CC BY
21Изучение параметров электрокаталитического окисления глюкозы бактериальными клетками вЬиСОМОБЛСТБК ОХУПЛ№ в присутствии медиаторов электронного транспорта
Бабкина Е.Е. (1), Понаморева О.Н. ([email protected] ) (1), Решетилов А.Н. (2), Алферов В.А. (1)
(1)Тульский государственный университет, (2)Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина
Аннотация
Проведены амперометрические измерения электрокаталитического окисления глюкозы клетками ОЫсопоЪаМег вхуёат, иммобилизованными на графитовопастовом электроде, в присутствии медиаторов электронного транспорта (гексацианоферрата (III) калия, и-бензохинона и 2,6-дихлорфенолиндофенола) при различных концентрациях субстрата и медиаторов. Для анализа экспериментальных данных применена математическая модель, основанная на уравнении Михаэлиса-Ментен и учитывающая константы распределения субстрата и медиатора между внутренней средой клетки и анализируемым раствором. Каталитическая активность клеток в присутствии разных медиаторов была охарактеризована тремя параметрами: максимальной скоростью реакции (Д^х) и отношениями константы Михаэлиса к константе распределения для субстрата (К8,клет/К8,р) и для электронного акцептора (КМ,клет/Км,Р). Близкие значения величин Д^^К^^/^клет для трех медиаторов подтвердили правильность выбранной модели. Анализ величин Л^хК^/К^ж-г, количественно характеризующих эффективность медиаторов электронного транспорта, показал, что медиаторные свойства увеличиваются в ряду гексацианоферрат (III) калия, 2,6-дихлорфенолиндофенол, и-бензохинон.
Введение
При разработке биосенсоров рецепторные элементы на основе микроорганизмов могут иметь значительные преимущества по сравнению с ферментными [1, 2]. Биосенсоры на основе целых клеток часто используют для определения БПК, токсических веществ и легко утилизируемых углеводов и спиртов [3]. При использовании синтетических красителей как медиаторов электронного транспорта можно добиться увеличения чувствительности и скорости определения аналита микробным сенсором. Целоклеточ-ные сенсоры, основанные на бактериальной активности при участии медиаторов, были применены для мониторинга окружающей среды [4], определения глюкозы и других моносахаридов [5-7], этанола [8, 9], органических кислот [10] и др. При формировании микробных медиаторных электродов достаточно часто используют бактерии рода 01и-сопоЪа^ег, которые характеризуются уникальной организацией метаболической системы, поверхностной локализацией ряда основных ферментов, осуществляющих неполное окисление углеводных субстратов, высокой оперативностью электрон-транспортной цепи [11]. Указанные особенности явились основой для применения этих бактерий в медиаторных биосенсорах для определения концентрации сахаров, альдоз, спиртов [12, 13]. Медиаторы в сочетании с клетками микроорганизмов используются также при разработке экологически чистых источников электроэнергии - биотопливных элементов [14-17].
Несмотря на многочисленные разработки в области медиаторных электродов на основе целых клеток, лишь некоторые из них были направлены на количественное оп-
ределение каталитической активности таких систем. Так, были предприняты попытки изучения процессов электрокаталитического окисления никотиновой кислоты и глюкозы бактериями Pseudomonas fluoriscens и Gluconobacter industries соответственно [18]. Авторы показали, что каталитическое поведение интактных клеток напоминает поведение оксидоредуктаз, кинетика которых отвечает уравнению Михаэлиса-Ментен. Каталитическую активность бактерий количественно характеризовали с помощью трех параметров: максимальной скорости реакции, отношения константы Михаэлиса к константе распределения медиатора и константе распределения субстрата между внутренней средой клетки и анализируемым раствором. Следует отметить, что в упомянутом исследовании измерения проводились с бактериальными клетками в свободно суспензированном состоянии. При работе с бактериальными суспензиями для каждого измерения требуется новая порция биоматериала, закрепленные же на электроде клетки можно использовать многократно, поэтому в настоящее время исследователи все чаще используют иммобилизованный биологический материал. [19]. Электрокаталитические параметры иммобилизованной биомассы могут заметно отличаться от параметров биомассы в нативном состоянии [20]. Кроме того, материал, используемый при изготовлении рецепторного элемента, может оказывать значительное влияние на субстратную специфичность бактерий [21] и селективность микробного сенсора [9]. Разработка методов количественной оценки эффективности функционирования микроорганизмов как биокатализаторов позволит направленно развивать исследования по созданию микробных биотопливных элементов, а также даст возможность получить дополнительную информацию о ферментативных процессах, протекающих в клетках при физиологических условиях.
Целью данной работы явилось изучение электрокаталитического окисления глюкозы бактериями Gluconobacter oxydans, иммобилизованными на графитовопасто-вом электроде, в присутствии медиаторов электронного транспорта. В задачи исследования входило также моделирование процессов протекающих на медиаторных микробных электродах, позволяющее оценить эффективность медиаторов.
Экспериментальная часть
Формирование микробного электрода. Амперометрический медиаторный электрод формировали, наполняя приготовленной пастой "графитовая пудра-парафиновое масло" пластиковый шприц (объем 1,0 мл; внутренний диаметр 1 мм). Графитовую пасту готовили смешиванием 100 мг графитовой пудры и 40-50 мкл парафинового масла. Шприц содержал серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. Клетки микроорганизмов Gluconobacter oxydans иммобилизовали следующим образом: на поверхность пасты, заполняющей шприц, наносили 3 мкл суспензии клеток (100 мг сырого веса/мл), и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин
Регистрация вольтамперных зависимостей и ответов медиаторных электродов. Измерения проводились с помощью полярографической системы IPC2000, интегрированной с персональным компьютером Intel Pentium 130 МГц. Эксперименты по циклической вольтамперометрии проводили с использованием углероднопастового электрода в качестве рабочего электрода, платиновой проволоки в качестве вспомогательного электрода и хлорсеребряного электрода сравнения. Вольтамперные зависимости регистрировали при скорости развертки потенциала 10 мВ/с.
Зависимости силы тока от времени снимали при постоянном потенциале (для дихлорфенолиндофенола Е=250 мВ, бензохинона Е=200 мВ, гексацианоферрата (III) калия Е=500 мВ). В качестве индикаторного электрода использовался биосенсор, электрода сравнения - хлорсеребряный электрод. Электролитическую ячейку заполняли 4 мл фосфатного буфера (KH2PO4 - K2HPO4, pH=6,5; концентрация солей 30 мМ) с растворенным в нем медиатором. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке. После установления постоянного
уровня тока в ячейку микропипеткой вводилось необходимое для получения заданной концентрации количество 1 М или 0,1 М раствора глюкозы. После каждого добавления субстрата производили промывку ячейки (3 х 4 мл фосфатного буфера).
Результаты и обсуждение
Возможность использования веществ с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами в качестве медиаторов электронного транспорта между биологическими рецепторами и поверхностью электрода изучают с помощью вольт-амперных зависимостей [22].
На рис. 1 показан характер типичных изменений вольт-амперных зависимостей для 2,6-дихлорфенолиндофенола при последующем нанесении бактерий на электрод и добавлении глюкозы в измерительную кювету. Иммобилизация клеток вызывает рост анодной полуволны (рис. 1, кривая b), что может быть связно с окислением на электроде при участии медиаторов электронного транспорта ферментов дыхательной цепи бактерий, функционирующей даже в отсутствии внешних субстратов. Добавление глюкозы в измерительную кювету приводило к дальнейшему росту тока (рис. 1; кривая с). Приведенные на рис. 1 вольт-амперные зависимости и их изменения являются типичными для медиаторных электродов [13]; они наблюдаются при исследовании параметров как ферментных, так и клеточных биосенсоров и могут служить критерием проверки качества электрода - степень увеличения тока в присутствии окисляемого субстрата определяет величину аналитического отклика сенсора.
Аналогичные зависимости были получены с двумя другими медиаторами - гек-сацианоферратом (III) калия и бензохиноном (данные не приводятся). Таким образом, все три соединения (2,6-дихлорфенолиндофенол, гексацианоферрат (III) калия, бензо-хинон) могут служить эффективными медиаторами электронного транспорта при окислении глюкозы клетками Gluconobacter oxydans.
Е, мВ
Рис. 1 Вольт-амперные зависимости графитового электрода: в присутствии 2,6-дихлорфенолиндофенола (а), при нанесении на поверхность электрода клеточной суспензии (b) и добавлении глюкозы, 10 мМ (с).
На рисунке 2 показан типичный вид откликов сенсоров на глюкозу в присутствии разных медиаторов. При введении в кювету глюкозы катодный ток начинал увеличиваться и достигал равновесного состояния через 15, 70 и 150 секунд в присутствии бензохинона, гексацианоферрата (III) калия и дихлорфенолиндофенола соответственно.
1, С
Рисунок 2. Типичные виды откликов сенсоров на основе бактерий ОШеопоЬа^ег охуйат на глюкозу (5 мМ) в присутствии медиаторов
Известно, что клетки микроорганизмов ОЫсопоЪаМег содержат мембранолока-лизованную PQQ-зависимую глюкозодегидрогеназу (ЕС 1.1.99.17) [11], а кинетика окисления глюкозы бактериями ОЫсопоЪа^ег охуёат напоминает поведение оксидо-редуктаз, кинетика которых отвечает уравнению Михаэлиса-Ментен [10]. Исходя из этого, схематически процесс окисления субстратов бактериальными клетками с участием медиатора можно представить следующим образом (рис.3):
Наружная мембрана
Цитоплазма
О,
Рисунок 3. Схематическая модель процесса окисления субстрата бактериальными клетками.
Субстрат (Б) проникает через наружную мембрану клетки к глюкоздегидрогена-зе (ГДГ), расположенной в цитоплазматической мембране, и взаимодействует с ферментом. В результате фермент восстанавливается, и, в свою очередь, отдает электроны молекуле медиатора (Мок) непосредственно или через определенный сайт дыхательной цепи. Этот процесс можно отразить следующей схемой [18]:
к 1 ^ к2 Бклет + Еок,клет ^ ЕБклет-► рклет + Ев,клет
к-1
кз к4
Мок,клет + Ев,клет^* ^ ЕМКлет ^ Мв,клет + Еок,клет (2)
где 8клет и Рклет - субстрат и продукт внутри бактериальной клетки, Мокклет и Мвклет -окисленная и восстановленная форма электронного акцептора внутри бактериальной клетки соответственно, Еокклет и Евклет - фермент, локализованный в цитоплазматиче-ской мембране бактериальной клетки, в окисленном и восстановленном состоянии соответственно.
Кривые I - t (рис. 2) позволяют оценить скорость каталитической реакции окисления глюкозы бактериальными клетками. Скорость реакции это изменение концентрации реагента в единицу времени V = - Д[М]^. Из законов электролиза следует, что концентрация вещества, окисляющегося на электроде, пропорциональна силе тока, следовательно, изменение силы тока прямо пропорционально скорости реакции V = - а ' Д1, т.е. величина Д1 пропорциональна скорости каталитической реакции V.
Исходя из описанной модели, скорость окисления глюкозы можно записать в
виде:
Д1 __Д1 max_
1 + КБ ,клет/Кз, р [Б ] + Км ,клет/Км, р [М ] (3)
где Д max_ ккат,клет [[клет]|;®] (4)
А - площадь поверхности мембраны бактериальной клетки; В - концентрация бактериальных клеток на единицу поверхности электрода.
к _ к 2 к 4 (5)
к кат,клет
к 2 + к 4
К _ к 4 к-1 + к 2 (6)
К Б,клет
к 2 + к 4 к1
К _ к 2 к-3 + к 4 (7)
Км ,клет
к2 + к4 к3
„ _ [[клет] (8)
КБ,р _ [б]
[м ок,клет ] (9)
Км, р _
[м ок ]
К§,р и КМ,Р - константы распределения субстрата и медиатора соответственно между внутренней средой клетки и внешним раствором.
Для трех акцепторов электронов (БХ, ДХФИФ, ГЦФ) были получены ответы сенсора Д1 при варьировании исходной концентрации глюкозы (в условиях избытка медиатора) и концентрации медиатора (в условиях избытка глюкозы). Зависимости, полученные для бензохинона, приведены на рис. 4, 5.
14 12 -10 -8 -
1ä6
S 6
4 2 0
14 12 -
10 -8 -
S 6 ]
4 2 0
10 20 Глюкоза, мМ
10 20 30 Медиатор, мМ
Рисунок 4. Зависимость А1 от концентрации глюкозы для сенсора на основе бактерий ОЫсопоЪаМег охуйат
Рисунок 5. Зависимость А1 от концентрации медиаторов (глюкоза 25 мМ) для сенсора на основе бактерий ОЫсопоЪас-*ег охуйат
Для анализа полученных зависимостей (рис. 4, 5), учитывая, что измерения ведутся при избытке медиатора или глюкозы, можно использовать упрощенные уравнения:
( \
AI = ■
1 + KS
AI max
клет/Ks ,p [S ]
при
AI =
AI m
1 + Km ,клет ¡Km , p [M ок ]
при
Km ,клет1
Km , p [Мак]
Ks ,клет Ks , p [S ]
((1 - избыток медиатора
\
((1 - избыток субстрата
(10)
(11)
Как видно, уравнения (10, 11) - уравнения гиперболы. Путем подстановки в эти уравнения полученных экспериментальных данных (рис. 4, 5) были вычислены значения AImax, Ks^e-r/Ks^ и Км,клет/Км,Р. Полученные параметры представлены в таблице 1. Данные приведены с учетом типа медиатора (одноэлектронный или двухэлектронный).
Из таблицы видно, что величина AImax для БХ в 4 и в 2 раза больше, чем для ДХФИФ и ГЦФ соответственно. Зависимость величины AImax от типа электронного акцептора свидетельствует о том, что существенное влияние на нее оказывает стадия, описываемая константой скорости k4. Таким образом, можно заключить, что величина k4 для бензохинона больше, чем для дихлорфенолиндофенола и гексацианоферрата (III) калия. Это согласуется и с высоким значением К^клет/К^Р для бензохинона. Что касается КМклет/КМр, то ее величина является функцией k3, k-3, k4, а также константы распределения электронного акцептора КМ,Р. Следовательно, трудно выявить главный фактор, определяющий величину КМклет/КМ,Р.
Таблица 1. Значения параметров электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными бактериями Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов электронного транспорта.
Медиа- Условия AImax:> ^,клет/^,р, КМ, клет/КМ,р, AImax^p/ А^хКм^/
тор мкА мМ мМ -К^,клет КМ,клет
ГЦФ ГЦФ 50 мМ 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,0
Глюкоза 1,9 ± 0,1 3,4 ± 0,7 0,6
25 мМ
ДХФИФ ДХФИФ 4 мМ 2,5 ± 0,5 3,0 ± 0,2 0,8
Глюкоза 25 мM 2,6 ± 0,4 0,8 ± 0,1 3,3
БХ БХ 8 мM 8,1 ± 0,2 10,7 ± 0,8 0,8
Глюкоза 25 мM 7,6 ± 0,4 0,9 ± 0,1 8,4
Отношение AImax к KS,raeT/KS,p пропорционально полной константе скорости полуреакции окисления (1), а отношение Imax к Км;клет/Км,Р - полной константе скорости полуреакции восстановления (2). Из уравнений (5-7) следует, что AImaxKS,p/KS;]meT не зависит от типа электронного акцептора, а величина AImaxKM,p/KM,raeT - зависит и дает индекс эффективности электронного акцептора. Величины AI^K^/K^k^ для трех медиаторов похожи (таблица 1), что вытекает из принятой модели. Из анализа величин AImaxKM,p/KM,клет (таблица 1) можно заключить, что эффективность медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду гексацианоферрат (III) калия, 2,6-дихлорфенолиндофенол, и-бензохинон.
Ранее такой же ряд эффективности медиаторов был получен для процессов окисления никотиновой кислоты и глюкозы бактериями Pseudomonas fluorescens и Gluconobacter industries, соответственно, в свободно суспензированном состоянии [18]. Таким образом, иммобилизация бактерий на графитовопастовом электроде не приводит к изменению электрокаталитической активности бактерий.
Следует отметить, что и-бензохинон и 2,6-дихлорфенолиндофенол являются ли-пофильными соединениями, в то время как гексацианоферрат (III) калия - гидрофильным. Липофильность электронного акцептора может играть важную роль, способствуя проникновению в липидные мембраны к активным сайтам мембранлокализованных ферментов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что важным фактором, определяющим эффективность медиатора, является его липофильность.
Благодарности
Исследование было поддержано Российским фондом фундаментальных исследований, грант 01-04-96023 «Закономерности функционирования ферментных систем бактериальных клеток в условиях естественного и электрокаталитического окисления субстратов»
Литература
1. D'Souza S.F. // Biosensors & Bioelectronics 2001. N16. P. 337-353.
2. Racek J. Cell-based biosensors. Lancaster, Technomic Publishing Company, Inc. 1995. 307 p.
3. Riedel К. Enzyme and Microbial Biosensors: Techniques and Protocols. Humana Press, Totowa. 1998.
4. Rawson D. M., Willmer A. J., Turner A. P. F. // Biosensors. 1989. V. 4. P. 299.
5. Katrlik J., Brandsteter R., Svore J., Rosenberg M., Miertus S. // Anal. Chim. Acta. 1997. V. 356. № 2-3. P. 217.
6. Tkac J., Gemeiner P., Svitel ., Benikovski T., Sturdrik E., Vala V., Petrus L., Hrabarova E. // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 420. P. 1.
7. Riedel К., Renneberg R., Liebs P. // Bioelectrochem. Bioenerg. 1988. V.19. P. 137.
8. Ikeda T., Matsuyama К., Kobayashi D., Matsashita F. // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. V. 56. № 4. P. 1359.
9. Tkac J., Vostiar I., Gorton L., Gemeiner G., Sturdik E.// Biosens.Bioelectron. 2003. N18. P. 1125-1134.
10. Takayama К., Kurosaki T., Ikeda T., Nagasawa T. // J. Electroanal. Chem. 1995. V. 381. P. 47.
11. Луста К. А., Решетилов А.Н. // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. T. 34. N 4. C. 339-353.
12. Решетилов А.Н., Мазанова А.А., Китанина Н.В, Гортон Л., Боронин А.М. // Доклады РАН. 1998. N. 358. № 2. C. 263-265.
13. Takayama K., Kurosaki T., Ikeda T. J. // Electroanal. Chem. 1993. N 356. P. 295-301.
14. Pennisi E. // Science. 2002.V.295. P.425.
15. Park D.H., Zeikus J.G. // Applied and Environmental Microbiology. 2000.V.66. № 4. P.1292.
16. Bennetto H.P., Stirling J.L., Tanaka K., Vega C.A. // Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. XXV. P. 559.
17. Tanaka K., Vega C.A., Tamamushi R. // Bioelectrochem. Bioenerg. 1983. V. 11. P. 135.
18. Ikeda T., Kurosaki T., Takayama K., Kano K.//Anal.Chem. 1996. V. 68. P. 192.
19. Lee T., Rhee S.-K., Lee G.M. // Appl. Microbiol. and Biotechnol. 1994. V. 41. № 6. P. 652.
20. Smolander M., Livio H.-L. // Biosens. Bioelectron. 1992. N7. P. 637-643.
21. Понаморева О.Н., Мазанова А. А., Каленюк А. А., Алферов В. А., Решетилов А.Н. // Электронный журнал "Исследовано в России". 13. C. 140-150. 2002 г. http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2002/013.pdf
22. Chi Q.-J., Dong S.-J. // Journal of Molecular Catalysis A: Chemical. 1996. V. 105. P. 193.
