CC BY
42
ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДЫ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ПРЕПАРАТА «ДИНОРМИН»
ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ ПОРОСЯТ
Чернуха И.М., доктор техн. наук, Люблинская Л.А., канд. хим. наук, Федулова Л.В., канд. техн. наук, Василевская Е.Р., Макаренко А.Н.*, доктор мед. наук, Тимохина Е.А., канд. хим. наук** ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
*Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, Киев **ФГБНУ ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
ШЭ современных условиях производства животноводческой продукции, В повышенным требованием к ее качеству и безопасности, связанны/х с профилактикой и лечением животны/х, а также дальнейшим повышением их продуктивности, все большую актуальность приобретает использование различны/х натуральных кормовых добавок. Биологические особенности свиней, а именно скороспелость, многоплодие, высокий убойный выход мяса и др., определяют высокую рентабельность промышленного свиноводства. Однако в современных условиях интенсивного ведения данной отрасли животноводства возникают различные проблемы, связанные с действием стресс-факторов на животное в процессе индивидуального развития.
УДК 636.4:619:615.24 Ключевые слова:
«Динормин», поросята, иммунодефицит, аминокислота, электрофорез
Экологические,технологические, климатические, антропогенные и прочие факторы резко изменяют среду обитания животных, способствуют ослаблению адаптационных процессов, в связи с чем у животных развиваются иммунодефицитные состояния [1]. В первую очередь это относится к молодняку свиней, особенно поросятам в период первого месяца постнаталь-ного развития. В период адаптации новорожденного организма к новым условиям происходит активация структурной организации клеток и тканей пищеварительной, эндокринной, иммунной и других систем организма. Нарушение условий кормления и содержания животных, стресс-факторы, вызывают структурно-функциональные изменения, в первую очередь, в эндокринных органах, что запускает каскад нарушений нейро-гумораль-
ного регулирования, приводящие к изменениям обмена веществ, кроветворения и иммунной защиты. Имму-нодефицитные состояния являются следствием супрессии иммунокомпе-тентных органов животных на фоне недостаточности молозивной пассивной иммунизации. Все это является первичной и основной причиной дальнейшей заболеваемости и падежа поросят [3].
Основными мерами профилактики и ликвидации различных заболеваний молодняка в настоящее время является стратегия использования различных ветеринарных препаратов и кормовых добавок антимикробной направленности. Однако, в условиях запрета международными организациями использования в животноводстве и птицеводстве кормовых антибиотиков, возникает необходимость
изучения и использования аналогов, не оказывающих вредного влияния на организм сельскохозяйственных животных и человека. В связи с этим, большое количество исследований проводится в области профилактики и лечения данных заболеваний природными препаратами. В ветеринарной медицине для лечения и профилактики иммунодефицитных заболеваний животных нашли широкое применение препараты из тимуса, эндокринных желез и селезенки [4,5,6,7], действие которых направлено на восстановление кроветворной и иммунной функций организма.
В ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова» ведется работа по разработке и изучению препарата «Ди-нормин», представляющего собой специально приготовленные экстракты иммунокомпетентных органов
свиней: тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов.
Данная статья посвящена исследованию аминокислотного и белково-пептидного состава экстрактов и препарата «Динормин».
Материалы и методы
Объектами исследования являлись: индивидуальные экстракты тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов, а также комплексный препарат «Динормин».
Определение аминокислотного состава образцов выполнено на аминокислотном анализаторе ВМготк-Ю-2000 (Германия) в режиме трехбуферного элюирования. Для предварительного удаления высокомолекулярной белковой фракции образцы растворяли в 0,2 М растворе натрий-цитратного буфера рН 2,2 и центрифугировали при 20000 об/мин при 5 °С в течение 40 мин. Для осаждения высокомолекулярных белков, крупных и средних пептидов к надоса-дочной жидкости изучаемых образцов прибавляли 70% раствор трихлорук-сусной кислоты в воде, выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин и центрифугировали при 20000 об/мин при 5 °С в течение 40 мин, надосадочную жидкость хранили при температуре не выше 8 °С.
Непосредственно перед проведением анализа на содержание свободных аминокислот отделение средних
и низкомолекулярных пептидов осуществляли пропусканием надоса-дочной жидкости через кювету с пористой мембраной YM-2 («Атюоп») с пределом отсечения 2 кДа под давлением 5 атм.
Полный аминокислотный состав препарата «Динормин» и индивидуальных экстрактов определяли после кислотного гидролиза, проводимого в вакуумированных запаянных ампулах в растворе 6 М хлористоводородной кислоты в течение 24 часов при (105 ± 1) °С. Аликвоту 200 мкл каждого образца наносили на колонку аминокислотного анализатора. Разделение аминокислот на аналитической колонке проходило в автоматическом режиме в трехбуферной системе натрий-цитратных буферов: буфер А - 0,18 М, рН 3,25; буфер В - 0,3 М, рН 3,9 и буфер С - 1,6 М, рН 4,75. Ионообменная смола - DC-6A(США). Высота смолы в колонке 22 см, скорость потока буферного раствора 32 мл/ч. Для регистрации аминокислот использовали постколоночную модификацию с применением нингидринового реагента. Скорость подачи нингидринового реагента - 20 мл/ч.
Анализ компонентного состава экстрактов выполняли методом электрофореза в полиакриламидном геле разной плотности (12,5% и 15%) в присутствии 0,1% лаурилсульфата натрия на предварительно подготовленных образцах с концентрацией 0,1 мг/мл в
буфере для разведения. В качестве свидетелей использовали маркер, состоящий из девяти стандартов с молекулярной массой 130, 95, 72, 55, 43,34, 26, 17 и 10 кДа (фирмы «Fermentas», Литва).
Результаты исследования
Исследование полного аминокислотного состава препарата «Динормин» показало высокое содержание аспаргиновой, глутаминовой аминокислот, лизина, аргинина и лейцина (рисунок 1). Стоит отметить, что в препарате «Динормин», включающем экстракты иммунокомпетентных органов, содержание нейромодуляторных аминокислот (Asp, Glu и Gly) достаточно высокое и составляет почти треть общего содержания аминокислот (32,5%, соответственно).
Содержание свободных аминокислот, определяемое на навеску образца, в препарате «Динормин» и лиофилизатах экстрактов отдельных органов невелико и нестабильно, что вызвано высокой гигроскопичностью исследуемых образцов. Можно отметить достаточно высокое содержание свободного лизина, аргинина, аспарги-новой и глутаминовой аминокислот в исследуемых образцах (рисунок 2). В препарате «Динормин» наблюдается преобладание лизина, лейцина и аспаргиновой аминокислоты, в экстракте селезенки отмечено преобладание глутаминовой, аспаргиновой аминокислот и лейцина, в экстракте лимфатических узлов - глутаминовой аминокислоты, пролина и лизина, в экстракте тимуса - глутаминовой аминокислоты и лизина.
Стоит отдельно отметить содержание свободного глицина, являющегося нейромедиатором - в препарате «Ди-нормин» и экстрактах отдельных органов оно более однородно по величине и составляет в среднем 7,5%. При невысоком содержании свободных аминокислот их вклад в суммарное действие препарата незначителен.
Результаты злектрофоретичес-кого исследования изучаемых об-
0,6
0,5
Ii 0,4 <и
и н
3 0,3
о0,2
0,1 0
динормин селезенка тимус лимф. Узлы
Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala / Val Met Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg
Cys
Наименование аминокислоты
Рисунок 1. Содержание аминокислот в исследуемых образцах
2014 I №Б ВСЕ О МЯСЕ
<и Ч
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
динормин селезенка тимус лимф. узлы
Наименование аминокислоты
Рисунок 2. Содержание свободных аминокислот в образцах
0
разцов, выполненного в 12,5% по-лиакриламидных гелях показаны на рисунке 3.
Анализ электрофоретического исследования образцов, показал, что в препарате «Динормин» и в экстракте селезенки содержится достаточное количество высокомолекулярных фракций. В препарате «Динормин» обнаружено несколько высокомолекулярных фракций: в области 130 кДа; 95 кДа; очень интенсивная полоса в диапазоне от 65 до 67 кДа; полосы в области 60, 52 кДа, дуплет в области 43 кДа; несколько нечетко разрешенных полос в области 34 кДа. В экстракте селезенки выявлено 5 белковых зон в диапазоне от 170 до 72 кДа примерно равной интенсивности; белковая зона в области 55 кДа, интенсивные полосы в области 43 и 34 кДа.
В экстрактах тимуса и мезентеральных лимфатических узлов обнаружены очень слабые белковые полосы в области 130 и 95 кДа, интенсивно окрашенные полосы в области 72 кДа; белковые полосы в области 55 и, примерно, 40 кДа. При этом выявлены низкомолекулярные белковые фракции: в препарате «Динормин» - одна полоса в области 26 кДа и несколько минорных полос в области от 15 до 12 кДа; в экстракте селезенки - полосы в области 26 и 17 кДа, минорные полосы в области от20 до 12 кДа и интенсивная полоса в области 10 кДа; в экстракте тимуса и лимфатических
узлов - не менее 6 минорных полос в области от 34 до 10 кДа.
По полученным данным можно предположить, что белковые фракции, обнаруженные при анализе экстрактов тимуса, селезенки и мезентеральных лимфатических узлов, соответствуют различным компонентам системы врожденного и адаптивного иммунитета. Вероятно, эти белки связанны с клеточной адгезией, активацией тромбоцитов, развитием кровеносных сосудов, а также участвуют в иммунных и противовоспалительных реакциях. Например, RIG-I-подобный рецеп-тор-1 (107,5 кДа), активатор пролиферации пероксисом гамма-рецептор (57,5 кДа); поверхностный антиген лейкоцитов (33,25 кДа); интерлейкин-17А (17,3 кДа); адреномедуллин-5 (12,5 кДа); ингибитор лейкоцитов цис-
теинпротеаза-1 (17,3 кДа); тирозинки-наза - связывающий белок (11,6 кДа) и пр.
Электрофоретическое разделение исследованных образцов в полиакри-ламидном геле различной концентрации, 12,5 % и 15 %, показало, что все они являются многокомпонентными смесями, содержащими белки в широком диапазоне молекулярных масс, при этом экстракты иммунокомпетен-тных органов достаточно индивидуальны. Экстракт селезенки содержит большее количество высокомолекулярных белков, в диапазоне от 170 до 72 кДа. В экстрактах тимуса и лимфатических узлах превалируют низкомолекулярные белки в диапазоне от 72 до 26 кДа, а также ниже 10 кДа. В комплексном препарате «Динормин» обнаруживаются практически все белки, выявленные в индивидуальных экстрактах.
Обсуждение результатов
Результаты исследования аминокислотного состава показали, что среди компонентов, входящих в состав препарата «Динормин», наиболее высокое содержание аминокислот отмечено в экстракте селезенки, тогда как в тимусе и мезентеральных лимфатических узлах, содержание аминокислот заметно ниже. Показано, что в препарате «Динормин» содержится значительное количество нейроме-диаторных аминокислот, таких как
/Г70кДа ^^ ЯП А Л ^^ ШГ^^^^ Условные обозначения:
130кДа - ВВ ^Ввв ВЩ ^В Д ^ , I 1. Маркеры молекулярной
95 кДа- ■ 1 массы
72 кДа ^В^В^Н 'Н1ВВ 2. Динормин
(красн) ^И ^В^В^Н ь. 3. Селезенка
55 кДа ^■■■■В ^В ВВН4. Тимус
34 кДа ^^Н ^Н ■■ ^Н^ВЯ I 5. Лимфатические узлы
1я
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 V Рисунок 3. Электрофорез в 12,5 % ПААГ )
аспаргиновая, глутаминовая кислоты, глицин. Данные аминокислоты обладают иммунологической активностью и улучшают адаптивные способности животных при стрессах.
Данные, полученные методом электрофореза подтверждают высокую гетерогенность экстрактов, входящих в состав средства «Динор-мин», присутствие веществ в широком диапазоне молекулярных масс. Так, препарат «Динормин», содержит достаточно большое количество высо-
комолекулярных белков с молекулярными массами от 130 кДа до 43 кДа; а также низкомолекулярных белков с молекулярными массами 34 кДа и 26 кДа, от 15 до 12 кДа. Показано, что в комплексном средстве «Динормин» сохраняются основные белки, содержащиеся в экстрактах внутренних органов, используемых для его производства. |
КОНТАКТЫ:
Ирина Михайловна Чернуха
+ 7 (495) 676-72-11 Людмила Ароновна Люблинская + 7 (495) 676-64-51 Лилия Вячеславовна Федулова Екатерина Романовна Василевская Александр Николаевич Макаренко Елена Александровна Тимохина + 7 (495) 676-92-11
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Топурия Л.Ю. Фармакокоррекцияиммунодефицитных состояний у животных: монография /Л.Ю. Топурия, А.А. Стадников, Г.М. Топурия. - Оренбург: Издательский центр Оренбургского ГАУ, 2008. - 176 с.
2. Субботин В.В. Желудочно-кишечные болезни поросят с симптомокомплексом диареи: причины, профилактика и терапия/ В.В. Субботин // Ветеринария и кормление - 2005.- №3.- С.12-13.
3. Топурия Л.Ю. Применение препаратов тимуса для коррекции иммунодефицитных состояний у животных /Л.Ю. Топурия // Известия Оренбургского ГАУ. - 2006. - №3. - С. 64-66.
4. Топурия Л.Ю. Иммуномодуляторы в системе лечебно-профилактических мероприятий при болезнях молодняка сельскохозяйственных животных /Л.Ю. Топурия //Известия Оренбургского ГАУ. - 2006. - №2. - С. 166-169.
5. Морозов В.В. Пептидныетимомиметики /В.В. Морозов, В.Х.Хавинсон , В.В. Малинин. СПб.: Наука, 2000. - 158 с.
6. Смирнов B.C. Тимоген в животноводстве и ветеринарии / В.С.Смирнов/ СПб. - 2005. - 36 с.
7. Бондаренко Е.М. Применение иммуномодулятора тимогена для лечения телят с функциональной диспепсией/ Безбородов Н.В., Бондаренко Е.М.// Молочное и мясное скотоводство, 2009. - С. 24-26.
2014 | №6 ВСЕ О МЯСЕ
