CC BY
48
УДК
Вестник СамГУ. 2015. № 10(132)
ХИМИЯ
А.С. Гильмутдинова, В.А. Ермохин, П.П. Пурыгин, Н.А. Кленова1
ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ 1-АДАМАНТАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ИНДУЦИРОВАННУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
Осуществлено изучение вновь синтезированных производных 1-ада-мантанкарбоновой кислоты: анилид 1-адамантанкарбоновой кислоты (N-адамантилЛ-карбоксамид), 4-броманилид 1-адамантанкарбоновой кислоты ^-(4-бромфенил)-адамантил-1-карбоксамид) на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro. Установлено достоверное влияние на агрегацию тромбоцитов анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты отмечалась лишь тенденция к увеличению ее интенсивности. Способность влиять на агрегацию тромбоцитов коррелирует с наличием брома в бензольном кольце. По возрастанию влияния на агрегацию можно расположить в ряд исследуемые растворители: ацетон, 2-пропанол, этанол, метанол, диметилсульфоксид.
Ключевые слова: 1-адамантанкарбоновая кислота, индуцированная агрегация, бензольное кольцо, кровь, ацетон, этанол, метанол, диметилсуль-фоксид.
Введение
Лечение патологий системы свёртывания крови — тромбоцитозалиботромбоци-топении, возникающей при патологическом увеличении либо уменьшении числа тромбоцитов в крови, является важной задачей современной медицины. Как отмечают исследователи, увеличение агрегации тромбоцитов проявляется при таких заболеваниях, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, диабет и др., которые усугубляют течение болезни [1; 2]. Фармакологическим воздействием избирательного действия можно по необходимости снижать либо повышать патологические гиперагрегации тромбоцитов.
Интересные результаты были получены при исследовании физиологической активности производных 1-адамантанкарбоновой кислоты, содержащих фрагмент
!© Гильмутдинова А.С., Ермохин В.А., Пурыгин П.П., Кленова Н.А., 2015 Гильмутдинова Альфия Султангалиевна ([email protected]), Ермохин Владимир Анатольевич ([email protected]), Пурыгин Петр Петрович ([email protected]), кафедра органической, биоорганической и медицинской химии, Самарский государственный университет, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
Кленова Наталья Анатольевна, кафедра биохимии, Самарский государственный университет, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
адамантана — углеводорода каркасного строения. Часть этих хорошо изученных соединений сегодня уже применяются в клинической практике, хотя имеются сотни производных, которые ждут своих исследователей [3].
В работе [4] изложены результаты изучения амидов ЛЦ(адамантоил-1)-фенил]-антраниловой кислоты. Они показывают ярко выявленное подавление серо-тонинового отёка. Там же предположили, что происходит блокирование амидами серотониновых рецепторов сосудистой стенки.
В данной работе изучено влияние производных 1-адамантанкарбоновой кислоты с различными заместителями на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.
Целью исследования стало изучение механизмов влияния вновь синтезированных производных 1-адамантанкарбоновой кислоты на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.
Исследовалось влияние синтезированных производных 1-адамантанкарбоновой кислоты на адреналин-индуцированную, АДФ-индуцированную, серотонин-инду-цированную агрегацию тромбоцитов.
Материалы и методы исследования
Исследование влияния на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека проведено на производных 1-адамантанкарбоновой кислоты, различающихся структурой и свойствами заместителей: анилид 1-адамантанкарбоновой кислоты (Ж-адамантил-1-карбоксамид) (I), 4- броманилид 1-адамантанкарбоновой кислоты (Ж-(4-бромфенил)-адамантил-1-карбоксамид) (II).
Данные соединения синтезированы в лаборатории кафедры органической, биоорганической и медицинской химии СамГУ [5-8]. Строение синтезированных соединений доказано данными ЯМР 1Н и ИК спектроскопии. ИК спектры соединений снимали на спектрофотометре ИКС-29 в таблетках КВг. Спектры ЯМР получены на приборе Bruker WP-200 БУ (рабочая частота 200, 13 МГц). В качестве растворителя применяли ДМСО^в, СБзС^ СБС1з. Отсчёт химических сдвигов проводили относительно сигнала ТМС. Для подтверждения индивидуальности всех полученных соединений проводили тонкослойную хроматографию на пластинках БИиЫ иУ в этилацетате.
Биологический материал для выделения тромбоцитов предоставлен Самарской областной станцией переливания крови. Кровь, взятую из локтевой вены, стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия (9:1).
Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут. Изучаемые соединения растворяли в диметилсульфоксиде.
В качестве индуктора агрегации использовались:
• адреналина гидрохлорид в конечной концентрации 1-10~5 М,
• динатриевую соль аденозин-5-дифосфорнойкислоты (АДФ) фирмы "Merck" в конечной концентрации 1-10~5 М,
• растворённый в 0,154 М NaCl рН 7,2 5-гидрокситриптамин-креатин сульфат (серотонин) 1-10~5 М.
Из источников известно, что данные концентрации соединений являются наиболее эффективными в отношении АДФ-, серотонин- и адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека [9].
Конечные концентрации всех соединений составляли 0,32-0,55 мг/мл.
Агрегация тромбоцитов исследована фотометрическим методом Борна [10]. Принцип метода основан на регистрации снижения оптической плотности исследуемой плазмы после введения в нее тромбоцитагрегирующего агента. Изменение оптических свойств исследуемой системы в процессе агрегации тромбоцитов происходит за счет уменьшения общей рассеивающей поверхности клеток в результате их склеивания друг с другом.
Оптическую плотность измеряли анализатором агрегации тромбоцитов АР 2110 (Беларусь). Стандартную статистическую обработку проводили с применением критерия Стьюдента, при этом выборка проверялась на нормальность распределения. Данные считали достоверными при уровне значимости р<0,05 [11].
Результаты исследований и их обсуждение
Природа заместителей, входящих в состав молекулы производного изучена для соединения анилид 1-адамантанкарбоновой кислоты и 4-броманилид 1-адамантан-карбоновой кислоты. Было исследовано действие этих соединений на агрегацию тромбоцитов человека.
К настоящему моменту в литературе отсутствует информация о возможных механизмах влияния анилида и 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на функционирование тромбоцитарных рецепторов. Влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может быть обусловлена их способностью воздействовать на серотониновые рецепторы или блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Также возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с рецепторной молекулой.
Для проверки данных предположений были поставлены эксперименты с отобранными для дальнейших исследований соединениями без индуцирования агрегации известными агрегантами.
Установлено достоверное влияние на агрегацию тромбоцитов анилида 1-ада-мантанкарбоновой кислоты, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты отмечалась лишь тенденция к увеличению ее интенсивности. В ходе эксперимента нами было предположено, что способность влиять на агрегацию тромбоцитов коррелирует с наличием брома в бензольном кольце.
По возрастанию влияния на агрегацию можно расположить в ряд исследуемые растворители: ацетон, 2-пропанол, этанол, метанол, диметилсульфоксид.
Возрастание агрегации в данном ряду коррелирует с токсичностью данных растворителей. Для испытаний исследуемых соединений на агрегацию тромбоцитов более логично было взять ацетон (из-за его наименьшего воздействия на агрегацию или спирты). Но из-за возможности их взаимодействия с индукторами агрегации (адреналин, серотонина адипинат, АДФ) нами был использован в качестве растворителя более инертный диметилсульфоксид.
Адреналин, связываясь с а-адренорецепторами мембраны тромбоцитов, инги-бирует аденилатциклазу. Предполагается, что ускоряющий агрегацию тромбоцитов эффект адреналина связан с модуляцией мембран при его взаимодействии с а-адренорецепторами и изменением её проницаемости к ионам Са2+. Показано, что антагонисты а-адренорецепторов способны блокировать агрегацию, а агони-сты усиливают её, поскольку активированные Сг-белки ингибируют аденилатцик-лазу.
Для проверки данных предположений были поставлены эксперименты с отобранными для дальнейших исследований соединениями с индуцированием агрегации адреналином.
Установлено достоверное снижение агрегации тромбоцитов при воздействии анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на индуцированную агрегацию адреналином на 64 %, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты отмечалась лишь уменьшение интенсивности агрегации на 58 %. В ходе эксперимента нами было предположено, что способность влиять на агрегацию тромбоцитов коррелирует с возможностью воздействовать на а-адренорецепторы.
Влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может быть обусловлена их способностью воздействовать на а-адренорецепторы или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Также возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с рецепторной молекулой.
Аденозин-5'-дифосфат, связываясь с а-адренорецепторами мембраны тромбоцитов, ингибирует аденилатциклазу. Предполагается, что ускоряющий агрегацию тромбоцитов эффект аденозин-5'-дифосфата связан с модуляцией мембран при его взаимодействии с а-адренорецепторами и изменением её проницаемости к ионам Са2+.
Для проверки данных предположений были поставлены эксперименты с отобранными для дальнейших исследований соединениями с индуцированием агрегации аденозин-5'-дифосфатом.
Установлено достоверное снижение агрегации тромбоцитов при воздействии анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на индуцированную агрегацию аденозин-5'-дифосфатом на 60 %, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты отмечалась лишь уменьшение интенсивности агрегации на 56 %.
В ходе эксперимента нами было предположено, что способность влиять на агрегацию тромбоцитов коррелирует с возможностью воздействия на а-адренорецепторы.
Влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может быть обусловлена их способностью воздействовать на а-адренорецепторы или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Также возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с рецепторной молекулой.
Влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может быть обусловлено их способностью усиливать сродство серотонина к рецепторам (синергисты) или каким-либо образом блокировать доступ лиганда к своему рецептору. Также возможным является агонистическое влияние на рецептор с малой константой ассоциации агониста с рецепторной молекулой.
Для проверки данных предположений были поставлены эксперименты с отобранными для дальнейших исследований соединениями с индуцированной агрега-
цией серотонином. Исследования показали, что все выбранные производные ада-мантана являются агонистами агрегации.
Установлено достоверное влияние на агрегацию тромбоцитов, отмечалась лишь тенденция к увеличению ее интенсивности. В ходе эксперимента нами было предположено, что способность 4-броманилида и анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов связана с геометрией молекулы.
Тромбоциты играют исключительную роль в осуществлении сосудисто-тром-боцитарного гемостаза, а благодаря высокой способности адсорбировать на своей поверхности биологически активные соединения, факторы свертывания и фибри-нолиза, активно реагировать на изменение состава и физико-химических свойств плазмы, они участвуют в регуляции процессов и функций, осуществляемых кровью при разнообразных воздействиях на организм. Агрегацию тромбоцитов и сильное сужение сосудов индуцирует серотонин, который также синергически увеличивает эффекты тромбоксана А2, ангиотензина II, аденозин-5'-дифосфата и коллагена [5]. Поскольку эта активность проявляется через связывание с 5-НТ2-рецепторами в тромбоцитах и тканях сосудов [12], антагонисты периферических 5-НТ2-рецепторов могут быть использованы при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Выводы
Анилид и 4-броманилид 1-адамантанкарбоновой кислоты оказывают различное действие на агрегацию тромбоцитов человека, что является следствием их способности влиять на функционирование разных тромбоцитарных рецепторов. Влияние анилида и 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на агрегацию тромбоцитов человека определяется их структурой. Анилид 1-адамантанкарбоно-вой кислоты имеет свойства агониста, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты отмечалась лишь тенденция к увеличению интенсивности агрегации.
Установлено достоверное снижение агрегации тромбоцитов при воздействии анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на индуцированную агрегацию адреналином на 64 %, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на 58 %, при воздействии анилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на индуцированную агрегацию аденозиндифосфатом на 60 %, для 4-броманилида 1-адамантанкарбоновой кислоты на 56 %.
Анилид (I) и 4-броманилид (II) 1-адамантанкарбоновой кислоты усиливают агрегацию тромбоцитов, индуцируемую серотонином (являются агонистами агрегации). Усиливающее влияние веществ I и II при серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов, по-видимому, обусловлено их способностью усиливать сродство се-ротонина к своим рецепторам со свойствами ионных каналов, почти не влияя на сродство к гликопротеиновым рецепторам (синергист серотонина).
Литература
[1] Белушкина Н.Н., Северина И.С. Торможение АДФ-индуцируемой агрегации тромбоцитов гуанидинотиолами — новым классом активаторов гуанилатциклазы и субстратов ТО-синтазы // Биохимия. 1996. Т. 61. № 12. С. 2140-2146.
[2] Изменения в активности гуанилатциклазы тромбоцитов человека при АДФ-индуци-руемой агрегации / Ю.Ю. Чирков [и др.] // Бюллетень экспериментальной биол. и медицины. 1991. Т. 52. № 2. С. 152-154.
[3] Багрий Е.И. Адамантаны: получение, свойства, применение. М.: Наука, 1989. 264 с.
[4] Даниленко Г.И., Мохорт М.А., Триус Ф.П. Синтез и биологическая активность производных адамантана ^(адамантоил-1)антраниловой кислоты // Хим.-фарм. журн. 1973. Т. 17. № 10. С. 15-17.
[5] Ермохин В.А. Синтез и биологическая активность адамантилпроизводных гетеро-функциональных ароматических аминов и азотсодержащих гетероциклов: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Самара, 2007. 22 с.
[6] Синтез и антибактериальная активность ^(нитрофенил)-адамантил-1-карбоксамидов и адамантансодержаших иодидов N-метилпиридиния / В.А. Ермохин [и др.] // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2007. № 6(56). С. 378-384.
[7] Ермохин В.А., Пурыгин П.П., Зарубин Ю.П. Адамантановые производные эфиров и амидов 4-аминобензойной кислоты // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2006. 49. № 9. С. 92-96.
[8] Ермохин В.А., Пурыгин П.П., Клёнова Н.А. Синтез и гемолитическая активность N-адамантоилзамещённых гетероциклических аминов и анилинов // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2004. № 4(34). С. 138-144.
[9] Самаль А.Б., Черенкевич С.И., Хмара Н.Ф. Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы. М.: Университетское, 1990. 104 с.
[10] Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В.П. Балуда [и др.]. Томск, 1980. 84 с.
[11] Фролов Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование. Самара: Изд-во "Самарский университет", 1997. 265 с.
[12] Marlar И.А., Kleiss А.Л., Griffin J.H. An alternative extrinsic path way of human blood coagulation // Blood. 1982. V. 15. № 60. Р. 13-53.
References
[1] Belushkina N.N., Severina I.S. Inhibition of ADP-induced platelet aggregation guanidinotiolam - a new class of guanylate cyclase activators and substrates of NO-synthase. Biokhimiia [Biochemistry], 1996, Vol.61, no. 12, pp. 2140-2146 [in Russian].
[2] Chirkov Y.Y., Belushkina N.N., Tkachuk I.A., Severina I.S. Changes in the activity of guanylate cyclase in human platelet aggregation induced by ADP. Biulleten' eksperimental'noi biol. i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine], 1991, Vol. 52, no. 2, pp. 152-154 [in Russian].
[3] Bagriy E.I. Adamantane: preparation, properties and application. M., Nauka, 1989, 264 p. [in Russian].
[4] Danilenko G.I., Mokhort M.A., Trius F.P. Synthesis and biological activity of adamantane derivatives N-(1-adamantoyl)anthranilic acid. Khim.-farm. zhurn. [Chemical and Pharmaceutical journal], 1973, Vol. 17, no. 10, pp. 15-17 [in Russian].
[5] Ermokhin V.A. S'intez i biologicheskaia aktivnost' adamantilproizvodnykh getero-funktsional'nykh aromaticheskikh aminov i azotsoderzhashchikh geterotsiklov: avtoref. dis. ... kand. khim. nauk [Synthesis and biological activity of the adamantyl derivatives heterofunctional aromatic amines and nitrogen-containing heterocycles: Extended abstract of Candidate's of Chemical Sciences thesis]. Samara, 2007, 22 p. [in Russian]
[6] Ermokhin V.A., Zarubin Yu.P., Purygin P.P., Zolotarev P.N. Synthesis and antibacterial activity of N-(nitrophenyl)-adamantil-1-carboxamides and containing adamantane N-methylpyridinium iodide. Vestnik SamGU. Estestvennonauchnaia seriia [Vestnik of SSU. Natural Science Series], 2007, 56, no. 6, pp. 378-384 [in Russian].
[7] Ermokhin V.A., Purygin P.P., Zarubin Yu.P. Adamantane derivatives are esters and amides of 4-aminobenzoic acid. Vestnik SamGU. Estestvennonauchnaia seriia [Vestnik of SSU. Natural Science Series], 2006, 49, no. 9, pp. 92-96 [in Russian].
[8] Ermokhin V.A., Purygin P.P., Klenowa N.A. Synthesis and hemolytic activity of N-adamantoyl of substituted anilines and heterocyclic amines. Vestnik SamGU. Estestvennonauchnaia seriia [Vestnik of SSU. Natural Science Series], 2004, 34, no. 4, pp. 138-144 [in Russian].
[9] Samal A.B., Cherenkevich S.I., Khmara N.F. Platelet aggregation: methods of study and mechanisms. M., Universitetskoe, 1990, 104 p. [in Russian]
[10] Baluda V.P., Barkagan Z.S., Goldberg E.D. [et al.]. Laboratory methods of study of hemostatic system. Tomsk, 1980, 84 p. [in Russian]
[11] Frolov Yu.P. Mathematical methods in biology. Computers and programming. Samara, Samarskii universitet, 1997, 265 p. [in Russian].
[12] Marlar R.A., Kleiss A.J., Griffin J.H. An alternative extrinsic path way of human blood coagulation. Blood, 1982, 15, no. 60, pp. 13-53 [in English].
A.S. Gil'mutdinova, V.A. Ermokhin, P.P. Purygin, N.A. Klenova2
STUDY OF THE DERIVATIVES OF 1-ADAMANTANE CARBOXYLIC ACID TO INDUCED PLATELET AGGREGATION HUMAN IN VITRO
The study of newly synthesized derivatives of 1-adamantane carboxylic acid anilide, 1-adamantanecarboxylic acid (N-adamantyl-1-carboxamide) bro-manilidel-adamantanecarboxylic acid (N-(4-bromophenyl) adamantyl-1-carbox-amide) on platelet aggregation induced of human in vitro is implemented. A significant effect on platelet aggregation anilide 1-adamantane carboxylic acid, 4-bromanilid 1-adamantanecarboxylic acid observed a tendency to increase its intensity. The ability to affect platelet aggregation correlates with the presence of bromine in the benzene ring. Ascending effect on aggregation can be positioned in a number of investigated solvents: acetone, 2-propanol, ethanol, methanol, dimethylsulfoxide.
Key words: 1-adamantanecarboxylic acid, induced aggregation, benzene ring, blood, acetone, ethanol, methanol, dimethylsulfoxide.
Статья поступила в редакцию 2/IX/2015. The article received 2/IX/2015.
2Gil'mutdinova Al'fija Sultangalievna ([email protected]), Ermokhin Vladimir Anatol'evich ([email protected]), Purygin Pyotr Petrovich ([email protected]), Department of Organic Chemistry, Samara State University, 1, Acad. Pavlov Street, Samara, 443011, Russian Federation.
Klenova Natal'ja Anatol'evna, Department of Biochemistry, Samara State University, 1, Acad. Pavlov Street, Samara, 443011, Russian Federation.
