CC BY
62
МИКРОБИОЛОГИЯ
Изучение белков культуральных фильтратов микобактерий
УДК: 619:579.873.21
А.М. Коваленко1, Г.В. Сноз2, В.М. Сапегин1, В.Ю. Жабина1, Р.Ю. Аничин1
1 ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия».
2 ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».
Ключевые слова: белки культурального фильтрата, культуральный фильтрат, микобактерии, туберкулез
Сокращения: КФ — культуральные фильтраты
Введение
Туберкулез (от лат. tuberculum — бугорок) — широко распространенное во всем мире зооантропо-нозное заболевание, вызываемое различными видами микобактерий. Группа микобактерий туберкулеза, способных вызывать эту инфекцию у человека и животных, включает в себя M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. canettii, M. microti, M. pinnipedii и M. caprae.
Белки (туберкулопротеиды) являются главными носителями антигенных свойств микобактерий туберкулеза и проявляют специфичность в реакциях повышенной чувствительности замедленного типа. К указанным белкам относят туберкулин. С полисахаридами связано обнаружение антител в сыворотке крови больных туберкулезом. Липидные фракции способствуют устойчивости микобактерий к кислотам и щелочам.
Антигенный состав возбудителей туберкулеза достаточно постоянен и его вариации в пределах вида незначительны. Обнаружено более 100 индивидуальных антигенов, однако, лишь 20...25 играют роль в иммунном ответе [3].
M. bovis и M. tuberculosis имеют 90.95 % антигенного родства, в свою очередь с M. avium у указанных видов оно не превышает 70.80 % и их можно четко дифференцировать по антигенному составу в серологических тестах [9].
Специалисты разных стран более 20 лет изучали белковые КФ, полученные культивацией M. bovis in vitro, для иммунологической идентификации и характеристики белков [3, 4, 13, 22]. Изготовление вакцин на основе белков КФ, секретируемых микобактериями туберкулеза, в связи с их более высокой иммуногенностью представлялось более перспективным, чем изготовление инактивирован-ных вакцин [2]. Готовились взвеси КФ для стимулирования защитного иммунного ответа у некоторых линий мышей и морских свинок [6, 18, 22, 23]. Выделение и оценка антигенов КФ была предметом интенсивных исследований различных научных лабораторий [5, 12, 13]. Результатом этой работы стало увеличение количества новых антигенов, таких как MPT59 [7, 17, 20], ESAT-6 [27], MPT64 [21], MTB12 [28], MTB8.4 [11], CFP29 [12], TB10.4 [26], TB9 [10] и др.
Широко обсуждалась природа внеклеточных белков из КФ, и белков, в которых предполагали наличие сигнальных последовательностей и присутствующих в КФ в больших количествах, например, MPT59, MPT44 , MPT45, MPT64, MPT51, MPT32, MPT53 [14, 30]. Белки, которые, очевидно, транспортируются другими механизмами, были также обнаружены в КФ, как описано для супероксиддисмутазы и глутамин-синтетазы [15, 16].
В дополнение к «подлинным» внеклеточным компонентам, такие белки, как PstS (38 кДа) и липоп-ротеин (19 кДа), медленно высвобождаются из клеточной оболочки в культуральную среду [8]. Некоторые белки, локализация которых ожидалась внутри клетки, такие как GroES и рибосомальный белок L7/L12, также обнаружены в КФ [7.18]. Это свидетельствует о том, что культуры M. bovis BCG [29] проявляют стойкость к аутолизу, а их КФ неизбежно содержит некоторые цитоплазматические компоненты.
Нами проведены исследования всего набора белков КФ с различным состоянием культур клеток, выращенных на синтетических питательных средах.
Цель исследования
Изучить белковый состав КФ микобактерий туберкулеза, выращенных с различным накоплением бактериальной массы на питательных средах.
Материалы и методы
Для наработки бактериальной массы использовали жидкие синтетические питательные среды для выращивания микобактерий туберкулеза (среды Павловского и Сотона).
Суспензии культуральных фильтратов и ультразвуковых дезинтегратов фракционировали с помощью колоночной гельхроматографии на колонках с сефа-дексом G-200 (колонки 21х2 и 22х2 см), границы фракционирования 800±5 кД. На колонку наносили по 3 мл образцов. Концентрацию белка определяли путем спектрофотометрии на двулучевом спектрофотометре «Pye Unicam SP-8000» (Англия) и рассчитывали по формуле:
C = 1,55 х А280 - 0,76 х А260 (мг/мл)
где: А280 и А260 — величины оптической плотности (поглощения): при 280 и 260 нм по методике D.A. Marris [19].
Изучение белков культуральных фильтратов микобактерий
Концентрацию нуклеотидов в фильтратах и суспензиях дезинтегратов рассчитывали по методике Спирина [1], осаждая белки хлорной кислотой:
Снк = ((А270 - А290)/0,19) х 10,1 (мкг/мл)
где: А270 и А290 — величины оптической плотности при 270 и 290 нм.
Спектры поглощения записывали на спектрофотометре «Pye Unicam SP-8000» (Англия).
Для более детального исследования низкомолекулярных фракций фракционировали надосадоч-ную жидкость суспензии ультразвуковых дезинтегратов, полученных в результате ультрацентрифугирования при 100000 g. Фракционировали с использованием геля TSK HW-40 Fine на хроматографе фирмы «LKB» (Швеция). Детектирование проводили при помощи ультрафиолетового оптического монитора «Uvicord — S II» при длине волны 254 нм.
Культуральный фильтрат отделяли от бактериальной массы, пропуская его через стерилизующие пластины. Бактериальную массу разбивали на ультразвуковой установке «УЗДН», пропускали через СФ-фильтры, после чего использовали для исследований.
Результаты и обсуждение
При хроматографии в нативном фильтрате культуры БЦЖ обнаружены нуклеотиды преимущественно с молекулярной массой от 8000 до 48000 Да. Наибольшая концентрация нуклеотидов — 17,0... 21,0 мкг/мл обнаружена во фракциях 16.18, что соответствует молекулярной массе 14000.30000 Да (рис. 1).
Молекулярную массу белковых и нуклеотид-ных частиц определяли по градуировочной прямой (табл. 1).
Чтобы изучить нуклеотидный состав дезинтегра-та, основную массу разрушенных клеточных субстанций и высокомолекулярных соединений осаждали центрифугированием при 100000 g. В надоса-дочной жидкости выделено 16 фракций, содержащих белки с диапазоном их молекулярных масс от 5 до 800 кД, однако практически половину (49,3 %) составляют низкомолекулярные белки с молекулярной массой 5.20 кД.
При анализе состава цитозоля, полученного после осаждения микросомальных фракций, пропущенного через TSK-GEL, выделено 8 белково-нуклеотид-ных фракций. На белки первой фракции приходилось 94,5 % удельного веса всей суспензии с молекулярной массой более 10 кД; на остальные семь фракций — 5,5 % удельного веса всей суспензии с молекулярной массой от 4,8 до 2,4 кД.
25
20
15
10
I J 5 7 9 11 13 15 17 19 2t 23 25 № фракнии
Рис. 1. Результаты фракционирования нативного культурального фильтрата на сефадексе G-200
1. Определение молекулярной массы фракций фильтратов и дезинтегратов при пропускании через сефадекс G-200
№ фракции Молекулярная масса, кД № фракции Молекулярная масса, кД
2 > 800 13 62
3 800 14 48
4 600 15 38
5 470 16 30
6 360 17 23
7 280 18 18
8 220 19 14
9 170 20 11
10 130 21 8,5
11 100 22 6,5
12 80 23 5
Выводы
Таким образом, нами впервые доказано, что в КФ выращенных микобактерий туберкулеза не существует экзогенных продуктов жизнедеятельности микобактерий белковой природы. При исследовании культуральных фильтратов БЦЖ, полученных после термической обработки, нами обнаружены ничтожно малые количества нуклеотидов от 17,0 до 21,0 мкг/мл с преимущественной молекулярной массой 14.30 кДа, которые появляются в процессе культивирования микобактерий.
A.M. Коваленко, Г.В. Сноз, В.М. Сапегин, В.Ю. Жабина, Р.Ю. Аничин
Библиография
1. Виноградова Р.П., Кучеренко Н.Е., Литвиненко А.Р. Бюлопчна хiмiя. — К.: Вища школа, 1977.
2. Еремеев В.В. Новая противотуберкулезная вакцина: мечта или реальность // Проблемы туберкулеза, 2001; 1: 53—55.
3. Лысенко А.П. Агеева Т.Н Карпова Г.А. Уровень антител к антигенам M. bovis и M. tuberculosis в сыворотках крови коров с реакциями на туберкулин // Сборник научн. трудов XI съезда фтизиатров РБ. — Минск, 1998.
4. Лысенко А.П. Антигены Mycobacterium bovis и атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Автореф. дис.... докт. вет. наук. — Минск, 1994.
5. Шаров А.Н., Лукава М.А., Лакман Э.Д. Антигены для реакции аглютинации при диагностике туберкулеза // Ветеринария, 1996; 1:15—17.
6. Andersen P. Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection with a soluble mixture of secreted mycobacterial proteins // Infect. Immun., 1994; 62: 2536—2544.
7. Andersen P., Andersen A.B., Sorensen, A.L., and Nagai S. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice // J. Immunol., 1995; 154:3359—3372.
8. Andersen P., Askgaard D., Ljungqvist L., Bennedsen J. and Heron I. Proteins released from Mycobacterium tuberculosis during growth // Infect. Immun., 1991; 59:1905—1910.
9. Benjamin R.G., Daniel T.M. Serodiagnosis of tuberculosis using ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) of antibody to Mycobacterium tuberculosis antigen // American Review of Respiratory Disease, 1982; 6 (126): 1013—1016.
10. Brandt L.K., Elhay M., Rosenkrands I. et al. // Infect.and Immun., 2000; 68: 791—795.
11. Coler R.N., Skeiky, Y.A., Vedvick, T., Bement, T., Campos-Neto, A., Alderson, M.R., and Reed, S.G. Molecular cloning and immunologic reactivity of a novel low molecular mass antigen of Mycobacterium tuberculosis // J. Immunol., 1998; 161: 2356—2364.
12. Daniel T.M., Debanne S.M. The serodiagnosis of tuberculosis and other mycobacterial diseases by enzyme-linked immunosorbent assay // American Review of Respiratory Disease, 1987; 135:1137—1151.
13. Harboe M. , Wiker H., Duncan J., Garcia M., Dukes T. Protein G-based enzyme-linked immunosorbent assay for anti-MPB70 antibodies in bovine tuberculosis // J. clin. microbiol., 1990; 28:913—921.
14. Harboe M., Whelan A., Ulvund G. Generation of antibodies to the signal peptide of the MPT83 lipoprotein of Mycobacterium tuberculosis // Scand. J. Immunol., 2002; 55 (1): 82—87.
15. Harth G. and Horwitz, M. A. Export of recombinant Mycobac-terium tuberculosis superoxide dismutase is dependent upon both information in the pro tein and mycobacterial export machinery. A model for studying export of leaderless proteins by pathogenic mycobacteria // J. Biol. Chem., 1999; 274:4281—4292.
16. Harth, G., and Horwitz, M.A. Expression and efficient export of enzymatically active Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase in Mycobacterium smegmatis and evidence that the information for export is contained within the protein // J. Biol. Chem., 1997; 272: 728—735.
17. Horwitz M.A., Lee B.-W. E., Dillon B.J., and Harth G. Protective immu nity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995; 92: 1530—1534.
18. Hubbard R.D., Flory C.M., and Collins F.M. Immunization of mice with mycobacterial culture filtrate proteins // Clin. Exp. Immunol., 1992; 87: 94—98.
19. Marris D. A. Spectrophotometric assaes in: Spectrophotometry and spectrofluometry // Washington: IRL Press, 1987.
20. Nagai S., Wiker, H.G., Harboe M., Kinomoto M. Isolation and partial characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun., 1991; 59:372—382.
21. Oettinger T., Holm A., Mtoni I.M., Andersen A.B., and Haslov K. Mapping of the delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted MPT64 from Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun., 1995; 63: 4613—4618.
22. Pal P.G. and Horwitz M.A. Immunization with extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis induces cell-mediated immune responses and substantial protective immunity in an guinea pig model of pulmonary tuberculosis // Infect. Immun., 1992; 60: 4781—4792.
23. Roberts A.D., Sonnenberg M.G., Ordway D.J., Fumey S.K., Bren-nan P.J., Belisle J.T., and Orme I.M. Characteristics of protective immunity engendered by vaccination of mice with purified culture filtrate protein antigens of Mycobacterium tuberculosis // Immunology, 1995; 85:502—508.
24. Rosenkrands I., Rasmussen P.B., Carnio M., Jacobsen S., Theisen M., Andersen P. Identification and characterization of a 29-kilo-dalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells // Infect. Immun., 1998; 66:2728—2735.
25. Rosenkrands I., Weldingh K., Jacobsen S., Hansen C.V., Florio W., Gianetri I., Andersen P. Mapping and identification of Mycobacterium tuberculosis proteins by two-dimensional electrophoresis, microsequencing and immunodetection // Electrophoresis, 2000; 21: 935—948.
26. Skjot R.L.V., Oettinger T., Rosenkrands I., Ravn P., Brock I., Jacobsen S., Andersen P. Comparative evaluation of low mass T-cell antigens from Mycobacterium tuberculosis identify ESAT-6 family members as immunodominant // Infect. Immun., 2000; 68: 214—220.
27. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P., and Andersen A.B. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis //Infect. Immun., 1995; 63: 1710—1717.
28. Webb J.R., Vedvick T.S., Alderson M.R., Guderian J.A., Jen, S.S., Ovendale, P.J., Johnson S.M., Reed S.G., Skeiky Y.A.W. Molecular cloning, expression, and immunognicity of MTB12, a novel low-molecular-weight antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun., 1998; 66: 4208—4214.
29. Wiker H.G., Harboe M., and Nagai S.A localization index for distinction between extracellular and intracellular antigens of Mycobacterium tuberculosis // J. Gen. Microbiol., 1991; 137: 875—884.
30. Wiker H.G., Michell S.L., Hewinson R.G., Spiering, E., Nagai S., Harboe M. Cloning, expression and significance of MPT53 for identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis // Microb. Pathog., 1999; 26: 207—219.
Summary
A.M. Kovalenko, G.V. Snoz, V.M. Sapegin, V.J. Zhabina, R.J. Anichin. Study of proteins isolated from Mycobacterium. More than 20 years scientists of the different countries study proteins mycobacterial cultural filtrates. Our researches establish protein-nucleinic structure cultural filtrates grown up mycobacterium of tuberculosis. Absence in the filtrates high-grade exogenous mycobacterium proteins is established.
