CC BY
21
1999, Г. 1, № 3-4
Иммунорегуляция
торов в жидкостях организма. Для многих из них общими свойствами являются положительный заряд и амфи-фильность структуры (наличие заряженной и гидрофобной поверхностей, важную роль в формировании подобной структуры играют внутримолекулярные дисуль-фидные связи).Эти свойства лежат в основе механизма действия антимикробных пептидов на клетки патогенов, они взаимодействуют с клеточной мембраной и нарушают ее целостность, что ведет к гибели клетки. Катионные антимикробные пептиды обладают высокой активностью против грам-положительных и грам-отрицатель-ных бактерий, грибов и некоторых оболочечных вирусов, а также широким спектром других биологических свойств. Изучение этих веществ способствует не только дальнейшему пониманию молекулярных механизмов в системе неспецифической защиты, но может предоставить проверенные временем молекулярные матрицы, которые могут быть использованы как новые терапевтические средства (антибиотики нового поколения). В поисках новых антимикробных пептидов, гомологичных уже ранее известным веществам, мы обратились к изучению целомоцитов пескожила (Arenicola marina). Пескожил принадлежит к сем. Arenicolidae, сем. Drylomorpha, класс Polychaeta, тип Annelida. Целомоциты Polychaeta проявляют способность к фагоцитозу и принимают участие в реакциях неспецифической защиты. Это дает основания ожидать наличия у них антимикробных факторов пептидной природы.
Цели и задачи работы. Задачей данной работы являлось выделение и очистка катионных пептидов из целомоцитов пескожила, изучение антимикробной активности и физико-химических характеристик фракций, проявляющих антимикробную активность.
Материалы и методы. Работа проводилась на материале, собранном на базе биостанции С.-ПбГУ на Белом море. Из пойманных животных выделялась целомическая жидкость с целомоцитами, которые отделялись центрифугированием. Выделение катионных пептидов осуществлялось с помощью набора препаративных (экстракция, ультрафильтрация, препаративный электрофорез в Г1ААГ, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, HPLC) и аналитических (электрофорез в ПААГ в присутствии SDS, электрофорез в ПААГ в кислой среде) биохимических методов, антимикробное тестирование проводилось in vitro, методом диффузии в агарозном геле, с использованием культур Е. coli и Listeria monocytogenes.
Основные результаты. В результате проведенной работы из целомоцитов пескожила выделены чистые фракции двух не известных ранее катионных полипептидов с молекулярной массой около 3 кДа. Показано, что пептиды содержит дисульфидные связи. В тест-системе по определению антимикробной активности выявлено, что они проявляют высокую (сравнимую с дефенсином кролика), активность по отношению к грам-положитель-ной бактерии Listeria monocytogenes и грам-отрицатель-ной бактерии E.coli.
Изучение антиростового и иммуносупрессорного действия синтетического декапептида, соответствующего адренокортикотропин-подобной последовательности IgGI человека
Наволоцкая Е.В., Лепихова Т.Н., Заргарова 'Г.А., Нуриева Р.И., Малкова Н.В., Липким В.М.
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Пущино, Россия
В начале 80-х годов сотрудники калифорнийского Института биологических исследований, пытаясь выделить из экстракта плаценты человека адренокортикотроп-ный гормон (АКТГ) и [3-эндорфин, использовали для этой цели, в качестве аффинных сорбентов, иммобилизованные антитела к данным гормонам. При этом ими был выделен полипептиде молекулярной массой 50 кДа, который при детальном анализе оказался тяжелой (Н) цепью IgG. Выяснение причин такого эффекта привело к обнаружению в Н-цепи последовательностей, гомологичных АКТГ и Р-эндорфину. Оказалось, что фрагмент 364-377 константной части Н-цепи IgG (SLTCLVKGFYPSD) имеет 40% гомологии с антигенной детерминантой P-3W^HHa(KSQTPLVTLFKNALKN), а фрагмент 9-22 вариабельной части Н-цепи IgG 1 (AEVK.K.PCSSVKVSC) на 36% гомологичен АКТГ(11-24) (KPVGKKRRPVKVYP). Американские исследователи синтезировали четыриад-цатичленный пептид, соответствующий р-эндорфин-по-добной последовательности IgG, и установили способность этого пептида взаимодействовать с опиоидными рецепторами головного мозга крысы.
Нами был синтезирован АКТГ-подобный декапептид (H-VKKPGSSVKV-OH), соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части Н-цепи IgGI человека (авторское название пептида- им-мунокортин). Проведенные эксперименты показали, что этот пептид способен с высоким сродством связываться с рецепторами к АКТГ и активировать аденилатциклазу синаптических мембран головного мозга мыши.
Цель данной работы: изучение влияния иммунокор-тина на активность клеток человеческой лимфобластной линии МТ-4 и мышиных тимоцитов и макрофагов in vitro.
Задача исследования: 1) изучение антиростового действия пептида на клетки МТ-4; 2) изучение рецепции пептида клетками МТ-4; 2) изучение влияния пептида на митоген-индуцированную пролиферацию тимоцитов; 3) изучение рецепции пептида тимоцитами; 4) изучение влияния пептида на фагоцитоз бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium перитонеальными макрофагами 415; 5) изучение влияния пептида на активность аденилатциклазы тимоцитов и макрофагов.
Методы исследования: радиолигандный анализ; культивирование клеток МТ-4 in vitro\ выделение и
"Дни иммунологии в СПб ‘99 ”
Медицинская иммунология
культивирование мышиных тимоцитов и макрофагов in vitro\ изучение фагоцитарной активности макрофагов in vitro\ определение активности аденилатцик-лазы.
Основные результаты. Установлено, что иммуно-кортин в концентрациях 10'" - 10'7 М ингибирует рост клеток человеческой лимфобластной линии МТ-4. С помощью |251-мечсного “адресного” фрагмента АКТГ -[|2,1]АКТГ( 13-24) показано, что клетки МТ-4 экспрессируют специфические рецепторы к АКТГ {Kd = 97 пМ). Иммунокортин и АКТГ человека, в отличие от тяжелой цепи IgGl, конкурентно ингибировали связывание [п,1] АКТГ( 13-24) с этими рецепторами = 0.38 нМ и
К , = 0.34 нМ соответственно). Изучение влияния имму-нокортина на активность иммунокомпетентных клеток мышн показало, что он подавляет бластную трансформацию тимоцитов, снижает спонтанную подвижность перитонеальных макрофагов и их бактерицидность по отношению к бактериям вирулентного штамма Salmonella typhimurium 415. С помощью [|251]АКТГ(13-24) натимоцитах мыши обнаружены и охарактеризованы специфические рецепторы к АКТГ (Ktl = 5.8 нМ). Показано, что немеченный иммунокортин конкурируете меченым АКТГ( 13-24) за связывание с этими рецепторами (К1 = 1.8 нМ). Установлено, что связывание им-мунокортина с рецепторами на тимоцитах приводит к активации аденилатциклазы этих клеток и к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ. Аналогичные результаты были получены для перитонеальных макрофагов.
Заключение: синтезирован АКТГ-подобный декапептид H-VKKPGSS VKV-OH, соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжелой цепи IgG 1 человека, обладающий антиросто-вой и иммуносупрессорной активностью in vitro.
Атеросклероз: реакганты острой фазы воспаления в патогенезе заболевания
Назаров П.Г., Косицкая JI.C., Полевщнков А.В., Галкина Е.В., Петров И.В., Денисенко А.Д.,
Нагорнев В.А., Рабинович B.C., Васильева JT.E.
Институт экспериментальной медицины РАМН Санкт-Петербург, Россия
Известно, что инфекционные заболевания и воспалительные процессы являются фактором риска развития атеросклероза, а факторы “иммунного воспаления” принимают участие в его патогенезе. Наше внимание привлекли белки острой фазы воспаления семейства пентраксинов: они имеют сродство к фосфорилхолину и способствуют депозиции липопротеинов в стенках сосудов. Была изучена роль одного из них - С-реактив-ного белка (СРБ) в механизме возникновения аутоиммунного ответа на атерогенные липопротеины плазмы. Установлено, что СРБ индуцирует у животных продукцию аутоантител к апо В-содержащим липопротеи-
нам (ЛПНГ1 и ЛПОНП) и продукцию антиидиотипичес-ких антител (анти-анти-апо-В). Кроме того, показано, что содержание кроликов на диете, богатой холестерином, в отсутствие каких-либо других воздействий, способных вызвать воспалительную реакцию, приводит к повышению в крови уровня СРБ и другого пентракси-на, сывороточного амилоида Р, и к развитию иммуно-морфологических изменений в печени, характерных для начальных этапов атеросклероза. Полученные данные позволяют заключить, что если у низших животных пен-траксины играют исключительно протективную роль, то у млекопитающих и у человека, где эти белки действуют в эволюционно усложнившемся иммунологическом окружении, платой за их участие в ранних событиях защиты становятся отдаленные негативные последствия, одним из которых является атеросклероз. Работа поддержана грантами РФФИ 98-04-49695 и 97-04-48012.
О влиянии перфторорганических соединений, применяемых в офтальмологии, на жизнеспособность фибробластоподобных клеток in vitro
Никитина ЕЛО.Соколов Д.И.Голубев С.Ю.2, Шишкин М.М.2,Фрейдлин И.С.1
'Институт экспериментальной медицины РАМН, отдел иммунологии;
■’Военно-медицинская академия, кафедра офтальмологии
Одним из осложнений травм глаза является отслойка сетчатки, возникающая вследствие пролиферативной витреоретинопатии. Её признаками являются поегтрав-матическая пролиферация фибробластов и повышенный синтез коллагена, причины которых не до конца изучены. Нельзя исключить, что применяемые в офтальмологии перфтороорганические соединения могут вызывать ретино- или нейропатии. В связи с этим представляет интерес влияние на жизнеспособность и пролиферацию клеток отдельных препаратов, вводимых в глаз в ходе оперативного вмешательства.
Мышиные фибробластоподобные клетки линии L929 инкубировали в присутствии препаратов, содержащих перфторовые соединения (“Перфтордекалин”, “6 МФ-130”, “6 МФ-240”, “Перфтороктилбромид”, “Перфтор-N-октан”), взятых в различных (от 1% до 100%) объёмных соотношениях с привычной для этих клеток средой, в течение 24 часов. Жизнеспособные клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым. На основании оптических плотностей рассчитывали индекс цитотоксичности (ИЦ). Учитывая изменения ИЦ под влиянием акти-номицина Д (5 мкг/мл), вызывающего остановку пролиферации, в его отсутствие снижение числа жизнеспособных клеток на 10-40% расценивали как возможный цитотоксический эффект; более, чем на 40% — как несомненный.
