CC BY
41
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 57.088.6+577.175.62
ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ АЛКАНОТРОФНЫХ РОДОКОККОВ К БИОТРАНСФОРМАЦИИ СТИГМАСТ-5-ЕН-ЗР-ОЛА
Е. М. Ноговицина3, В. В. Гришкоь, Т. П. Кукинас, И. Б. Ившинаа,<>
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13 ь Институт технической химии УрО РАН, 614000, Пермь, ул. Ленина, 13 с Институт органической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 9 л Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
Среди актинобактерий с высокой активностью оксигеназ, хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ (www.ecology.psu.ru/ 1е^со1/5й-ат5/), выявлены штаммы Яко(1ососсив врр., катализирующие процесс биоконверсии стигмаст-5-ен-Зр-ола ((3-ситостерола) в стигмаст-4-ен-З-он в соокислительных условиях культивирования родококков на минеральной среде с н-гексадеканом. Установлено, что клетки родококков в присутствии глюкозы и ингибитора 2,2’-дипиридила трансформируют стиг-маст-5-ен-Зр-ол в 17(3-гидроксиандрост-4-ен-3-он (тестостерон), широко востребованный в фармацевтической практике.
В процессе синтеза интермедиатов стероидных лекарственных препаратов перспективно использование реакций биологической трансформации стеринов растительного и животного происхождения. Стигмаст-5-ен-Зр-ол (Р-ситостерол), выделяемый из отходов деревообрабатывающей промышленности, один из наиболее дешевых и доступных источников стероидов андростанового ряда. Наибольший интерес для получения андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-диона - предшественников гормональных препаратов - представляют реакции окислительного отщепления алифатической боковой цепи молекулы, окисления Зр-гидроксильной группы в кетогруппу, изомеризации и дегидрогенизации (рис. 1).
Рис. 1. Возможные пути биотрансформации стеринов
В процессах биотрансформации стеринов успешно используются представители различных групп прокариотных организмов (Seidel, Horhold, 1992; Mahato, Majumdar, 1993; Ambrus et al., 1995; Mahato, Garai, 1997). Актинобактерии рода Rhodo-coccus, характеризующиеся высокой активностью оксигеназ и способностью ассимилировать гидрофобные субстраты, имеют высокий биотехнологический потенциал и рассматриваются в качестве перспективных агентов трансформации органических соединений (Ившина, 1997; Warhurst, Fewson, 1994). В настоящее время известно лишь несколько работ по биоконверсии стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками родококков (Murohisa, Iida, 1993; MacLachlan et al., 2000). В лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН собрана обширная коллекция чистых идентифицированных непатогенных бактериальных культур, выделенных из различных природных субстратов контрастных природно-климатических зон. Значительный удельный вес в общем количестве коллекционных штаммов занимают представители рода Rhodococ-cus sensu stricto.
Цель настоящего исследования - поиск новых активных биотрансформаторов стигмаст-5-ен-ЗР-ола (Р-ситостерола) и изучение особенностей процесса биоконверсии данного стерина с использованием коллекционных культур алканотрофных родококков.
© Е.М. Ноговицина, В.В. Гришко, Т.П. Кукина, И.Б. Ившина, 2004
118
Объекты и методы исследования
В работе использовали 99 штаммов родококков (табл. 1), принадлежащих видам R. erythropolis, R. “longus", R. opacus, R. rhodochrous, R. ruber и хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ЙЭГМ (Каталог штаммов..., 1994; wvvw. ecology. psu.ru/iegmcol/strams/).
Таблица 1
Коллекционные штаммы Rhodococcus spp.
Род, вид Количе- ство штаммов Номер штамма в коллекции ИЭГМ
R. erythropolis 18 10,12,22,23,179,183,188, 192,200,203, 252,259,267, 271,487,498,505,696
R. ’’longus " 4 28,32, 68,69
R. opacus 3 246, 261,489
R. rhodochrous 3 64, 647, 655
R. ruber 71 71, 72,73, 74, 75, 76,77,78, 79, 80,81, 82,83, 84,85,86, 87,88, 89,90,91,92, 93,94, 172,219,220,221,223,224, 225,226,227,228,230,231, 232,233,234,235,236,237, 238,239,240,241,242,243, 320,321,322,323,324,325, 326,327,328,329,331,333, 346,381, 457,467,468,474, 478, 577, 583,593,597
Культуры выращивали в жидкой минеральной среде (г/л): KN03- 1,0; КН2Р04 - 1,0; К2НР04 -1,0; NaCl - 1,0; MgS04- 0,2; СаС12-0,02; FeCl3 -0,001; дрожжевой экстракт - 0,1, содержащей 0,1 об.% н-гексадекана, 1,0 % глицерина или 1,0% глюкозы. Стигмаст-5-ен-Зр-ол (500мг/л) предварительно растворяли в пропан-2-оле и добавляли в минеральную среду через 48 ч культивирования бактериальных клеток. В экспериментах по ингибированию 9а-гидроксилазной активности одновременно с стигмаст-5-ен-ЗР-олом в качестве ингибитора вносили 2,2'-дипиридил (70 мг/л). Культивирование родококков проводили на орбитальном шейкере (150 об/мин) при температуре 28°С. Посевным материалом служили родококки (5 х 105кл/мл), выращенные на мясопептонном агаре и отобранные в экспоненциальной фазе роста. Содержание белка определяли с использованием модифицированнового метода Лоури (Горина, Яковлева, 1980). Количество остаточного стерина в культуральной жидкости выявляли ферментативным экспресс-методом (Allain et al., 1974) с использованием спектрофотометра Lambda EZ201 (Perkin Elmer) и коммерческой тест-системы контроля уровня холестерола (ООО «Ольвекс Диагно-стикум», Санкт-Петербург).
Продукты микробного окисления экстрагировали этиловым эфиром уксусной кислоты (3 х 50
мл). Объединенные этилацетатные вытяжки сушили над обезвоженным сульфатом натрия. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя. Образование продуктов бактериального окисления контролировали методом тонкослойной хроматографии на Sigma-Aldrich ТСХ пластинах. Образование стигмаст-4-ен-З-она регистрировали в УФ-лучах, остальных интермедиатов — опрыскиванием H2S04 (конц.) и последующим прогреванием при 95-100°С в течение 4-6 мин. При анализе реакционных смесей в качестве эталонного соединения использовали химически чистый стигмаст-4-ен-З-он, который получали путем окисления стигмаст-5-ен-Зр-ола хромовой смесью. Количественный состав продуктов окисления анализировали с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе Милихром (колонка 6,3x0,2 см с фазой Lichrosorb RP-18). В качестве элюента использовали метанол, дегазированный путем продувки гелия, в качестве растворителя для нанесения пробы на колонку — смесь ацетона с метанолом (3:1); рабочая длина волны прибора - 210 нм. Содержание стигмаст-4-ен-З-она в сумме стерино-вых компонентов определяли по площадям пиков хроматограмм реакционных смесей с учетом коэффициентов, обусловленных разницей в экстинк-ции исходного и конечного продукта. Данные коэффициенты рассчитывали при использовании искусственных смесей стигмаст-5-ен-ЗР-ола и стиг-маст-4-ен-З-она. Качественный анализ продуктов биотрансформации проводили на газовом хроматографе Agilent 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора и кварцевой колонкой HP-5MS SN US 15189741-1.
Для статистической обработки результатов использовали компьютерные программы Microsoft Excel.
Результаты и их обсуждение
Экспериментами установлено, что все исследуемые штаммы родококков используют стигмаст-5-ен-ЗР-ол в качестве единственного источника углерода и энергии. При этом уровень деструкции исходного субстрата незначителен и не превышает 20%.
Нами был отобран штамм R. ruber ИЭГМ 233 (табл. 2), трансформирующий стигмаст-5-ен-Зр-ол до стигмаст-4-ен-З-она (7,9%), образование которого катализируется бифункциональным ферментом - холе-стеролоксидазой, ответственным за реакции окисления ЗР-гидроксильной группы и изомеризации двойной связи. С целью повышения степени конверсии стерина данный штамм выращивали в соокислитель-ньгх условиях с использованием глицерина, глюкозы или н-гексадекана. По нашим данным, максимальное (68,59 мкг/мл) накопление клеточного белка наблюдается при выращивании R. ruber ИЭГМ 233 в условиях соокисления с глюкозой, в остальных слу-
чаях содержание белка не превышает 20,83-27,95 мкг/мл (рис. 2).
Таблица 2
Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Шю^сосст врр.
Вид, штамм Абиотический контроль Сумма продуктов реакции, мг/л Содержание в сумме продуктов реакции, мг/л
Стигмаст- 5-ен-Зр-ол 460,70 Стигмаст-4-ен-З-он Не обнаружено
460,70
R. erythropolis ИЭГМ 22 443,42 421,64 (<1)
R. erythropolis ИЭГМ 23 468,12 461,45 (<1)
R. erythropolis ИЭГМ 179 441,52 415,83 15,69(3,6)
R. erythropolis ИЭГМ 183 439,21 411,18 17,45 (4,0)
R. ruber ИЭГМ 77 428,63 397,62 9,08(2,1)
R. ruber ИЭГМ 80 451,28 449,43 (<1)
R. ruber ИЭГМ 233 365,57 308,83 28,84 (7,9)
R. ruber ИЭГМ 322 450,27 443,87 (<1)
Примечание. Здесь и в табл. 3 в скобках приведено количество стигмаст-4-ен-З-она в процентах.
Как видно го табл. 3, родококки осуществляют биотрансформацию стигмаст-5-ен-3(3-ола наиболее активно в условиях соокислительного роста в присутствии н-гексадекана. При этом в качестве основного
Время, сут
Рис. 2. Содержание клеточного белка R. ruber ИЭГМ 233 при росте в среде с стигмаст-5-ен-ЗР-олом в присутствии:
1 - глюкозы, 2 - н-гексадекана, 3 - глицерина
продукта биотрансформации накапливается значительное (310,5 мг/л) количество стигмаст-4-ен-З-она -общая сумма продуктов реакции составляет 376,65 мг/л. В связи с этим все эксперименты по изучению трансформирующей активности родококков в дальнейшем проводили в соокислительных условиях с ис-
пользованием н-гексадекана. На рис. 3 представлены хроматограммы продуктов биотрансформации стери-на клетками Rhodococcus spp., полученные с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Большинство исследуемых штаммов родококков в условиях соокисления с н-гексадеканом трансформируют стигмаст-5 -ен-3 Р-ол до стигмаст-4-ен-3-она, содержание которого в сумме продуктов биотрансформации у наиболее активных бактериальных культур составляет от 40,0 до 98,0%. Как видно из табл. 4, представители R ruber характеризуются наиболее выраженной холестеролоксидазной активностью в отношении стигмаст-5 -ен-3 р-ола и катализируют процесс биоконверсии стерина до образования стигмаст-4-ен-З-она.
Таблица 3
Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Rhodococcus ruber ИЭГМ 233
Источник углерода Сумма продуктов реакции, мг/л Содержание в сумме продуктов реакции, мг/л
Стигмаст- 5-ен-ЗР-ол 308,83 Стигмаст- 4-ен-З-он
Р-Ситостерол 365,57 28,84 (7,9)
н-Гексадекан 376,65 10,75 310,50 (82,4)
Г лицерин 248,23 167,47 60,35 (24,3)
Глюкоза 152,42 59,44 83,25 (54,6)
Таблица 4
Биотрансформация стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками Rhodococcus spp. в присутствии н-гексадекана
Вид, штамм (число штаммов) Количество стигмаст-4-ен-3-она, %
Абиотический контроль 0
R. erythropolis (7) 4,7-27,1
R. erythropolis (10) 41,0-57,1
R. erythropolis ИЭГМ 10 70,7
R. “longus" (4) 2,2-8,0
R. opacus (3) 2,9-6,3
R. rhodochrous (3) 0-14,4
R. ruber (27) 4,6-27,4
R. ruber (13) 33,9-47,3
R. ruber (22) 51,2-78,4
R. ruber ИЭГМ219 80,0
R. ruber ИЭГМ 233 82,4
R. ruber ИЭГМ 235 90,6
R. ruber ИЭГМ 94 92,7
R. ruber ИЭГМ 72, ИЭГМ 85, ИЭГМ 86, ИЭГМ 172, ИЭГМ 220 98,0
Необходимо отметить, что во всех экспериментах был получен низкий уровень продуктов отщепления боковой цепи Р-ситостерола, содержание которых не превышало 2%. С учетом результатов определения способности родококков к более полной деградации стигмаст-5-ен-ЗР-ола (табл. 3) и максимального накопления клеточной биомассы в условиях соокисления с глюкозой (рис. 2)
R. erythropolis ИЭГМ 203 R. ruber ИЭГМ 80
Я ruber ИЭГМ 91
Рис. 3. Хроматограммы продуктов биотрансформации стигмаст-5-ен-Зр-ола клетками ШосЬсосст ирр. в соокислительных условиях в присутствии н-гексадекана:
1 - остаточный стигмаст-5-ен-3|3-ол; 2 - стигмаст-4-ен-З-он
последующие скрининговые исследования проводили в условиях ингибирования активности фермента 9а-гидроксилазы, катализирующего начальную стадию деструкции циклического остова молекулы стерина. По данным хромато-масс-спект-рометрии, в присутствии глюкозы и ингибитора 2,2'-дипиридила с использованием клеток родококков достигается отщепление боковой алифатической цепи стигмаст-5-ен-Зр-ола с образованием 10% 17р-гидроксиандроста-4-ен-3-она (тестостерона). Необходимо отметить, что в литературе описана способность лишь некоторых прокариотных организмов, в частности микобактерий, к одностадийной трансформации стеринов до образования тестостерона (Hung et al., 1994; Lo et al., 2002).
OH
17р-Г идроксиандрост-4-ен-З-он (тестостерон)
Таким образом, нами установлено, что большинство исследованных коллекционных штаммов
Rhodococcus spp. в соокислительных условиях с н-гексадеканом трансформирует стигмаст-5-ен-Зр-ол в стигмаст-4-ен-З-он. При этом представители R. ruber характеризуются выраженной холестеро-локсидазной активностью по отношению к исходному стерину. Обнаружено, что родококки в соокислительных условиях с глюкозой в присутствии ингибитора 2,2’-дипиридила катализируют реакцию отщепления боковой алифатической цепи Р-ситостерола с образованием целевого продукта 17р-гидроксиандроста-4-ен-3-она (тестостерона).
Работа поддержана фантами ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы» (проект № И0573/1343), РФФИ (№ 01-04-96461).
Библиографический список
Горина И.А., Яковлева В.И. Быстрый метод определения содержания белка в клетках микроорганизмов // Прикл. биохимия и микробиология. 1980. Т. 16, №6. С. 936-937.
Ившина КБ. Бактерии рода Rhodococcus: биоразнообразие, детекция, иммунодиагностика: Дис... д-рабиол. наук. Пермь, 1997.
Каталог штаммов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной М.: Наука, 1994.
Allain С.С., Рооп L.S., Chan C.S.G., Richmond W., Fu P. С. Enzymatic determination of total serum cholesterol // Clin. Chem. 1974. Vol. 20, № 4. P. 470-475.
Ambrus G., llkoyE., Jekkel A., Horvath G., Bocskei Z. Microbial transformation of p-sitosterol and stig-masterol into 26-oxygenated derivatives // Steroids. 1995. Vol. 60, № 6. P. 621-625.
Hung B.R., Falero A., Lanes N„ Perez S., Ramirez M.A. Testosterone as biotransformation product in steroid conversion by Mycobacterium sp. // Bio-technol. Lett. 1994. Vol. 16, № 5. P. 497-500.
Lo C.K., Pan C.P., Liu W.H. Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by mutant of Mycobacterium sp. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002. Vol. 28, № 5. P. 280-283.
MacLachlan J., Wotherspoon A.T.L., Ansell R.O., Brooks, C.J.W. Cholesterol oxidase: sources,
physical properties and analytical applications // J. Ster. Biochem. Mol. Biolog. 2000. Vol. 72, № 5. P. 169-195.
Mahato S.B., Garai S. Advances in microbial steroid biotransformation // Steroids. 1997. Vol. 62, № 4. P. 332-345.
Mahato S.B., Majumdar I. Current trends in microbial steroid biotransformatiort // Phytochemistry. 1993. Vol. 34, № 4. P. 883-898.
Murohisa T., Iida M. Studies on microbial transformation (XXVI). Some new intermediates in microbial side chain degradation // J. Ferment. Bioeng. 1993. Vol. 75, №3. P. 174-180.
Seidel L., Hoerhold C. Selection and characterization of new microorganisms for the manufacture of 9-OH-AD from sterol // J. Basic. Microbiol. 1992. Vol. 32, № l.P. 49-55.
Warhurst A.M., Fewson A.C. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus II Crit. Rev. Biotechnol. 1994. Vol. 14, № 1. P. 29-73.
The study of alkanotrophic rhodococci ability to biotransform stigmast-5-en-3-ol
Ye.M. Nogovitsina, V.V. Grishko, T.P. Kukina and I.B. Ivshina
Amongst actinobacteria possessing high oxygenase activities and stored in the Regional specialised collection of alkanotrophic microorganisms IEGM ('www.ecologv.Psu.ru/iegmcol/strainsA. there were identified Rhodococcus spp. strains catalysing process of bioconversion of stigmast-5-en-3P-ol (P-sytosterol) to stigmast-4-en-3-one under cooxidative cultivation of rhodococci on mineral salts medium supplemented with «-hexadecane. In the presence of glucose and the inhibitor 2,2'-dipyridil, rhodococci cells were determined to convert stigmast-5-en-3p-ol to 17P-hydroxyandrost-4-en-3-one (testosterone), with the latter being widely used for pharmaceutical purposes.
