CC BY
17
УДК 616.932:575
А.Б.Мазрухо, Е.В.Монахова, О.В.Дуванова, Б.Н.Мишанькин, В.Д.Кругликов
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОй ДЕТЕРМИНИРОВАННОСТИ ТВИНАЗНОй АКТИВНОСТИ
ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону
Холерные вибрионы различных серогрупп изучены на наличие гена cef (CHO cell elongating factor) и активности по отношению к твинам и трибутирину с использованием ХДС-агара, приготовленного на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей. Установлено, что все cef-позитивные штаммы гидролизуют твины 20, 40, 60, 80, 85 и все, кроме токсигенных V. cholerae O139, расщепляют трибутирин. Нетоксигенные cef-негативные штаммы О139 серогруппы, напротив, активны только по отношению к последнему. По-видимому, твиназная активность холерных вибрионов, отчасти, обусловлена Cef, а способность к гидролизу трибутирина - результат совокупного действия Cef и других ферментов. Показана эффективность применения ХДС-агара для определения данных признаков.
Ключевые слова: холерный вибрион, твиназа, CHO cell elongating factor.
A.B.Mazrukho, E.V.Monakhova, O.V.Duvanova, B.N.Mishan’kin, V.D.Kruglikov Analysis of Genetic Determination of Vibrio cholerae Tweenase Activity
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don
Studied are Vibrio cholerae of different serogroups on the presence of cef (CHO cell elongating factor) gene and activity against tweens and tributyrin using HDS-agar, prepared on the basis of bakery yeast pancreatic digest. Determined is the fact that all cef-posi-tive strains hydrolyze tweens 20, 40, 60, 80, 85 and all but toxigenic V.cholerae O139, hydrolyze tributyrin. In contrast, non-toxigenic cef negative strains of O139 serogroup, are active only against the latter. Apparently, the tweenase activity of Vibrio cholerae is provided, partly, by Cef, and the ability to hydrolyze tributyrin is the result of combined activity of Cef and other ferments. Shown is the efficiency of HDS-agar application to determine these characteristics.
Key words: Vibrio cholerae, tweenase, CHO cell elongating factor.
Холерные вибрионы обладают широким спектром ферментативной активности, обеспечивающей им конкурентоспособность и возможность адаптации к различным экологическим нишам. Субстратами для роста и размножения вибрионов могут служить разнообразные органические соединения, в т.ч. содержащие эфирные связи. К числу последних принадлежат твины (сложные моноэфиры многоатомных спиртов и жирных кислот, относящихся к классу неионогенных поверхностно-активных веществ), которые могут использоваться даже в качестве единственного источника углерода [3]. Установлено, что практически все холерные вибрионы в той или иной степени обладают способностью гидролизовать твины 20, 40, 60, 80 [3]. Исключение составляют полностью лишенные этой способности нетоксигенные водные штаммы О139 серогруппы [1]. Однако до настоящего времени исследования твиназной активности Vibrio cholerae проводились лишь по фенотипу вне связи с какими-либо генами, ответственными за ее проявление. В 2000 г. B.A.McCardell и соавт. был описан Cef (CHO cell elongating factor) холерных вибрионов. Помимо цитотонической активности по отношению к культурам клеток, давшей название этому фактору, он способен гидролизовать р-нитрофениловые эфиры жирных кислот с длиной цепи от 2 до 14 атомов углерода [6]. Ранее нами была показана и твиназная активность рекомбинантных белков Cef холерных ви-
брионов различных серогрупп, а также способность Cef представителей О1 и неО1/неО139 серогрупп (но не V. cholerae О139) к гидролизу трибутирина [4].
Цель работы состояла в детекции гена cef в ДНК холерных вибрионов различных серогрупп и сравнительном изучении их твиназной активности с использованием питательной среды на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей.
Объектами исследования служили 260 штаммов V. cholerae О1, 40 штаммов О139 и 40 штаммов неО1/ неО139 серогрупп. ПЦР-детекцию гена cef проводили с помощью сконструированных нами праймеров [4]. В качестве субстратов использовали твины 20, 40, 60, 80, 85 и трибутирин, которые добавляли, как описано ранее [1, 4], к среде ХДС-агар следующего состава: панкреатический перевар пекарских дрожжей - 0,05 % (по аминному азоту); NaCl - 4,0 г; Na2HPO4-2H2O - 6,0 г; агар-агар микробиологический - 12,0 г; вода дистиллированная - до 1 л; рН готовой среды 7,8±0,2.
Биоинформационный анализ аминокислотных последовательностей липаз и эстераз проводили с помощью пакета компьютерных программ Vector NTI 11 (www.informax.com).
Полученные результаты показали, что ген cef присутствовал в геномах всех штаммов, кроме включенных в исследование 22 нехолерогенных V. cholerae О139, выделенных из водных источни-
ков внешней среды.
В опытах с использованием в качестве основы ХДС-агара все cef-позитивные вибрионы, включая токсигенные клинические штаммы V. cholerae О139, гидролизовали твины 20, 40, б0, 80 и 85, тогда как ни один из водных cef-негативных штаммов О139 серо-группы не обладал твиназной активностью. Следует отметить, что на этой среде нам удалось выявить активность по отношению к твину 80 у токсигенных штаммов О139 серогруппы, которая ранее не наблюдалась при использовании других сред. По-видимому, некоторое несовпадение представленных в литературе данных о спектрах твиназной активности холерных вибрионов [1, 3] также связано с использованием разными авторами неодинаковых питательных сред и концентраций субстратов. Наши данные показали, что ХДС-агар является адекватной средой, позволяющей дифференцировать штаммы холерных вибрионов по этой активности. Что касается трибутирина, то все штаммы, включая водные cef-негативные V. cholerae O139, гидролизовали этот субстрат, однако у последних зоны просветления среды вокруг колоний были намного меньше, чем у остальных штаммов, содержащих ген cef. Поскольку трибутирин является субстратом, традиционно используемым для определения не только эстеразной, но и липазной активности [5, 7], эти результаты навели нас на мысль о том, что у cef-негативных штаммов гидролиз трибутирина осуществлялся другой липазой(ами), а у cef-позитивных вибрионов О1 и неО1/неО139 серогрупп наблюдался эффект совокупного действия других липаз/эстераз и Cef. На обеих хромосомах V. cholerae eltor Шб9б1 мы выявили 20 генов известных и предполагаемых липаз и эстераз и провели поиск в их продуктах консервативного пентапептида GXSXG, который входит в состав субстрат-связывающего домена липаз. Серин в его центре играет ключевую роль в связывании с субстратом [5]. Оказалось, что GXSXG присутствует в молекулах трех белков, гены которых локализованы на большой хромосоме - предполагаемой эстеразы/липазы YbfF (AAF95343.1) и двух протеин-глютамат-метилэстераз CheB (AAF95208.1 и AAF94558.1), а также четырех белков, гены которых локализованы на малой хромосоме - липазы, входящей в состав Hly-локуса (AAF96133.1), липазы семейства GDXG (AAF96394.1), «липазоподобного белка» (AAF96652.1) и обозначенного как предполагаемая липаза белка Cef (AAF96761.1). Анализ, проведенный нами с помощью программы AlignX, не выявил значительной гомологии между ними (кроме двух CheB, которые близки друг другу, но далеко не идентичны). Субстратная специфичность большинства липаз/эстераз (содержащих пентапептид GXSXG) холерных вибрионов не изучена, но мы не исключаем, что, по крайней мере, часть из них активна по отношению к трибутирину. В таком случае вполне понятна более слабая активность cef-негативных штаммов по сравнению с cef-позитивными, у которых она усилена присутствием Cef. С другой
стороны, с этих позиций не удается объяснить высокую активность по отношению к трибутирину ток-сигенных штаммов О139, поскольку продуцируемый ими Cef разлагает только твины, но не трибутирин [4]. Возможно, это связано с повышенным уровнем синтеза одной из других липаз/эстераз, одновременной экспрессией нескольких кодирующих их генов, либо с более активным транспортом продукта(ов) во внеклеточное пространство.
Таким образом, на основании полученных результатов с использованием «природной модели» - cef-негативных вибрионов О139 - можно с уверенностью заключить, что твиназная активность V. cholerae, отчасти, обусловлена продуктом гена cef Однако, принимая во внимание принципиальные отличия в структуре геномов водных авирулентных холерных вибрионов О139 серогруппы от всех остальных представителей вида V. cholerae [2] и отсутствие в GenBank полной нуклеотидной последовательности таких штаммов, остается вероятность того, что у вибрионов О1, неО1/неО139 и токсигенных штаммов О139 серогруппы твиназной активностью обладают и другие вышеупомянутые ферменты. Для окончательного ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования, направленные на выявление генов других эстераз и липаз, определение их экспрессии и субстратной специфичности, а также получение делеционных мутантов, дефектных по гену cef, и сравнение их эстеразной активности с изо-генными штаммами. Во избежание получения ложноотрицательных результатов при проведении таких исследований в качестве основы сред с твинами и трибутирином может быть рекомендован ХДС-агар, исподьзование которого позволяет получать четкие и однозначные данные.
Широкое распространение гена cef среди клинических и водных штаммов различных серогрупп и достаточно высокий уровень его экспрессии позволяют полагать, что данный фактор может вносить свой вклад в выживаемость холерных вибрионов в открытых водоемах и сточных водах, которые в настоящее время значительно загрязнены органическими веществами. В этой связи представляет интерес и тот факт, что ген cef (VCA0863) локализован на малой хромосоме в непосредственной близости к гену транспортного белка длинноцепочечных жирных кислот (VCA0862), которые могут образоваться в результате расщепления различных субстратов за счет активности Cef.
СПИСОК лИТЕРАТУРы
1. Дуванова О.В., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Способпость расщеплять твин 20 как дифференциальный тест для вибрионов О139 серовара различного происхождения. Клин. и лаб. диагн. 2000; 5:48-9.
2. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ гепомов вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae O139. Мол. генет. 2004; 2:11-16.
3. Кузьмиченко И.А., Грачева И.В., Плотников О.П. Деструктивная активность и рост холерного вибриона в присутствии твинов. Пробл. особо опасных инф. 2001; 1(81):101-5.
4. Монахова Е.В., Ломов Ю.М., Писанов Р.В., Алексеева Л.П., Маркина О.В., Миронова А.В. и др. Клонирование гепа
цитотонического фактора Cef (CHO-cell elongating factor) Vibrio cholerae в Escherichia coli и его экспрессия под контролем Pbad промотора. Биотехнология. 2005; 5:12-8.
5. Faustinella F., Smith L.C., Semenkovich C.F., Chan L. Structural and functional roles of highly conserved serines in human lipoprotein lipase. Evidence that serine 132 is essential for enzyme catalysis. J. Biol. Chem. 1991; 15:9481-5.
6. McCardell B.A., Kothary M.H., Hall R.N., Sathyamoorthy V Identification of a CHO-elongating factor produced by Vibrio cholerae O1. Microb. Pathogen. 2000; 29(1):1-8.
7. Singh R., Gupta N., Goswami V.K., Gupta R. A simple activity staining protocol for lipases and esterases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006; 70:679-82.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Duvanova O.V, Shimanyuk N.Ya., Mishan’kin B.N . [The ability to digest tween 20 as a differential test for vibrios of O139 serovar of different origin]. Klin. Lab. Diagnost. 2000; 5:48-9.
2. Eroshenko G.A., Osin A.V, Shchelkanova E.Yu., Smirnova N.I. [Comparative analysis of genomes of virulent and avirulent strains of Vibrio
cholerae 0139]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2004; 2:11-6.
3. Kuz’michenko I.A., Gracheva I.V., Plotnikov O.P. [Destructive activity and growth of cholera vibrio in the presence of tweens]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2001; (81):101-5.
4. Monakhova E.V, Lomov Yu.M., Pisanov R.V, Alekseeva L.P., Markina O.V, Mironova A.V et al. [Cloning of Vibrio cholerae CHO-cell elongating factor gene in Escherichia coli and its expression under the control of PBAD-promoter]. Biotekhnologia. 2005; 5:12-8.
Authors:
Mazrukho A.B., Monakhova E.V., Duvanova O.V., Mishan’kin B.N., Kruglikov V.D. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M.Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Мазрухо А.Б., Монахова Е.В., Дуванова О.В., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40. E-mail: [email protected]
Поступила 11.05.12.
4б
