CC BY
34
комнатной температуре 10% желатина в пептонной воде. Инкубация происходила при температуре 20-220С в течение нескольких дней. Pseudomonas aeruginosa, как строгий аэроб, способна развиваться преимущественно на поверхности питательных сред, где обеспечен широкий доступ кислорода. Для того, чтобы биохимические процессы осуществлялись не только на поверхности, но и распространялись в глубинные слои среды, мы встряхивали пробирки для равномерного распределения посевного материала. Для изучения сахаролитических свойств мы использовали набор ID 32 GN, предназначенный для автоматической идентификации грамотрицательных палочек. В состав одного из микротестов входил гликоген (GLYCOGENE). Это дегидрированный субстрат. Чтение стрипа осуществлялось автоматически через 24 часа на приборе ATB Expression bio Merieux фотометрическим методом.
Результаты. В ходе эксперимента было установлено, что все испытуемые бактерии обладают высокой протеолитической активностью. Все штаммы Pseudomonas aeruginosa в течение 2 суток при температуре 20-220С разжижают желатин in vitro.
При добавлении к питательной среде с желатином 0,5 мл 1 и 3% ацетонового экстракта, протеолитические свойства существенно меняются. Заслуживает внимание тот факт, что при добавлении 1% ацетонового экстракта ОМШП 31,25% штаммов деградируют желатин с помощью фермента желатиназы лишь на 2 и 3 сутки. Остальные 68,75% штаммов в этих условиях желатиназу не образуют. 3% ацетоновый экстракт оказывает бактерицидное действие на Pseudomonas aeruginosa и соответственно полностью ингибирует ферментативную активность бактерий. Преобразование гликогена в нормальных условиях характерно лишь для 12,5% штаммов. Под влиянием 1 и 3% раствора экстракта ОМШП разложение гликогена не происходило.
Результаты исследования представлены в табл.
Таблица
Результаты изучения биохимической активности Pseudomonas aeruginosa, выделенных от больных с различными формами течения инфекционного процесса
Кол-во Количество штаммов, деградирующих
В обычных условиях После обработки 1% ацетоновым экстрактом
желатин гликоген желатин гликоген
Раны 16 15(93,75%)-I 1(6,25%)-II 2(12,5%)-I (-) -II 4(25%)- II 1(6,25%)-Ш В течение 7 сут. разложения не произошло 100% штаммов не разложили гликоген
Моча 4 4(100%)-I (-) -I и II 2(50%)- III В течение 7 сут. разложения не произошло 100% штаммов не разложили. гликоген
Всего: 20 (100%) После обработки 3% ацетоновым экстрактом
Рост и разжижение веществ отсутствует
Условные обозначения: I - первые сутки инкубации, II - вторые сутки, (-) -отрицательная реакция.
Гликоген является резервным полисахаридом всех живых организмов. Имеются данные, свидетельствующие о том, что по крайней мере в ряде тканей (мышцы кролика, человека, сетчатка глаз быка) полисахаридные цепи гликогена ковалентно соединены с белком, то есть гликоген является протеогликаном.
Очищенный гликоген содержит 1,5-2,0 мг белка на 100 мг глюкозы, причем отделить белковый компонент от полисахаридного не удается даже в сильно диссоциирующих условиях [2]. Гликоген подвергается гидролитическому расщеплению под действием ферментов амилаз, активными продуцентами которых являются некоторые бактерии рода Pseudomonas.
Протеолитические ферменты микробного происхождения при нарастании их количества образуют целый ряд медиаторов воспаления, ведущих к активации биохимических систем и мик-роэкологическим сдвигам. Способность к продукции ферментов патогенности является тем условием, которое обеспечивает существование бактерий на слизистых поверхностях [3, 4].
Исследуемые нами клинические штаммы Pseudomonas aeruginosa показали достаточно высокую частоту обнаружения ряда ферментов, коррелирующих с условной патогенностью, а при действии 1 и 3% ацетоноого экстракта продукция ферментов по сравнению с контролем существенно изменяется.
Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о возможном участии выявленных ферментов патогенно-
сти в развитии гнойно-воспалительных процессов, хронического течения инфекции и целесообразности изучения природных веществ, влияющих на свойства штаммов Pseudomonas aeruginosa.
Литература
1. Бондаренко В.М.И Ж. микробиол..- 1999.- №5.- С. 34-39.
2. Мороз А. Ф. Синегнойная инфекция.-М.: Медици-на,1988.- С.45.
3. Мавзютов А.Р. и др.// Ж. микробиол.- 2002.- №6.- С.5-9.
4. Агапова О.В., Бандаренко В М. // Ж. микробиол.- 1998.-№2.- С.121-125.
УДК 616.157
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АЦЕТОНОВОГО ЭКСТРАКТА ОРГАНИЧЕСКОЙ МАССЫ ШУНГИТОВОЙ ПОРОДЫ НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
Н.В. СЕРЕГИНА, Т.В.ЧЕСТНОВА*
Появляются данные, касающиеся характеристики факторов вирулентности и оценке их роли в осуществлении определенных фаз развития инфекционного процесса. Инфекционный процесс одна из форм взаимодействия между микробами и макроорганизмом, сложившаяся в ходе эволюции. Адгезия является пусковым, наиболее важным этапом инфекционного процесса. Это свойство бактерий фиксироваться и размножаться, колонизируя поверхности различной природы [1, 2, 3]. Предотвращение микробной адгезии на чувствительных клетках макроорганизма является непременным условием блокирования инфекционного процесса на раннем этапе его развития, что в настоящее время учитывается при разработке специфических профилактических препаратов. Факторы адгезии к эритроцитам хорошо известны у энтеробактерий. Адгезины Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae представлены фимбриями белковой природы.
Цель работы - оценка влияния ацетонового экстракта ОМШП на адгезивность энтеробактерий, вызывающих гнойновоспалительные заболевания.
Материалы и методы. В работе использовалась клиническая методология исследования, включающая микроскопические, бактериологические и математические методы. Для определения адгезивной активности в работе были использованы следующие виды энтеробактерий: Escherichia coli (20 штаммов) и Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae (20 штаммов). Все бактерии были выделены из клинического материала, который обрабатывали 3% ацетоновым экстрактом ОМШП. Для изучения адгезивного процесса бактерий использованы методические рекомендации №286/7 «Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксиген-ных свойств энтеробактерий» [4] и доступная и более информативная методика В.И. Брилиса, Т. А. Брилене, Х.П. Ленцнера [5]. Схема исследования адгезивности включала два метода. Экспресс-метод предназначен для визуального определения адгезивной активности (качественный метод). Методика В.И. Брилиса, Т.А. Брилене, Х. П. Ленцнера более точна и является количественным способом изучения адгезии с помощью показателей:
1) СПА (средний показатель адгезии) - это среднее количество микробов, прикрепившихся к одному эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения. Средний показатель адгезии составляет: нулевая - 0-1,0, низкая - 1,01-2,0, средняя - 2,01-4,0, высокая -свыше 4
2) К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе) - это процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы.
3) ИАМ (индекс адгезивности микроорганизма) - это среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле:
СПА -100
ИАМ--
К
Бактерия считается неадгезивной при ИАМ < 1,75; низкоадгезивной от 1,76-2,5; среднеадгезивной при 2,51-4,0; высокоадгезивной при ИАМ выше 4,0. Клеточным субстратом служили
* ТулГУ, мединститут
нативные эритроциты человека 0(1) Rh(+) группы крови и эритроциты барана. Это универсальная модель, так как, известно, что эритроциты имеют на своей поверхности идентичное гликока-ликсу эпителиальных клеток вещество - гликофорин, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов.
Постановка реакции с эритроцитами животных значительно расширяет возможность выявления адгезивных бактерий.
В эксперименте использовали изотонический раствор хлорида натрия рН=7,2-7,3. Кровь брали в стерильную пробирку с бусами для отделения фибрина. Центрифугировали со скоростью 1000 об/мин., удаляли сыворотку, эритроциты отмывали физиологическим раствором для получения прозрачного надосадка.
В качестве питательной среды для роста использовался Mueller Hinton агар (MH2-D) фирмы Bio Merieux France. Время инкубации составило 18-24 часа при температуре 370С. Температурный режим тщательно соблюдался, так как при понижении температуры инкубации синтез адгезинов подавляется.
На стерильном физрастворе готовили 1% раствор Д-маннозы. Это обосновано тем, что у Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae адгезия обусловлена наличием фимбрий, причем в зависимости от типа фимбрий адгезия может подавляться или не подавляться углеводом Д-маннозой. Адгезия, не подавляемая Д-маннозой, может говорить о патогенности бактерий. Наличие факторов адгезии определяли в реакции Д-маннозорезистентной гемагглютинации с эритроцитами человека и барана. Культуру вносили на предметное стекло с каплей физиологического раствора, содержащего 1% Д-маннозу, растирали и смешивали с каплей 3% взвеси эритроцитов. Стекла помещали на лед на 3-5 минут. Адгезивные культуры в этих условиях вызывали гемагглютинацию, которую фиксировали визуально.
В дальнейшей работе мы изучаем адгезивные свойства у энтеробактерии с помощью количественных характеристик.
Для этого с помощью прибора денситометра фирмы Bio Merieux France готовили взвесь эритроцитов в физиологическом растворе в количестве 0,5 MF и взвеси бактерий 4 MF. Взвеси бактериальных культур и эритроциты по капле наносили на обезжиренное стекло, смешивали, инкубировали при температуре 370С в течение 30 минут. Готовые мазки высушивали при комнатной температуре, фиксировали в 960С этиловом спирте и окрашивали по Граму и Романовскому - Гимзе. Затем изучение адгезии вели с помощью светового микроскопа и цифровой камеры-окуляра (модель ДСМ 3 МПикс., USB 2.0.) фирмы «Shan-grao Tele View Optical Instruments Co., Ltd», Китай. Изображение передавалось на экран компьютера. Для фиксации, визуализации и обработки изображения использовали программы Mini See и Scope Photo. Результаты исследования представлены в табл.1 и 2.
Таблица 1
Адгезивная активность энтеробактерий под действием ацетонового экстракта ОМШП Клеточный субстрат — эритроциты барана
и на эритроцитах барана. Изменение адгезивных свойств энтеробактерий представлены на рис.1, 2.
Наименование Показатели адгезии
СПА 1 КУЭ(%) 1 ИАМ
Escherichia coli
Контроль (до обработки экстрактом) 4,04 80,0 5,05
После обработки ацетоновым экстрактом ОМШП 1,22 71,7 1,70
Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae
Контроль (до обработки экстрактом) 5,08 89,3 5,68
После обработки ацетоновым экстрактом ОМШП 1,62 71,1 2,27
Таблица 2
Адгезивная активность энтеробактерий под действием ацетонового экстракта ОМШП Клеточный субстрат — эритроциты человека 0(1) ИЬ (+)
Наименование Показатели адгезии
СПА 1 КУЭ (%) 1 ИАМ
Escherichia coli
Контроль (до обработки экстрактом) 5,30 84,2 6,29
После обработки ацетоновым экстрактом ОМШП 2,12 73,4 2,88
Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae
Контроль (до обработки экстрактом) 4,62 89,2 5,17
После обработки ацетоновым экстрактом ОМШП 2,03 82,3 2,46
Аетоновый экстракт ОМШП оказывает влияние на адгезивные свойства энтеробактерий. Анализ приведенных данных показывает, что все клинические штаммы Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae,выделенные от больных, имеют высокий показатель адгезии (СПА>4,04), а культуры считаются высокоадгезивными (ИАМ>5,05), как на модели эритроцитов человека, так
Рис. 1 Адгезия Escherichia coli к эритроцитам барана
Рис. 2 Адгезия Escherichia coli к эритроцитам человека O(I) Rh(+)
После обработки культур Escherichia coli и эритроцитов барана ацетоновым экстрактом ОМШП, бактерии становятся низкоадгезивными. СПА уменьшается ~ в 3,31 раза; КУЭ на 8,3%; ИАМ в 2,97 раза. У штаммов Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae под действием экстракта также снижаются адгезивные свойства: СПА уменьшается ~ в 3,13 раз; КУЭ на 18,2%; ИАМ в 2,5 раза. В реакции с эритроцитами человека O(I) Rh(+) штаммы Escherichia coli под действием ацетонового экстракта проявляю-тадгезию средней степени,при этом СПА уменьшается в 2,5 раза; КУЭ на 10,8%; ИАМ в 2,18 раз. Klebsiella pneumoniae/ pneumoniae также становится среднеадгезивной: СПА уменьшается в 2,27 раз; КУЭ на 6,9%; ИАМ в 2,10 раз.
Заключение. На основании экспериментов, нам представляется возможным сделать вывод о том, что бактериальная адгезия к клеточным поверхностям может ингибироваться 3% ацетоновым экстрактом ОМШП. Но необходимо помнить, что степень адгезии бактерии не всегда может точно отображать потенциал вирулентности возбудителя. Полученные нами данные требуют дальнейшего глубокого изучения, их нельзя отделять от анализа гемолизирующих и ферментативных свойств энтеробактерий в созданных нами условиях эксперимента.
Литература
1.Бондаренко В.М. // Ж. микробиол.- 1999.- №5.- С. 34-39.
2Макаренкова И.Д. и др. // Ж. микробиол. .- 2006.- №3, приложение.- С. 121-125.
3.Усвяцов Б.Я. и др. // Ж. микробиол.- 2005.- №4.- С.89-95.
4Метод. реком. № 28-6/7 «Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных свойств энтеробактерий», 1987.
5.Брилис В.И. и др // Лаб. дело.-1986.- №4.- С.210-212.
УДК: 616- 053.31:613.84
МОРФОФЕНОТИП И РАННЯЯ НЕОНАТАЛЬНАЯ АДАПТАЦИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ МАТЕРЕЙ С ПРЕНАТАЛЬНЫМ КУРЕНИЕМ
М.И. ДЖАМАЛИ, А.А. ЯЙЛЕНКО, А.Н. ИВАНЯН, Т.В. ГРИБКО*
Актуальность проблемы в настоящее время обусловлена широким распространением курения среди женщин детородного возраста, беременных и кормящих матерей. Прогрессивный рост количества женщин, курящих во время беременности наблюдается в большинстве стран мира, за исключением некоторых скандинавских стран. Этот рост курильщиц в период беременности объясняется распространенностью курения среди подростков и
* Смоленск, каф. акушерства и гинекологии ФПК и ППС
