CC BY
16
УДК 57: 579.2
Ключевые слова: индикация, бактерии, штамм, бактериофаги, параметры, реакция нарастания титра фага, материал исследования
Key words: indication, bacteria, strain, bacteriophages, parameters, reaction of phage titer growth, research material
Садртдинова Г. Р.
БИОИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ВИДА KLEBSIELLA OXYTOCA В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАДЗОРА
BIOINDICATIONS OF KLEBSIELLA OXYTOCA BACTERIA IN OBJECTS OF VETERINARY SANITARY OVERSIGHT
ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный агарный университет им. П. А. Столыпина» Адрес: 432017, г. Ульяновск, б. Новый Венец, д. 1
Ulyanovsk State Agrarian University named after. P. A. Stolypin, Federal State Budget Institution of Higher Education
Address: 432017, Ulyanovsk, blvrd Novii Venez, 1
Садртдинова Гузелия Рафиковна, ассистент. Тел. (8422) 55-95-47. E-mail: [email protected]
Sadrtdinova Guzelia R., Assistant. Tel. +7 8422 55-95-47. E-mail: [email protected]
Аннотация. В статье представлены результаты исследований, связанные с изучением возможности использования фагов при индикации бактерий вида K. oxytoca методом реакции нарастания титра фага в объектах ветеринарно-санитарного надзора. В предыдущих исследованиях авторами были установлены оптимальные количественные и качественные параметры постановки реакции нарастания титра фага, разработана схема постановки реакции нарастания титра фага с бактериофагами, строго специфичными в отношении бактерий вида K. oxytoca и обладающие высокой литической активностью. Основным критерием реакции нарастания титра фага является увеличение количества корпускул индикаторного фага в сравнении с контролем. Тест-объектами в проведенных исследованиях выступали образцы воды, комбикорма, фарша, фекалий. Использовали штаммы бактериофагов Кох-9 УГСХА (индикаторная культура - K. oxytoca 86), фаг Кох- 11 УГСХА (индикаторная культура - K. oxytoca 124). Результаты исследований образцов водопроводной воды, фекалий, комбикорма, мясного фарша, искусственно контаминированных бактериями вида K. oxytoca, подтверждают возможность использования метода реакции нарастания титра фага для индикации бактерий вида K. oxytoca в исследуемых субстратах. Искомые бактерии обнаруживались в концентрации 103 м.к./мл за 22 часа. Summary. The article presents the results of studies related to research of the possibility of using phages for indicating bacteria of species K. oxytoca by the method of reaction ofphage titer increase in the objects of veterinary and sanitary supervision. In previous studies the authors established the optimal quantitative and qualitative parameters for the reaction of phage titer growth, a scheme was developed for the reaction of phage titer growth with bacteriophages strictly specific for bacteria of the species K. oxytoca and possessing high lytic activity. The main criterion for the reaction of increasing the phage titer is an increase in the number of corpuscles of the indicator phage in comparison with the control. Test-objects for the conducted studies were samples of water, mixed fodder, minced meat, feces. Bacteriophage strains of Kox-9 UGSHA (indicator culture - K. oxytoca 86), phage Kox-11 UGSHA (indicator culture - K. oxytoca 124) were used. The results of studies of samples of tap water, feces, mixed fodders, minced meat artificially contaminated with bacteria of the species K. oxytoca confirm the possibility of using the phage titer growth reaction method to indicate bacteria of the species K. oxytoca for the test substrates. The required bacteria were detected at a concentration of 10 microbial cells/ml during 22 hours.
Введение
Бактерии рода Klebsiella - третий по частоте грамотрицательный возбудитель инфекций человека и животных. Возбудитель может быть причиной достаточно широкого перечня заболеваний: метритов, маститов, гематогенного остеомиелита, конъюнктивитов, менингитов, сепсисов, острых кишечных инфекций, легочных поражений у животных и человека. Выделение клебсиелл из различных природных источников выража-
ет значимость бактерий рода Klebsiella как микроорганизмов-индикаторов санитарного состояния внешней среды. Широкое распространение клебсиелл в окружающей среде обусловлено выработанной устойчивостью микроорганизма ко многим внешним факторам, в том числе и к антимикробным [2, 8].
Изучением бактериофагов рода Klebsiella занимались разные научные школы как в нашей стране, так и за рубежом (Польша, Венгрия, Великобритания и т.д.) [4]. В этот
период особое значение придавалось разработке методов и схем фагоиндикации. Около 90 % всех проведенных исследований были связаны со штаммами бактерий вида K. pneumoniae, и лишь (3-5) % - с бактериями вида K. oxytoca.
Сущность реакции нарастания титра фага (РНФ) заключается в том, что если в исследуемом материале присутствует искомый возбудитель, то добавленный к такому материалу гомологичный фаг, вступив во взаимодействие с ним, размножится, и последующее увеличение концентрации свободного внеклеточного фага укажет на присутствие в исследуемом материале гомологичного возбудителя [3, 7]. Отличие РНФ от обычных методов исследования в том, что при ее постановке учитываются изменения, происходящие в популяции фага после контакта его с исследуемым субстратом. Обладая высокой специфичностью, фаг размножается только на гомологичных бактериях, не реагируя на присутствие сопутствующей микрофлоры, что позволяет обнаружить возбудителя заболевания без выделения чистой культуры [1].
В настоящее время накоплено немало данных, подтверждающих практическую ценность этого метода перед бактериологическим. Основное преимущество данного метода заключается в сокращении времени проводимых исследований (с 96 часов до 20-30 часов).
Цель исследований заключалась в апробации разработанной схемы биоиндикации бактерий вида K. oxytoca с помощью фагового препарата методом РНФ.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы бактериофагов, активных в отношении бактерий вида K. oxytoca - фаг Кох-9 УГСХА, фаг Кох-11 УГСХА. Индикаторные культуры - штамм K. oxytoca 86 для фага Кох-9 УГСХА, штамм K. oxytoca 124 для фага Кох-11 УГСХА. Для определения возможности использования реакции нарастания титра фага для индикации бактерий вида K. oxytoca в объектах ветеринарно-санитар-ного надзора исследовали образцы воды, комбикорма, фарша, фекалий.
пнкубпрОЕавпг прн37Х,1б часов
Рис. 1. Предлагаемая схема постановки РНФ для индикации бактерий вида К. оху^са
Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.
Критерии оценки показателей РНФ:
- увеличение количества корпускул индикаторного фага в сравнении с контролем в 2,5 раза - сомнительная оценка РНФ;
- увеличение количества корпускул индикаторного фага в сравнении с контролем от 3-х до 5-ти раз - слабоположительная оценка РНФ;
- увеличение количества корпускул индикаторного фага в сравнении с контролем свыше 5-ти раз - положительная оценка РНФ;
- увеличение количества корпускул индикаторного фага в сравнении с контролем более чем в 10 раз - резко положительная оценка РНФ [5, 6].
Протокол исследований:
1. Пробы образцов исследуемого материала (образцы воды, комбикорма, фарша, фекалий) в объеме 5,0 мл/5,0 г вносили в колбы с 50 мл стерильным мясопептон-ным бульоном (МПБ).
2. В колбы с изучаемыми пробами вносили по 1,0 мл индикаторных 18-часовых культур бактерий вида К. оху1оса в разведениях (101-105) м.к./мл. Колбу перемешивали в течение 10-ти минут.
3. Постановку реакции нарастания титра фага проводили согласно предлагаемой выше схеме.
Таблица 1
Увеличение количества фага в искусственно инфицированной бактериями вида
К. оху(оеа пробе воды
Концентрация бактериальной культуры, м.к./мл Концентрация бактериальной культуры, м.к./мл
Кох-9 УГСХА Кох-11 УГСХА
Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз) Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз)
101 4,0+1,31 0,5 3,0+1,05 0,38
102 6,0+1,52 0,75 8,0+2,13 1,0
103 72,0+3,08 9,0 84,0+3,74 10,5
104 полный лизис более 20 полный лизис более 20
105 полный лизис более 20 полный лизис более 20
Контроль 8,0+1,75 - 8,0+1,64 -
Контроль «свободного» фага 0 - 0 -
4. Пробирки, согласно схеме проводимых исследований, помещали в термостат на 5 часов, 37 °С.
5. Через 5 часов инкубирования пробирки вынимали из термостата, содержимое опытных пробирок в количестве 0,25 мл вносили в пробирки с 4,5 мл МПБ (для возможности подсчета негативных колоний в контроле титра индикаторного фага), прогревали на водяной бане для инактивации посторонней микрофлоры (при необходимости содержимое опытных пробирок подвергали фильтрованию (0,22цт)), после чего исследовали методом агаровых слоев.
6. Опытные чашки помещали в термостат на 16 часов.
Результаты исследований
Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 1-4.
Анализируя данные, представленные в таблице 1, отметим, что в образцах воды с фагом Кох-9 УГСХА увеличение титра фага отмечено в 9 раз, с фагом Кох-11УГСХА увеличение титра фага отмечено в 10,5 раз. Увеличение титра фага в сравнении с контролем считаем положительной реакцией.
Результаты экспериментов показали, что в комбикорме, контаминированном бактериями вида К. oxytoca в титрах (101-105), увеличение количества фага отмечено в 1,57 раза (сомнительная реакция) для Кох-9 УГСХА, в 3,2 раза (слабоположительная реакция) -для фага Кох-11 УГСХА. Отметим, что даже
Таблица 2
Увеличение количества фага в искусственно инфицированной бактериями вида
К. оху(оеа пробе комбикорма
Концентрация бактериальной культуры, м.к./мл Изучаемые бактериофаги
Кох-9 УГСХА Кох-11 УГСХА
Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз) Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз)
101 5,0+1,08 0,71 4,0+1,04 0,44
102 7,0+1,56 1,0 5,0+1,13 0,55
103 11,0+2,15 1,57 29,0+3,21 3,20
104 полный лизис более 20 полный лизис более 20
105 полный лизис более 20 полный лизис более 20
Контроль 7,0+1,69 - 9,0+2,30 -
Контроль «свободного» фага 0 - 0 -
Таблица 3
Увеличение количества фага в искусственно инфицированной бактериями вида
К. оху(оеа пробе фекалий
Концентрация бактериальной культуры, м.к./мл Изучаемые бактериофаги
Кох-9 УГСХА Кох-11 УГСХА
Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз) Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз)
101 5,0+1,28 0,63 3,0+1,01 0,33
102 11,0+2,30 1,38 8,0+1,74 0,88
103 69,0+3,61 8,60 33,0+2,83 3,66
104 полный лизис более 20 полный лизис более 20
105 полный лизис более 20 полный лизис более 20
Контроль 8,0+2,15 - 9,0+2,20 -
Контроль «свободного» фага 0 - 0 -
незначительное увеличение числа частиц фага свидетельствует о присутствии в исследуемом материале искомого микроорганизма.
Результаты исследований проб фекалий, контаминированных бактериями £ oxytoca, показали, что увеличение титра индикаторного фага в пробах с фагом Кох-11 УГСХА произошло в 3,66 раза (слабоположительная реакция). С фагом Кох-9 УГСХА увеличение титра отмечено в 8,6 раз.
Результаты исследований (с помощью бактериофагов Кох-9 УГСХА и Кох-11 УГСХА) водопроводной воды, фекалий, комбикорма, мясного фарша, контаминирован-ных бактериями вида £ oxytoca, подтверждают целесообразность применения реакции нарастания титра фага для индикации бакте-
рий вида ^ oxytoca в исследуемых субстратах. Искомые бактерии обнаруживались в концентрации 103 м.к./мл за 22 часа.
Заключение
Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать метод реакции нарастания титра фага для индикации бактерий вида £ oxytoca в различных пробах, контами-нированных указанными бактериями в концентрации 103 м.к./мл при наличии сопутствующей микрофлоры. Данный метод позволяет провести индикацию искомого микроорганизма с сокращением времени исследования (с 96-ти часов по бактериологической схеме до 22-х часов методом фагоиндикации), расхода лабораторной посуды и материалов.
Таблица 4
Увеличение количества фага в искусственно инфицированной бактериями вида
К. оху(оеа пробе мясного фарша
Концентрация бактериальной культуры, м.к./мл Изучаемые бактериофаги
Кох-9 УГСХА Кох-11 УГСХА
Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз) Кол-во колоний фага (М ± т) Увеличение кол-ва фага (раз)
101 2,0+1,11 0,33 3,0+1,17 0,42
102 4,0+1,34 0,66 4,0+1,60 0,57
103 14,0+2,68 2,33 20,0+2,48 2,85
104 полный лизис более 20 полный лизис более 20
105 полный лизис более 20 полный лизис более 20
Контроль 6,0+1,67 - 7,0+2,10 -
Контроль «свободного» фага 0 - 0 -
Список литературы
1. Бульканова, Е. А. Фагоидентификация бактерий рода Klebsiella [Текст] / Е. А. Бульканова, С. Н. Золотухин, Д. А. Васильев // Роль молодых ученых в реализации национального проекта «Развитие АПК». Материалы Междунар. науч.-практич. конф. -М.: Московский государственный агроинженерный университет им. В. П. Горячкина, 2007. - С. 222-225.
2. Золотухин, С. Н. Малоизученные энтеробак-терии и их роль в патологии животных [Текст] / С. Н. Золотухин. - Ульяновск, 2004. - С. 64-75.
3. Катмакова, Н. П. Разработка оптимальных технологических параметров постановки РНФ с биопрепаратом YP - 09 УГСХА [Текст] / Н. П. Катмакова, С. Н. Золотухин, Д. А. Васильев // Естественные и технические науки. - 2009. - № 6 (44). - С. 202-204.
4. Ляшенко, Е. А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов бактерий рода Klebsiella [Текст] / Е. А. Ляшенко// В книге «Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека». - Ульяновск, 2013. - С. 61-74.
5. Ляшенко, Е. А. Индикация бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов
в объектах ветеринарного надзора [Текст] / Е. А. Ляшенко, Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин // В сборнике «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Материалы Междунар. науч.-практич. конф. - 2013. - С. 36-40.
6. Ляшенко, Е. А. Разработка и применение фагового биопрепарата для диагностики клебсиеллёзной инфекции [Текст] / Е. А. Ляшенко, С. Н. Золотухин, Д. А. Васильев // Вестник ветеринарии. - 2011. - №4 (59). - С. 90-92.
7. Пульчеровская, Л. П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 [Текст] / Лидия Петровна Пульчеровская. - Саратов, 2004. -С. 88-89.
8. Садртдинова, Г. Р. Sanitary assessment of environmental objects by isolation of virulent phages [Текст] / Г. Р. Садртдинова, Л. П. Пульчеровская, Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин // Russian journal of agricultural and socio-economic sciences. - 2016. - Т. 58. - № 10. -С.165-170.
ВЕТЕРИНАР.™
Всё о ветеринарии для врачей и владельцев животных
форум
последние новости подборка статей справочники
каталог лекарственных средств адреса ветклиник и зоомагазинов информация о выставках и конференциях анонсы ветеринарных журналов
Заходите на www.veterinaг.ru, и Вы найдёте много интересной и полезной информации!
Приглашаем к сотрудничеству ветеринарных врачей и организации, e-mail: invettainbox.ru boldvrevatamail.ru тел.: 8 (909) 646-76-43, 8 (916) 181-95-58
