CC BY
45
УДК 543.55:579.222.2
СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕДИАТОРОВ КАК АКЦЕПТОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ ДЛЯ КЛЕТОК D. HANSENII ПРИ ОКИСЛЕНИИ ГЛЮКОЗЫ
А.С. Харькова, А.С. Илюхина, В.А. Арляпов
Биосенсорный анализ был использован для исследования эффективности шести медиаторов электронного транспорта (ферроцен, тионин, нейтральный красный, 2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленовый синий и гексацианоферрат (III) калия) как акцепторов электронов для клеток дрожжей Debaryamyces hansenii. Для исследуемых систем «дрожжи D. hansenii - медиатор» было проведено моделирование в рамках механизма «пинг-понг». На основе параметра 1тах/Км установлено, что наиболее эффективным медиатором электронного транспорта является ферроцен (Imax/Км = 0,011 мкА/мкМ). В рамках механизма «пинг-понг» было проведено сравнение эффективности растворимых медиаторов при функционировании дрожжей в двухмедиаторных системах и выявлен наиболее перспективный медиатор — метиленовый синий (Imax/Км = 0,34 мкА/мкМ).
Ключевые слова: медиаторный биосенсор, механизм «пинг-понг», дрожжи Debaryamyces hansenii
Введение
Медиаторный электронный транспорт широко используется в биоэлектрохимии для разработки биосенсоров [1-3], а также биотопливных элементов [4, 5]. Преимущество использования медиаторных биосенсоров заключается в том, что получаемый аналитический сигнал не зависит от парциального давления кислорода в среде. Использование медиаторов электронного транспорта даёт возможность уменьшить эксплуатационные расходы, поскольку медиатор успешно конкурирует с естественным акцептором электрона - кислородом, и тем самым деаэрация измерительной ячейки не требуется [6].
В качестве биорецепторных элементов медиаторных биосенсоров часто используют прокариотические клетки [1-2]. Это связано с мембранной локализацией ферментативных систем, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта [7]. Дрожжевые клетки применяют сравнительно редко [8]. Одна из причин редкого использования дрожжей в составе биосенсора, по-видимому, связана с тем, что медиаторный перенос электронов от эукариотических клеток на электрод затруднен [8]. Однако, в отличие от бактерий, дрожжи способны окислять более широкий спектр органических соединений и устойчивы к действию различных токсикантов и негативных факторов окружающей среды [9].
В данной работе исследовали эффективность медиаторов электронного транспорта как акцепторов электронов от дрожжевых клеток D. hansenii. Данные эукариоты характеризуются широким спектром окисляемых субстратов и стабильностью ферментативных систем в стрессовых условиях, что делает данные микроорганизмы перспективными биокатализаторами в биотехнологии.
В качестве медиатора использовали ферроцен, феррицианид калия, нейтральный красный, метиленовый синий, 2,6-дихлорфенолиндофенол и тионин [1-5]. Данные соединения успешно используются при создании медиаторных биосенсоров и биотопливных элементах, за счет того что их окислительно-восстановительный потенциал близок к окислительно-восстановительным потенциалам процессов, происходящих в клетках, что делает их успешными акцепторами электронов.
Материалы и методы
Штаммы микроорганизмов. В работе использовали дрожжи Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482, предоставленные Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН, г. Пущино.
Культивирование дрожжевых клеток D. hansenii. Клетки штамма Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Применяли следующий состав жидкой среды: глюкоза (Sigma, США) - 10 г/дм3, пептон (Sigma, США) - 5 г/дм3, дрожжевой экстракт (Sigma, США) - 0,5 г/дм3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атм в течение 45 мин. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 °С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре 10 мин (8000 об/мин). Полученный центрифугат промывали калий-натрий-фосфатным буферным раствором рН=6,8 (20 мМ Na2HPO4 и 20 мМ KH2PO4). Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 мин при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -15 °С. Массы всех порций регистрировали. Для каждой серии опытов использовали новые клетки, размороженные в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем разбавленные 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6,8.
Электроды. Рабочий электрод формировали по методике, описанной в работе [10], наполняя приготовленной пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку с внутренней площадью 6,3 мм2). Угольно-пастовые электроды формировали следующим образом: 100 мг графитовой пудры («Fluka», Германия) смешивали с 40 мкл парафинового масла («Fluka», Германия) и полученной пастой заполняли
пластиковую трубку измерительного электрода. В качестве электрода сравнения применяли насыщенный хлорид серебряный электрод ЭВЛ-1М4 («Эконикс-эксперт», Россия).
Биосенсорные измерения. Измерения выполняли с использованием гальванопотенциостата «1РС-Ш1сго» (ООО «НТФ Вольта», Россия). Для регистрации ответов биосенсора применяли двухэлектродную схему. Рабочим электродом служил графито-пастовый с иммобилизованными клетками О. hansenii, электродом сравнения -насыщенный хлоридсеребряный. Электроды во время измерения погружали в ячейку с калий-натрий-фосфатным буферным раствором рН=6,8 (20 мМ №НР04 и 20 мМ КН2РО4).
Рабочий потенциал выбирали в соответствии с используемой системой [11]. Температура измерения составляла 20 °С, объем ячейки - 5 см3. После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество глюкозы. После каждого измерения производили промывку ячейки буферным раствором.
Результаты и их обсуждения
Для выявления общих закономерностей эффективности переноса заряда на рабочую поверхность угольно-пастовых электродов необходимо установить, какие медиаторы можно использовать в таких системах. В качестве медиаторов были использованы такие соединения, как нейтральный красный, метиленовый синий, тионин, 2,6-дихлорфенолиндофенол, гексацианоферрат (III) калия. Для оценки эффективности медиаторов электронного транспорта, процесс формирования ответа биосенсора в результате окисления клетками дрожжей определяемых веществ в пробе рассматривали в рамках модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг» [12]. Согласно данной модели процессы, протекающие на электроде, можно описать уравнениями (1-2) к1 . к2
S + Еок ES -^ Р + Ев
к-1
кз _ к4
Мок + Ев ^^ ЕМ -- Мв + Еок
к-з
(1)
, (2) где S и Р - субстрат и продукт; Мок и Мв - окисленная и восстановленная формы электронного акцептора;
Еок и Ев - фермент клетки в окисленной и восстановленной формах, соответственно;
к1, к-1, к2, к3, к-3 и к4 - константы скоростей соответствующих стадий реакции.
Общее уравнение скорости двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг», можно записать в виде схемы 3
*2*4 [Е]о
у _ _k2 + k4_ _ _ккат [E]0__(3)
1 + к4 k Л+ k2 k-3 + k4 1 1 + KS — + KM —1— ' к2 + k4 kj [S] к2 + k4 k3 [M] S [S] M [M]
где [S] и [M] - концентрации субстрата и медиатора соответственно; [E] - концентрация ферментного комплекса in vivo; ккат - каталитическая константа реакции;
KS и KM - константы Михаэлиса для субстрата и медиатора соответственно.
При иммобилизации микроорганизмов на электроде в амперометрическом режиме можно оценить скорость электрокаталитического окисления глюкозы дрожжевыми клетками из зависимости изменения стационарного тока при введении окисляемого субстрата от времени (где I - сила тока, t - время). Протекающий в системе ток пропорционален скорости реакции, а выражение (3) запишется в виде уравнения
I _-^-р, (7)
1 + KS — + KM-
S [ S ] M [M ]
где I _ nFAkkat [E]. (8)
Из уравнения (7) следует, что процесс электрокаталитического окисления субстратов дрожжами в присутствии медиаторов переноса электронов можно охарактеризовать тремя параметрами - максимальным током биоэлектрокаталитического окисления Imax и константами Михаэлиса по KS субстрату и медиатору KM.
При условии избытка медиатора или субстрата уравнение (7) можно упростить и получить уравнения типа Михаэлиса-Ментен:
I _-Imax 1— (при KS «1 - избыток субстарата); (9)
1 + Km
[M ]
I =—1тах- (при КМ —1— « 1 - избыток медиатора) . (10)
1 + К^ [М ]
Путем обработки полученных экспериментально зависимостей генерируемого тока I при варьировании концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора и концентрации медиатора в условиях избытка глюкозы по уравнениям (9) и (10) можно вычислить значения К и Км.
Сложность работы с дрожжами О. hansenii заключалась в том, что из всех исследуемых медиаторов электронного транспорта
зарегистрировать окисление глюкозы удалось только в присутствии медиатора нейтрального красного, ранее было показана возможность использования медиатора ферроцена совместно с дрожжами Э. hansenii в биоэлектрокатализе [11]. Поэтому эффективность использования нейтрального красного как медиатора электронного транспорта сравнивалась относительно ферроцена в рамках модели «пинг-понг». Градуировочные зависимости ответа сенсора от концентрации медиатора и
субстрата представлены на рис. параметры - в табл. 1.
1, а основные физико-химические
Концентрация медиатора, мкмоль/дм
а
50 100 150 200
Концентрация глюкозы, мкмоль/дм^
б
Рис. 1. Гиперболическая зависимости ответа сенсора (или скорости ферментативной реакции окисления глюкозы) от концентрации: а - медиатора (при избытке окисляемого субстрата), б - глюкозы (при избытке медиатора. 1 - ферроцен, 2 - нейтральный красный)
Оценку эффективности двух медиаторов, способных взаимодействовать с дрожжами D. hansenii проводили по величине отношения Imax/KM. Ферроцен как медиатор обладал более высоким значением параметра Imax/KM, а следовательно, биосенсор на его основе способен генерировать больший аналитический сигнал при использовании меньших количеств медиатора.
Проблема использования дрожжевых клеток в медиаторном биоэлектрокатализе связана со строением эукариот - ферментные системы зачастую локализованы внутри микроорганизма (в цитоплазме или органеллах), что затрудняет взаимодействие с медиаторами переноса электронов. Например, в статье [8] показано, что для дрожжей рода Candida из десяти медиаторов перенос электронов был могут осуществлять только гексацианноферрат (III) калия и гидроксиферроцен.
Одним из подходов к решению проблемы низкой эффективности медиаторов как акцепторов электронов для дрожжевых клеток является использование двухмедиаторных систем [3, 8]. В данной работе для
увеличения эффективности переноса электронов от эукариотических клеток в исследуемую систему вводили второй медиатор - ферроцен.
Было выдвинуто предположение, что тионин, нейтральный красный, метиленовый синий, 2,6-дихлорфенолиндофенол как липофильные соединения способны проникать через липидную мембрану внутрь клетки, взаимодействовать с восстановленной формой фермента, забирать электроны и передавать их на иммобилизованный медиатор, который переносит электроны на электрод. Схема переноса электронов в двухмедиаторной системе приведена на рис. 2.
Рис. 2. Схема переноса электронов в двухмедиаторной системе
Эффективность растворимых медиаторов в биоэлектрокатализе в присутствие медиатора ферроцена рассматривалась также в рамках модели «пинг-понг». Для каждого медиатора были получены градуировочные зависимости при условии избытка субстрата и избытка медиатора, представленные на рис. 3.
В рамках модели «пинг-понг» отношение 1тах/К характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом, соответственно, для ферментативного биоэлектрокатализа независимость данного отношения от природы медиатора указывало на пригодность выбранной модели для сравнения эффективности медиаторного биоэлектрокатализа. Ранее было показано, что для медитаров фенозинового ряда отношение 1тах/К также различалось для бактерий О. oxydans [13], что связано с недостаточной устойчивостью феназиновых производных в растворе. Кроме того, при бимолекулярном взаимодействии фермента с субстратом высокая концентрация медиатора может ингибировать данный процесс, снижая параметр 1тах/К
Концентрация медиатора, мкмоль/дм-
а
2 4 6 Концентрация глюкозы, мкмоль/дм-1
б
Рис. 3. Гиперболическая зависимости ответа сенсора (или скорости ферментативной реакции окисления глюкозы) от концентрации: а - медиатора (при избытке оксиляемого субстрата), б - глюкозы (при избытке медиатора). 1 - тионин, 2 - гексацианоферрат (III) калия, 3 - метиленовый синий, 4 - 2,6-дихлорфенолиндофенол,
5 - нейтральный красный.
Таблица
Параметры электрокаталитического окисления глюкозы иммобилизованными дрожжами Б. hansenii в присутствии
Медитор Избыток субстрата Избыток медиатора
Imax, мкА мкМ Imax/Km, мкА/мкМ Imax, мкА мкМ Imax/Ks, мкА/мкМ
Нейтральный красный* 0,064± 0,005 75±9 0,001 0,069± 0,009 100± 20 0,001
Ферроцен* 0,57±0,02 52±7 0,011 0,37± 0,04 90± 10 0,004
гр ** Т ионин 1,6±0,1 11,4±0,2 0,15 0,95± 0,05 7,9± 0,2 0,12
Гексацианоферрат (III) ** калия 0,68±0,05 4,5±0,7 0,15 0,66± 0,06 8,7± 0,7 0,06
Метиленовый синий** 0,34±0,02 1,0±0,2 0,34 0,42± 0,06 7,0± 0,8 0,06
2,6- Дихлорфенолиндофенол ** 0,29±0,04 4,3±0,4 0,07 0,39± 0,02 9,1± 0,4 0,04
Нейтральный красный** 0,29±0,01 2,7±0,3 0,11 0,21± 0,07 7,6± 0,1 0,03
* В одномедиаторной системе
** В двухмедиаторной системе
Отношение 1тах/Км может использоваться для оценки эффективности медиаторов в двухмедиаторной системе, так как учитывается и максимальный ответ биосенсора, который можно получить с использованием определенного растворимого медиатора, и количество медиатора, которое для этого необходимо применять. Чем выше значение 1тах/Км, тем больший аналитический сигнал способен генерировать биосенсор при использовании меньших количеств медиатора.
Из анализа величин 1тах/Км таблицы можно заключить, что эффективность растворимых медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду 2,6-дихлорфенолиндофенол < нейтральный красный < тионин ~ гексацианоферрат (III) калия < метиленовый синий. Следует также отметить, что при использовании двухмедиаторных систем параметр 1тах/Км увеличивается на порядок, что указывает на повышение эффективности переноса электронов в присутствии второго медиатора. Вероятно, растворимый медиатор быстро восстанавливался клетками О. hansenii, а нерастворимый подвергался быстрому электрохимическому окислению [14]. Возможность использования ферроцена совместно с растворимыми медиаторами, которые функционируют только в двухмедиаторной системе, подтверждает предположенную схему.
Заключение
На основе результатов биосенсорного анализа эффективности шести медиаторов электронного транспорта (ферроцен, тионин, нейтральный красный, 2,6-дихлорфенолиндофенол, метиленовый синий и гексацианоферрат (III) калия), как акцепторов электронов для клеток дрожжей Оebaryamyces hansenii, было установлено, что для исследуемых систем «дрожжи - медиатор» наиболее эффективным медиатором электронного транспорта является ферроцен (!тах/Км = 0,011 мкА/мкМ).
В рамках механизма «пинг-понг» было проведено сравнение растворимых медиаторов как акцепторов электронов при функционировании дрожжей в двухмедиаторных системах. Было установлено, что эффективность растворимых медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду 2,6-дихлорфенолиндофенол < нейтральный красный < тионин ~ гексацианоферрат (III) калия < метиленовый синий. Таким образом, наиболее перспективным растворимым медиатором для формирования двухмедиаторных систем является метиленовый синий (!тах/Км = 0,34 мкА/мкМ).
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ и Правительства Тульской области № 16-48-710959 р_а (договор ДС/44).
Список литературы
1. Hu J.S., Gao G.F., Xia S.L. A Mediated BOD Microsensor Based on Poly (Neutral Red) and Bacteria Modified Interdigited Ultramicroelectrode Array // International journal of electrochemical science. 2016. V. 11. №. 7. P. 6387-6402.
2. A redox mediated UME biosensor using immobilized Chromobacterium violaceum strain R1 for rapid biochemical oxygen demand measurement / K. Hooi, A. Ismail, R. Ahamad [at al]. //Electrochimica Acta. 2015. V. 176. P. 777-783.
3. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute biotoxicity assessment of wastewater / G. Gao, D. Fang, Y. Yu [et al.] //Talanta. 2017. V. 167. P. 208-216.
4. Toxicity detection in water containing heavy metal ions with a self-powered microbial fuel cell-based biosensor / D. Yu, L. Bai, J. Zhai [et al.] //Talanta. 2017. V. 168. P. 210-216.
5. Choi O.T., Sang B. I. Extracellular electron transfer from cathode to microbes: application for biofuel production // Biotechnology for biofuels. 2016. V. 9. №. 1. P. 1-14.
6. A new mediator method for BOD measurement under non-deaerated condition / L. Liu, L. Shang, C. Liu [et al.] //Talanta. 2010. V. 81. №. 4-5. P. 1170-1175.
7. Detection of two distinct substrate-dependent catabolic responses in yeast cells using a mediated electrochemical method / K. Baronian, A. Downard, R. Lowen [et al.] //Applied microbiology and biotechnology. 2002. V. 60. №. 1. P. 108-113.
8. Characterization of two novel yeast strains used in mediated biosensors for wastewater / S. P. Trosok, J.H. Luong, D.F, Juck [et al.] // Canadian journal of microbiology. 2002. V. 48. №. 5. P. 418-426.
9. Baronian K. H. The use of yeast and moulds as sensing elements in biosensors // Biosensors and bioelectronics. 2004. V. 19. №. 9. P. 953-962.
10. Зайцева А. С., Арляпов В. А., Решетилов А. Н. Медиаторный биосенсор на основе микроорганизмов активного ила для экспресс-определения низких значений БПК5 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2017. Т. 13. №. 1. С. 50-57.
11. A novel BOD-mediator biosensor based on Ferrocene and Debaryomyces hansenii yeast cells / A. S. Zaitseva, V.A. Arlyapov, N. Yu. Yudina [et al.] //Applied Biochemistry and Microbiology. 2017. V. 53. №. 3. P. 381-387.
12. Measurements of Oxidoreductase-like Activity of Intact Bacterial Cells by an Amperometric Method Using a Membrane-Coated Electrode / T.
Ikeda, T. Kurosaki, K. Takayama [et al.] // Analytical Chemistry. 1996. V. 68. №. 1. P. 192-198.
13. Каманин С.С. Биосенсоры на основе модифицированных печатных электродов для контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга: дис.... канд. хим. наук. М., 2015. 120с.
14. Tanaka K., Vega C., Tamamushi R. Thionine and ferric chelate compounds as coupled mediators in microbial fuel cells //Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1983. V. 11. №. 4-6. P. 289-297.
Зайцева Анна Сергеевна, аспирант, Anyuta 7мytsevaaimail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Илюхина Анастасия Сергеевна, студент, ilyuhina.nastyaaimail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет.
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент, v. a. arlyapov@gmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
COMPARISON OF EFFICIENCY OF MEDIATORS AS ELECTRON ACCELERATORS FOR D. HANSENII CELLS IN GLUCOSE OXIDATION
A.S. Kharkova, A.S. Ilyukhina, V.A. Arlyapov
Biosensor analysis was used to study the effectiveness of six mediators of electronic transport (ferrocene, thionine, neutral red, 2,6-dichlorophenolindophenol, methylene blue and hexacyanoferrate (III) potassium), as electron acceptors for Debaryamyces hansenii yeast cells. For "yeast D. hansenii mediator" systems was modeled within the "ping-pong" mechanism. Based on the Imax/Км parameter, it has been established that ferrocene is the most efficient mediator of the electron transport (Imax/Км = 0.011 ^A/^M). In the framework of the "ping-pong" mechanism, the effectiveness of soluble mediators was compared with the functioning of yeast in two-mediator systems and the most promising mediator, methylene blue (Imax/Км = 0.34 ^A/^M), was detected.
Key words: mediator biosensor, "ping-pong" mechanism, yeast Debaryamyces han-
senii.
Kharkova Anna Sergeevna, post-graduate student, Anyuta Zaytsevaaimai/.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Ilyukhina Anastasia Sergeevna, student, ilyuhina.nastyaaimail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v.a.arlyapovai gmail. com, Russia, Tula, Tula State University
