Эффективные биокатализаторы для получения фармакологически активных соединений из природных стеролов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.66+547.92

Е.М. Ноговицина, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Г.А. Бажутин, Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет В.В. Гришко, Институт технической химии УрО РАН

А. А. Елькин, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский

государственный национальный исследовательский университет

Е.В. Тарасова, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Т .И. Кылосова, Пермский государственный национальный исследовательский университет

К.М. Черемных, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

С использованием актинобактерий рода Rhodococcus исследован процесс бактериальной трансформации стеролов растительного и животного происхождения с целью получения на их основе фармакологически активных соединений. Установлено, что представители Rhodococcus егуШгоро^, растущие в присутствии н-гексадекана и пальмитиновой кислоты, эффективно (до 99%) трансформируют в-ситостерол в высокой (2-10 г/л) концентрации с образованием фармакологически активного стигмаст-4-ен-3-она. Исследован процесс биотрансформации 10 г/л в-ситостерола в условиях биореактора. Установлено, что степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигает 40% после 22 суток от начала эксперимента. Исследована способность родококков, иммобилизованных на поверхности технической полимерной ткани, к биотрансформации в-ситостерола в условиях фосфатно-щелочного буфера (рН 7). Отобран штамм R. егуШгоро^ ИЭГМ 487, катализирующий в данных условиях наиболее эффективную (50%) трансформацию исходного субстрата в стигмаст-4-ен-3-он. Степень образования целевого продукта зависит от количества единиц носителя с закрепленными бактериями (фрагментов ткани площадью 1 см2). Проведены сравнительные исследования процесса биотрансформации стеролов с насыщенным углеродным остовом в присутствии н-гексадекана или глюкозы. Впервые обнаружена способность родококков к окислительной трансформации 5а-холестан-3в-ола с образованием 5а-холестан-3-она. Отобраны штаммы R. егуШгоро^ ИЭГМ 490, ИЭГМ 766, ИЭГМ 1017 и ИЭГМ 1018, проявляющие высокую (87-100%) трансформирующую активность в отношении 5а-холестан-3в-ола независимо от используемого источника углерода.

Ключевые слова: биотрансформация, родококки, иммобилизация, стеролы, в-ситостерол, стигмаст-4-ен-3-он, 5а-холестан-3в-ол, 5а-холестан-3-он, фармакологически активные соединения.

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Прувительства Пермского края (грант № 14-04-96005).

Использование технологий биокатализа в промышленном производстве фармацевтических препаратов позволяет осуществлять регио- и стереоселективную модификацию сложных по структуре органических соединений, в том числе труднодоступных для химического синтеза центров молекулы, в экологически безопасных условиях, без применения дорогостоящих и агрессивных реагентов. Холестерол, получаемый из животных жиров, стеролы растительного происхождения (Р-ситостерол и смеси Р-ситостеро-ла с кампестеролом или стигмастеролом, называемые «фитостерол»), а также сапо-генины (диосгенин, соласодин) являются основным источником стероидных гормонов [1] (рис. 1).

Микробиологическая трансформация стеролов с образованием ключевых предшественников в синтезе лекарственных гормональных препаратов (андрост-4-ен-3,17-диона и андроста-1,4-диен-3,17-дио-на) - традиционная биокаталитическая технология, применяемая в промышленном производстве стероидных соединений. Особенность процесса биотрансформации стеролов заключается в возможности получения на их основе разнообразных продуктов. Наряду с характерными метаболитами биоконверсии стеролов постоянно выявляются новые каталитические свойства микроорганизмов в отношении данных субстратов. Так, с использованием актинобактерий рода Rhodococcus нами разработан способ селективной био-

конверсии Р-ситостерола в фармакологически активный стигмаст-4-ен-3-он [2].

Известно, что физиологическое состояние бактериальных клеток может оказывать значительное влияние на процесс биотрансформации органических веществ. В основном подбор оптимальных условий процесса биотрансформации сте-ролов проводится с использованием бактерий, активно растущих в жидких питательных средах. Вместе с тем применение нерастущих и иммобилизованных форм биокатализаторов позволяет значительно сократить продолжительность процесса биотрансформации, который может проводиться в нестерильных условиях, в присутствии высоких концентраций субстратов [3].

С использованием актинобактерий рода Rhodococcus, поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним коллекции ИЭГМ, номер 768 во Всемирной федерации коллекций культур, www.iegmcol.ru, реестровый номер уникальной научной установки www.ckp-rf.ru/usu/73559), нами исследован процесс бактериальной трансформации стеролов растительного и животного происхождения с целью получения на их основе фармакологически активных соединений.

Подобраны условия биотрансформации Р-ситостерола в высоких (2-10 г/л) концентрациях с образованием стигмаст-4-ен-3-она. Установлено, что в условиях добавления 6,0 г/л исходного стерола в ви-

но

но

но'

Холестерол

Р-ситостерол

Кампестерол

Диосгенин

Соласодин

н

Рис. 1. Основные источники стероидов

де смеси с ß-циклодекстрином и Тви-ном-80 представители вида R. erythropolis проявляют высокую (более 93%) стерол-трансформирующую способность (рис. 2, а). При повышении концентрации ß-си-тостерола до 10 г/л активность большинства исследуемых культур составляет не более 60%. Наиболее высокой (75,498,9%) трансформирующей способностью обладает R. erythropolis ИЭГМ 490. С использованием данной культуры исследована биотрансформация ß-ситостерола в условиях биореактора BioFlo/CelliGen 115 (New Brunswik Scientific, США). Установлено, что степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигает 40% после 22 суток от начала эксперимента (см. рис. 2, а). В процессе инкубации отмечено увеличение показателя pH с 6,3 до 7,5 (рис. 2, б).

С целью поиска условий эффективной биотрансформации ß-ситостерола иммобилизованными родококками проведен подбор оптимальных носителей для закрепления бактерий на твердой поверхности. Установлено, что наиболее высокий (52-57%) уровень окислительной активности закрепленных клеток родококков в отношении ß-ситостерола (0,5 г/л) достигается в присутствии глюкозы при использовании в качестве носителя технической полимерной ткани (ТПТ) из нитей СВМ арт. 56313 «Н» ТУ 17 ВНИИПХВ-350-88 ООО «Укрматериал-

Инвест» (Украина). Необходимым условием эффективного получения стигмаст-4-ен-3-она является использование бактерий, иммобилизованных после предварительной инкубации в среде Wilmanska [4] с добавлением Р-ситостерола (рис. 3).

В результате серии проведенных экспериментов установлено, что биотрансформация Р-ситостерола закрепленными бактериями в условиях фосфатно-щелочного буфера (pH 7) позволяет избежать обрастания носителя биомассой, увеличить концентрацию исходного субстрата (от 0,5 до 2 г/л) и сократить продолжительность процесса (с 5 до 2 сут.). Максимальный (50%) уровень биоконверсии Р-ситостерола достигается при использовании культуры R erythropolis ИЭГМ 487. Установлено, что эффективность процесса биотрансформации Р-ситостерола зависит от количества носителя с закрепленными клетками. Так, добавление в 50 мл буфера 15 или 20 фрагментов ткани с клетками площадью 1 см2 приводит к снижению трансформирующей активности R. erythropolis ИЭГМ 487 на 10-24%, а наиболее эффективная конверсия наблюдается при использовании 10 единиц носителя. Штамм R. erythropolis ИЭГМ 766 катализирует максимальный (48,6%) уровень биоконверсии при использовании 15 фрагментов носителя. Окислительная активность R. ruber ИЭГМ 233 не превышает 35% (рис. 4).

50 -

30 -

О 10 -

8 7,5 7

6 5,5 5

7 10 13 16 19 22 23 Время, сут.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Время, сут.

а

б

Рис. 2. Динамика степени образования стигмаст-4-ен-3-она (а) и показателя рН (б) в процессе биотрансформации в-ситостерола (10 г/л) в условиях биореактора. Эксперименты проводили с использованием культуры R. erythropolis ИЭГМ 490. в-Ситостерол вносили в виде смеси с в-циклодекстрином (1:1) в 1,2% водном растворе Твина-80

40 -

а 20 -

0 "

0

4

• КВУ ■ тпт

□ Куриные перья □ Силикагель

О 20 -

S КВУ В ТПТ

□ Куриные перья □ Силикагель

^ is

1234123412341234

1234123412341234

а б

Рис. 3. Биотрансформация в-ситостерола (0,5 г/л) иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 233 в минеральной среде с добавлением н-гексадекана (1) или глюкозы (2), среде Wilmanska (3), фосфатно-щелочном буфере (4). Бактерии предварительно выращивали в среде Wilmanska без добавления (а) или с добавлением (б) 0,2 г/л в-ситостерола. Продолжительность процесса биотрансформации - 5 суток. КВУ - каталитический волокнистый углерод, ТПТ - техническая полимерная ткань

R. ruber ИЭГМ 233

R. erythropolis ИЭГМ 487

Л

П

R. erythropoli s ИЭГМ 766

_а

40 -20 -0

UL

0

0

о

2

2

2

Рис. 4. Биотрансформация в-ситостерола в условиях фосфатно-щелочного буфера: 1 - иммобилизованными клетками; 2 - после иммобилизации клеток и их инкубации в течение 2 суток в присутствии глюкозы и 0,2 г/л в-ситостерола. Количество единиц носителя (фрагментов ткани с клетками площадью 1 см2) на 50 мл фосфатно-щелочного

буфера: □ 10 □ 15 Я 20

В отдельных экспериментах установлено, что трансформирующие Р-ситосте-рол коллекционные штаммы родококков способны аналогичным образом (по 3Р-положению) окислять 5а-холестан-3Р-ол в концентрации 0,5 г/л с образованием 5а-холестан-3-она. Отобраны культуры R. вгу^горо^ ИЭГМ 490, ИЭГМ 766, ИЭГМ 1017 и ИЭГМ 1018, обладающие высокой (87-100%) трансформирующей активностью в отношении 5а-холестан-3Р-ола (рис. 5).

Таким образом, определены оптимальные условия биотрансформации Р-сито-стерола иммобилизованными клетками

родококков в фосфатно-щелочном буфере. Отобраны штаммы R. вгу^горо^ ИЭГМ 490, ИЭГМ 766, ИЭГМ 1017 и ИЭГМ 1018, катализирующие селективную (87-100%) трансформацию 5а-холе-стан-3р-ола в 5а-холестан-3-он независимо от используемого источника углерода. С применением культуры R. вгу^горо^ ИЭГМ 490 исследован процесс биотрансформации Р-ситостерола в высокой (10 г/л) концентрации в условиях биореактора. Установлено, что степень образования стигмаст-4-ен-3-она при исходном рН 6,3 и дополнительной аэрации 0,3 л/мин достигает 40%.

н<

5а-холестан-3-он

Рис. 5. Биотрансформация 5а-холестан-3в-ола родококкамми: в присутствии глюкозы ■ или н-гексадекана ■. Приведены данные после 5 суток процесса биотрансформации

Библиографический список

1. Bhatti H.N., Khera R.A. Biological transformations of steroidal compounds: a review // Steroids. - 2012. -Vol. 7. - № 12. - P. 1267-90.

2. Гришко В.В., Ноговицина Е.М., Ившина И.Б. Оптимизация условий биокаталитического получения стигмаст-4-ен-3-она // Химия природных соединений. - 2012. - № 3. - С. 390-392.

3. Wang Z., Zhao F., Chen D., Li D. Biotransformation of phytosterol to produce androstadienedione by resting cells of Mycobacterium in cloud point system // Process Biochem. - 2006. - Vol. 41. - № 3. -P. 557-561.

4. Wilmanska D., Dziadek J., Sajduda A., Milczarek K., Jaworski A., Murooka Y. Identification of cholesterol oxidase from fast-growing mycobacterial strains and Rhodococcus sp. // J. Ferment. Bioeng. - 1995. -Vol. 79. - № 2. - P. 119-124.

EFFECTIVE BIOCATALYSTS FOR THE PRODUCTION OF PHARMACOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS FROM NATURAL STEROLS

E.M. Nogovitsina1, G.A. Bazhutin2, V.V. Grishko3, A.A. Elkin1,4, E.V. Tarasova1, T.I. Kylosova4, K.M. Cheremnyh1

1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the UB of RAS

2 Perm State Humanitarian Pedagogical University

3 Institute of Technical Chemistry of the UB of RAS

4 Perm State University

Bacterial transformation of plant and animal sterols using thegenus Rhodococcusactinobacteria in order to obtain pharmacologically active compounds was studied. It was found that members of Rhodococcuserythropolis, growing in the presence of n-hexadecane and palmitic acid, efficiently (up to 99%) transform P-sitosterol in high (2-10 g/l) concentrations to pharmacologically active stigmast-4-en-3-one. The biotransformation of 10 g/l P-sitosterol was studied in a bioreactor. The level of stigmast-4-en-3-one formation achieves 40% after 22 days from the start of the experiment. The ability of therhodococci cells immobilized on technical polymeric tissue to biotransformation of P-sitosterol under alkaline phosphate buffer (pH 7) was studied. R. erythropolis IEGM 487 strain, catalyzing under these conditions the most effective (50%) transformation of the starting substrate to stigmast-4-ene-3-one, was selected. The level of the target product formation depends on the number of carrier units with fixed bacteria (1 cm2 tissue fragments). Comparative studies of sterol biotransformationwith a saturated carbon skeleton in the presence of n-hexadecane or glucose were

conducted.Theability of therhodococci to oxidize 5a-cholestane-3P-ol to 5a-cholestane-3-one was found for the first time. R. erythropolis IEGM 490, IEGM 766, IEGM 1017 and IEGM 1018 strains, exhibiting a high (87-100%) transforming activity towards 5a-cholestane-3p-ol regardless of the source of carbon, were selected.

Keywords: biotransformation,Rhodococcus, immobilisation, sterols, P-sitosterol, stigmast-4-ene-3-one, 5a-cholestane-3p-ol, 5a-cholestane-3-one, pharmacologically active compounds.

Сведения об авторах

Ноговицина Екатерина Михайловна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории алканотрофных микроорганизмов, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН), 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; e-mail: [email protected] Бажутин Григорий Андреевич, магистр первого года обучения естественнонаучного факультета, Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет (ПГГПУ), 614990, г. Пермь, ул. Сибирская, 24; e-mail: [email protected]

Гришко Виктория Викторовна, кандидат химических наук, заведующая лабораторией биологически активных соединений, Институт технической химии УрО РАН (ИТХ УрО РАН), 614013, г. Пермь, ул. Академика Королева, 3; e-mail: [email protected]

Елькин Андрей Анатольевич, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории алканотрофных микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: [email protected]

Тарасова Екатерина Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории алканотрофных микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: [email protected] Кылосова Татьяна Ивановна, аспирант биологического факультета, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15; e-mail: [email protected]

Черемных Ксения Михайловна, аспирант лаборатории алканотрофных микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: [email protected]

Материал поступил в редакцию 21.10.2016 г.