CC BY
39
-
изучение IN vivo природного
иммуномодулирующего средства «динормин»
Лисицын А. Б., академик РАН, Люблинская Л. А., канд. хим. наук, Федулова Л. В., канд. техн. наук, Василевская Е.Р., Чернуха И. М., доктор техн. наук, Макаренко А. Н., доктор мед. наук * ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова» *Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко
П настоящий момент промышленные свиноводческие УДК 619:615.24
В комплексы и крупные специализированные фермы с Ключевые слова:
законченным циклом воспроизводства характеризуются «Динормин», мясной продукт,
высокой концентрацией животных на достаточно иммунодефицит, тканеспециф
ограниченных площадях. м°делир°вание
Разнообразные стресс-факторы антропогенной природы вызывают нарушение обменных процессов, снижение естественной резистентности свиней и, как следствие, проявление вторичных иммунодефицитов, что приводит к повышению восприимчивости животных и массовой заболеваемости желудочно-кишечными и респираторными болезнями. Особенно это касается поросят-сосунов и отъемышей [1]. По официальной статистике в 2012 году только незаразными болезнями заболело 8026,4 тыс. поросят, при этом гибель животных зарегистрирована в 16, 3% случаев. Причем, из общего количества павших животных на долю молодняка приходилось 89,9%, в том числе падёж от желудочно-кишечных болезней составил 57,5%, от респираторных патологий - 29% [2].
В системе ветеринарных мероприятий все большую актуальность приобретает применение препаратов различных типов, направленных на повышение резистентности молодняка и профилактики факторных (условно-патогенных) инфекционных заболеваний: адаптогены, стресс-корректоры, антиоксиданты, про-биотики, детоксиканты, иммуномодуляторы различного происхождения [1, 2]. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке насчитывается около 20 веществ, обладающих иммуностимулирующей активностью. Для всех препаратов рассматриваемой группы основной проблемой является гиперчувствительность животных к компонентам терапевтических средств и их возможное трофическое накопление. Препараты данной группы по-разному воздействуют на организм при патологических состояниях.
Широкое применение в ветеринарии получили: 1- и В-активины, тимоген [4, 5, 6], тиосульфат натрия, препараты нуклеиновых кислот, аллогенная иммунная сыворотка, неспецифические иммуноглобулины, микроэле-
ичные
менты, в том числе селенсодержащие и т.п. [7, 8, 9].
Многие проявления вторичных иммунодефицитов основаны на гибели клеток иммунной системы по механизмам некроза и апоптоза. Как правило, гомео-статический контроль внутренней среды достаточно действен, чтобы защитить клетки иммунной системы от негативных воздействий. Воздействие внешних факторов и болезнетворных агентов провоцирует гибель клеток иммунной системы (в первую очередь лимфоцитов) по механизму апоптоза. Важным фактором, определяющим чувствительность клеток к этому воздействию, становится экспрессия внутриклеточных факторов защиты. При недостаточности факторов гуморального иммунитета возникает необходимость в стимуляции их выработки либо в поступлении дополнительных агентов извне. Например, мышиный интерферон имеет биологическую активность, равную 2х109 ед|мг, из чего следует, что одной молекулы интерферона достаточно, чтобы сделать клетку резистентной к действию вируса [10].
Иммуномодуляторы природного и синтетического происхождения влияют на универсальные звенья клеточной и гуморальной регуляции. Подобный механизм действия способен привести к восстановлению нарушенной функциональной активности иммунокомпетен-тных клеток и органов и обосновывает их применение как в иммунотерапии, так и в вакцинопрофилактике [11, 12]. Профилактика многих инфекционных болезней заключается в массовой иммунизации. Большую практическую значимость имеет одновременное эффективное применение вакцин и средств с иммуностимулирующей активностью [13, 14].
Промышленная технология выращивания сельскохозяйственных животных нуждается в экологически безопасных иммуномодуляторах, активизирующих
неспецифический иммунитет и нормализующих гомео-стаз. Исходя из выше изложенного, актуален поиск природных средств эффективной иммунопрофилактики и иммуноориентированной терапии с целью восстановления нарушенных функций иммунной системы и обеспечения устойчивости животных к отрицательному многофакторному воздействию окружающей среды.
Данная работа направлена на изучение иммуно-биологически активных компонентов лечебно-профилактического средства, получаемого из иммунокомпе-тентных органов и тканей свиней, а также изучение его терапевтического эффекта in vivo на модели вторичного иммунодефицита.
Важным преимуществом подобных препаратов является то, что, будучи классическими иммуномо-дуляторами, они одновременно реализуют иммунный ответ клеточного типа с накоплением эффекторных лимфоцитов. Данные препараты могут быть широко применены при самых различных проблемах и патологиях, позволяя избегать аллергических реакций и накопления токсических соединений в тканях организма [15].
Концепция действия органопрепаратов базируется на феномене гомологичности, или органного тропизма, реализуя принцип «подобное лечится подобным». По литературным данным [16, 17] происходит обновление клеток и межклеточного вещества за счет «пробуждения» региональных клеток, восстановление клеточной проницаемости, противовоспалительное действие. Использование исследуемого средства может способствовать повышению устойчивости клеток организма к патогенным воздействиям и изменениям внешней и внутренней среды.
«Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №15-16-00008)».
Материалы и методы
Объект исследования - комплексное средство «Динормин», представляющее собой смесь лио-фильно-высушенных водно-солевых экстрактов тканей иммунокомпетентных органов свиньи (тимус, селезенка и мезентеральные лимфатические узлы), полученные после забоя животных промышленным образом [18, 19].
Эксперимент выполнен на крысах-самцах стока Wistar, средней массой (220 ± 5) г (n=38). Первые четырнадцать суток животным моделировали вторичный иммунодефицит путем воздействия стресс-факторов (повышенный шумовой фон (80-90 Дб); принудительное плавание с грузом (10% массы тела) и внутрибрюшин-ным введением препарата «Циклофосфан®» («ЛЭНС-Фарм», Россия), в дозе 75 мг/кг, трехкратно каждые 72 часа. На двенадцатые сутки животных распределяли по
принципу парных аналогов на 2 группы - опытную и контрольную. Начиная с четырнадцатых суток и вплоть до завершения эксперимента, крысам опытной группы ежедневно внутрижелудочно вводили средство «Динормин» (5 мг/кг массы). Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в равном объеме. Продолжительность эксперимента составила 28 суток.
Общее клиническое исследование проб крови проводили на полностью автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе Abacus juniorvet 2.7 (Австрия). Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BioChem SA (США). Иммуно-ферментные показатели оценивали на анализаторе Immunochem 2100 (США) с использованием наборов видоспецифичных реактивов ELISA (rat). Исследования на лабораторных животных проводили в соответствии с Международными правилами гуманного обращения с животными. Математическая обработка данных включала расчет средних значений со стандартными ошибками (M ± m).
Результаты исследования
По результатам эксперимента, проведенного на лабораторных животных, была подтверждена адекватность выбранной модели иммуносупрессии. Гематологический анализ крови животных с иммунодефицитом подтверждает факт снижения фагоцитарной активности лейкоцитов, повреждения различных популяций лимфоцитов, снижение способности лимфоцитов к бласттрансформации. По данным иммуноферментного анализа, дефективность супрессорных клеток приводит к недостаточности выработки иммуноглобулинов и интерферонов, содержание данных факторов иммунитета в крови больных животных снижено (IgM, IgG на 7,3 и 29,7%; IFN A, IFN В на 12,7 и 16,8% соответственно) (табл.1). Угнетение иммунологических реакций организма также косвенно подтверждает деградация тимуса и селезенки (выявлено уменьшение относительных масс органов на 7,7% и 15,2%, соответственно).
Внутрижелудочное введение животным с моделью иммунодефицита лечебно-профилактического средства «Динормин» позволяет нивелировать первичные признаки заболевания, вероятно, за счет активации у животных неспецифического иммунитета. Отмечена некоторая инерция в иммунном ответе организма животного, что, по-видимому, связано с временем, необходимым активным соединениям для инициации защитных механизмов клетки против вируса. Выявлена интенсификация рециркуляции лимфоцитов в селезенке, о чем свидетельствует понижение их количества на фоне восстановления функций селезенки (табл. 1). Содержание лейкоцитов в крови в
пределах физиологической нормы свидетельствует о завершении патологических процессов в организме и нормализации фагоцитарной активности (на 41,9% выше параметров животных контрольной группы). Кроме того, повышение количества гранулоцитов в 3,9 раза и снижение содержания тромбоцитов на 4,3% (относительно контрольной группы) на фоне нормализации лейкоцитов говорит о возможном устранении признаков иммуносупрессивного состояния, вызванного использованием цитостатического препарата. Отмечено увеличение количества иммуноглобулинов М класса на 41,8% выше физиологической нормы, и иммуноглобулинов G класса на 5,4% относительно животных контрольной группы, что свидетельствует о реакции иммунного ответа в гуморальной форме, стимулированной антигенными детерминантами. Система макрофагов у животных второй группы проявила повышенную активность в выработке интерферонов а и в (на 19,3 и 23,2% выше физиологической нормы, соответственно), что в совокупности с повышенным содержанием лейкоцитов свидетельствует о стимуляции иммунной системы для коррекции состояния индуцированного иммунодефицита.
Увеличение содержания иммуноглобулинов М и G класса может происходить в связи с ростом количества В-лимфоцитов, на поверхности которых содержится большое количество иммуноглобулиновых детерминант, что подтверждается гранулоцитозом у животных опытной группы. Вероятно, происходит активизация тимусозависимых лимфоцитов с иммуноглобулинами на их поверхности. Восстановление физиологической функции тимуса косвенно подтверждает увеличение относительной массы тимуса, на 7,6% по сравнению с физиологической нормой и на 14,3% по сравнению с животными контрольной группы.
Биохимический анализ сыворотки крови животных с иммунодефицитом показал повышение активности аспартатаминотрансферазы (АсАт), увеличение содержания креатинина и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), снижение содержания гамма-глютамилтранспепти-дазы (ГГТ). У животных опытной группы нивелирование иммунодефицитного состояния выражалось в нормализации активности АсАт, креатинина на фоне уменьшения количества мочевины и АлАт. Повышение уровня ГГТ у животных опытной группы относительно физиологической нормы, возможно, указывает на интенсификацию процессов диссимиляции индуктора заболевания «Циклофосфана®». Эти данные косвенно свидетельствуют о восстановлении функций мочевыделительной системы (печени и почек) при развитии иммунодефицита.
Таблица 1. Показатели сыворотки крови подопытных
животных
Параметры Норма Группы животных
Динормин Дист. вода
Гематологические показатели
Лейкоциты, 109/л 6,6-12,6 8,39±4,112 4,87±2,41
Лимфоциты, 109/л 4,78-9,12 3,16±1,182 4,99±0,01
Сод-е смеси моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток, 109/л 0,02-0,15 0,14±0,063 0,07±0,04
Гранулоциты, 109/л 1,77-3,38 5,90±3,063 1,51±0,06
Тромбоциты, 109/л 631-719 735,7±75,32 768,0±25,4
Биохимические показатели
Креатинин, мкмоль/л 9-70 48,63±1,023 65,4±1,41
Мочевина, ммоль/л 4,28-8,57 5,98±0,362 6,21±0,11
ЛДГ, Ед/л 50-700 203,85±36,861 279,65±1,77
АсАт, Ед/л 20-100 97,58±13,302 118,10±8,20
АлАт, Ед/л 10-80 31,63±2,252 40,20±3,82
Щелочная фосфатаза, Ед/л 70-450 166,58±51,982 169,5±26,87
ГГТ, Ед/л 0-4 5,67±0,122 3,51±0,08
Иммуноферментные показатели
1дМ, мг/л 411±137 582,8±155,11 380,9±17,1
ДО, г/л 4,98±1,37 3,7±1,11 3,5±0,1
1РЫ А, пг/мл 55±8 65,6±5,11 48,0±9,1
1РЫ В, пг/мл 47±4,3 57,9±5,41 39,1±13,2
'достоверное различие между опытной и контрольной группами р<0.05
Достоверное различие между опытной и контрольной группами р<0.01
Достоверное различие между опытной и контрольной группами р<0.001
Обсуждение результатов
В опытах на лабораторных животных установлено, что терапевтическое средство «Динормин» позволяет нивелировать патологические процессы, протекающие в организме крыс с моделью вторичного иммунодефи-цитного состояния. В результате эксперимента показана положительная динамика, выраженная в повышенной выработке интерферонов а и в и иммуноглобулина G. Также выявлена нормализация гематологических и биохимических показателей крови - усиление рецирку-
ляции лимфоцитов, инволюция содержания лейкоцитов и фагоцитарной активности; отмечено восстановление функций печени и почек, на что указывает приближение к верхней границе нормы концентрации АсАт и креати-нина, снижение содержания ЛДГ и мочевины по сравнению с контрольными животными.
Таким образом, «Динормин» можно рассматривать как препарат-индуктор, который, при попадании в организм с ослабленной иммунной системой, стимулирует выработку эндогенных защитных факторов, таких как интерфероны и иммуноглобулины. |
контакты
Лисицын Андрей Борисович Люблинская Людмила Ароновна Федулова Лилия Вячеславовна Василевская Екатерина Романовна Чернуха Ирина Михайловна Макаренко Александр Николаевич +7 (495)676-921 1
список литературы:
1. Прудников С.И. Факторные инфекционные болезни свиней и их профилактика на крупных комплексах и специализированных фермах/ Прудников С.И. // Сб. науч. тр. Сибиркого отделения РАСХН, 2000. С. 3-8.
2. «Эпизоотическая ситуация в мире и в Российской федерации в 2011-2012 гг», Москва, 2012
3. Шахов, А.Г. Респираторные болезни телят / А.Г. Шахов// Эколого-адаптационная стратегия защиты здоровья и продуктивности животных в современных условиях.- Воронеж: ВГАУ, 2001.- С. 136-155.
4. Беляев, В.И. Т-активин стимулятор роста поросят / В.И. Беляев, Е.Л. Сартасов // Ветеринария. - 1992.-№ 7-8. - С. 52-53.
5. Anisimov V. N. Effect of synthetic dipeptide Thymogen on life span and spontaneous tumor incidence in rats/ Anisimov V. N., Khavinson V. Kh., Morozov V. G. // The Gerontologist. 1998. Vol. 38. P. 7-8.
6. Maryam Hamzeh-Mivehroud. Phage display as a technology delivering on the promise of peptide drug discovery/ Maryam Hamzeh-Mivehroud, Ali Akbar Alizadeh, Michael B. Morris, W. Bret Church, Siavoush Dastmalchi//Drug Discovery Today Volume 18, Issues 23-24, December 2013, Pages 1144-1157
7. Алименко А.Н. Записки практического врача о применении диметилдипиразолилселенида (селекора) в качестве базового компонента лечебно-профилактических комплексов / А.Н. Алименко // Соединения селена и здоровье. М., 2004. - С. 123-129.
8. Евреинов А.Г. Селекор в звероводстве / А.Г. Евреинов // Соединения селена и здоровье. М., 2004. - С. 172-176.
9. Неворотин, А.И. Исследование возможности применения диметилдипираюлилселенида для предотвращения похудания животных при ухудшении питания / А.И. Неворотин // Соединения селена и здоровье. М., 2004. - С. 178-180.
10. Грин Н. Биология. В 3-х т. Т. 2 / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор. - Москва. - Мир. - 1990 - 325 c.
11. Ильясова Г.Ф. Гетерогенность влияния ксимедона на антителообразование против герпесвируса псевдобешенства / Г.Ф. Ильясова, А.П. Цибулькин, Г.Х. Ильясова // докл. III съезда иммунологов и аллергологов СНГ. Сочи. - 2000. С. 56 - 58.
12. Цибулькин, А. П. Иммуностимуляторы в профилактике герпетической инфекции /А.П. Цибулькин, Г.Ф. Ильясова, Г.Х. Ильясова// Объединенный иммунологический форум Russian Jornal of Immunology.- V.9. - S. 1. - 2004. - C.344
13. Кабиров, Г.Ф. Кормовые добавки: влияние на клинические, гематологические, биохимические и иммунологические показатели свиней / Г.Ф. Кабиров, Р.Х. Юсупов // Ветеринарный врач. Казань. - 2002. - №4.- С. 70-72.
14. Корсакова, E.H. Оптимизации специфической профилактики инфекционных болезней у телят в зонах «экологического риска» / E.H. Корсакова // Ветеринария сельскохозяйственных животных. - 2008. - №1. -С.37-43.
15. Чернуха И.М. Исследование терапевтических свойств препарата «Колимак» на лабораторных животных/ Чернуха И.М., Люблинская Л.А., Федулова Л.В., Василевская Е.Р., Макаренко А.Н.// Все о мясе. - 2013. - № 5. - С. 40-42.
16. Княжеченко Е.В. Омолаживающие эффекты органопрепаратов на кожные покровы./ Княжеченко Е.В., Ролик И.С. // Натуральная фармакология и косметология. - 2004.- №2. - С. 12-16.
17. Неведрова Н.Л. Потенцированные органопрепараты при патологии мочевыводящих путей у детей./ Неведрова Н.Л. // Итоги и перспективы развития традиционной медицины в России.- М.: МЗ РФ.- 2002.- С.236-238.
18. Макаренко А.Н. Способ получения средства для лечения диареи у сельскохозяйственных животных, средство для лечения диареи у сельскохозяйственных животных и способ лечения диареи/ Макаренко А.Н., Чернуха И.М., Лисицын А.Б., Золотухин В.И., Загорельский В.Н. // Заявка от № 20071248/13 от 03.07.2007 (RU 2351345).
19. Изучение природы действующего вещества препарата «Динормин» для профилактики и лечения иммунодефи-цитных состояний поросят/ Чернуха И.М., Люблинская Л.А., Федулова Л.В., Василевская Е.Р., Макаренко А.Н., Тимохина Е.А.// Все о мясе. - 2014. - № 6. - С. 36-39.
