л в мкмоль/л в коэффициенте экстинкции;
в - молярный коэффициент поглощения, л^мольхм-1;
V - объём раствора фермента, мл;
t - время, по прохождении которого фиксируется изменение измеряемого параметра.
в - коэффициент экстинкции (740 (л^мольхм-1)), изменение времени равно 1 минуте.
Пробы отбирались на восьмой день культивирования продуцента. Нативный раствор лакказ получали путём очистки культуральной жидкости от биомассы, с помощью фильтрации через мелкопористый бумажный фильтр. Далее пробы анализировали на общую оксидазную активность в течении 15 минут. В ходе анализа высчитывалось среднее значение изменения оптической плотности за минуту.
В ходе работы был проведен эксперимент по влиянию ионов меди на активность фермента (табл. 2).
Таблица 2
Данные полученные в ходе однофакторного эксперимента по влиянию меди на общую оксидазную активность при глубинном культивировании штамма ГппаНа trogii
№ Кол-во Cu2+ , мкмоль/л Активность, Ед/мл
1 0 4,67
2 750 17,5
3 1500 19,33
4 2250 31,535
5 3000 33,405
6 3500 0
В результате эксперимента было определено, что максимальная активность фермента наблюдается при концентрации ионов меди 3000 мкмоль/л.
Вторым этапом исследования было проведение трехфакторного эксперимента типа Ионы меди - Чай - Виноградные гребни. Учитывая возможность межфакторных взаимодействий нами были взять разлиные концентрации индукторов (табл. 3).
1 SCIENCE TIME 1
Таблица 3
Концентрация индукторов в трехфакторном эксперименте типа Ионы меди -Чай - Виноградные гребни
Концентрация Ионы меди Чай (x2), г/л Виноградные
(x1), мкмоль/ гребни (x3),
л г/л
Высокая [+] 3250 1,2 2,2
Средняя [0] 2750 1 2
Низкая [-] 2250 0,8 1,8
После снятия показаний были получены следующие данные (табл. 4).
Таблица 4
Данные полученные в ходе трехфакторного эксперимента смеси индукторов Ионы меди - Чай - Виноградные гребни на общую оксидазную активность при глубинном культивировании штамма ГппаНа trogii
№ X1 X2 X3 Активность, Ед/мл
1 + + + 2,29
2 + + - 25,78
3 + - + 26,72
4 + - - 0
5 - + + 14,74
6 - + - 39,31
7 - - + 26,32
8 - - - 23,64
9 0 0 0 28,53
10 0 0 0 32,01
В результате эксперимента было выявлено, что максимальная активность наблюдалась в колбе с пониженным содержанием ионов меди вместе с виноградными гребнями и с повышенным содержание чая. Данный образец показал активность 39,31 Ед/мл.
Сравнение результатов активности однофакторного и трехфакторго эксперимента показало, что последний эффективнее на 18%.
1 SCIENCE TIME 1
Помимо прочего, было изучено влияние индукторов в ходе трехфакторного эксперимента (табл. 5).
Таблица 5
Влияние чая и виноградных гребней на общую оксидазную активность при глубинном культивировании штамма ГппаНа trogii
Индуктор Тип образца Изменение активности, %
Чай -x - 66
Чай -X + -78
Виноградные гребни —X 11
Виноградные гребни -+X -166
Таким образом выявлено, что концентрация виноградных гребней при различных концентрациях чая и меди может иметь как положительное, так и резко отрицательное влияние на активность; оптимальной концентрацией для гребней, является 1,8-2,0 г/л, для положительного эффекта в ~11%. Чай оказывает более положительное влияние составляющее 66%, в пике, при минимальной концентрации, однако образец с наивысшей активностью имеет в своём составе максимальную концентрацию чая; поэтому оптимум чая сохраняется в том же диапазоне. Также, исходя из этих данных можно судить о том, что высокие концентрации чая и виноградных гребней оказываются негативный эффект при совместном использовании. Влияние меди имеет положительный эффект с максимумом концентрации в 3000 мкмоль/л; большие значения приводят к сильному угнетению продуцента.
Литература:
1. Осипов Е.М. Структурно-функциональная характеристика хлорид-резистентной лакказы из Botrytis aclada: специальность 03.01.04 «Биохимия»: диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук / Осипов Евгений Михайлович; Институт биохимии им. А.Н. Баха. - Москва, 2016. - 108 с.
2. Трубицина Л.И. Двухдоменные лакказы бактерий рода Streptomyces: клонирование, экспрессия, характеристика ферментов: диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Специальность: 03.01. 04-Биохимия. Пущино, 2017 г. - 147 с. - Ин-т биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 2017.
3. Клепиков А.А. Скрининг и изучение базидиальных грибов в качестве продуцентов лакказ / А.А. Клепиков, М.М. Шамцян // Известия СПбГТИ (ТУ). -2014. - № 23 (49). - С. 39-42.
4. Полыгалина Г.В. Определение активности ферментов. / Г.В. Полыгалина, Л.В. Римарева, В.С. Чередниченко. - Москва, 2003. - С. 375.
