CC BY
29
ных Т-клеток присутствуют маркеры, характерные для T-клеток памяти. Са2"-парадокс-резистентные Т-клетки и иономицин-резистенгные Т-клетки обладали функциональными свойствами Т-клеток памяти, а именно: они способны к антиген-специфическому пролиферативному ответу, оказывают помощь В-клеткам при синтезе антител и адаптивно переносят реципиентам резистентность к М. tuberculosis и к N. meningitidis.
Контроль выживания Т-лимфоцитов: роль аутокринных факторов
Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г., Сапожников А.М.
Инст итут биоорганической химии
им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Москва, Россия
Введение. Выживание и гибель нормальных клеток млекопитающих находятся под “социальным” контролем, суть которого заключается в том, что клетка, для своего выживания, должна постоянно получать сигналы от других клеток. Если она не получает таких сигналов, запускается механизм программируемой гибели, и клетка выбывает из клеточного сообщества.
Цель и задачи. Целью данной работы было исследование роли аутокринных факторов (АФ) в “социальном” контроле выживания Т-лимфоцитов. Задачами работы были: разработка простой экспериментальной системы, позволяющей тестировать влияние АФ на выживание Т-клеток, и непосредственное изучение на данной модели механизмов действия АФ.
Материалы и методы. Среда для культивирования клеток, приготовленная на основе RPMI-1640, содержала 2мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 5x10'5 М 2-меркаптоэтанола, 5% эмбриональной сыворотки теленка и 100 Ед/мл интерлейкина-2. В качестве клеточной модели использовали IL-2-зависимую Т-клеточную линию CTLL-2. Выживание клеток оценивали с использованием МТТ-теста. Уровень апоптозных клеток определяли с использованием цитофлуориметра по наличию гиподиплоидного пика при окрашивании клеток пропидиум йодидом.
Основные результаты. Для исследования роли АФ в социальном контроле выживания Т-клеток нами была предложена экспериментальная модель с прекультивированием клеток в течение 12-14 часов в культуре высокой плотности (ВП, 2x106 клеток/см1), характеризуемой повышенной концентрацией АФ, и последующим их переносом в свежей среде в культуру низкой плотности (НП, 2x10s клеток/см1). После такого переноса 80-100% клеток CTLL-2 погибало в течение 3-5 часов. Среди клеток, взятых из ВП-культуры, доля апоптозных клеток составляла не более 10%, и она не увеличивалась после их переноса в НП-культуру, что указывает на то, что клеточная гибель осуществляется по механизму некроза. Внесение во вторичную культуру кондиционированного супернатанта (КС, надосадка культуры высокой плот-
ности, содержащего АФ) предотвращало гибель клеток. Некроз клеток после их переноса в НП-культуру указывает на нарушение энергетического метаболизма как на возможную причину их гибели. Ингибиторный анализ, проведенный с использованием цитохалазина В, ингибитора транспорта глюкозы, и ингибиторов окислительного фосфорилирования антимицина А и азида натрия показал, что главную роль в энергетическом метаболизме клеток СТЬЬ-2, перенесенных из ВП-культуры в НП-культуру и спасенных от гибели добавлением КС, играет гликолиз как и в случае нормальных Т-лимфоцитов. Вместе с тем, оказалось, что в отсутствие КС пиру-ват, субстрат цикла Кребса, также обладает способностью спасать клетки от некроза, вызванного их переносом из ВП-культуры в НП-культуру. Внесение 1 мМ пирува-та во вторичную культуру сохраняло выживание клеток после переноса на уровне 75%-80%. Более того: если клетки СТЬЬ-2 ранее культивировали в присутствии пи-рувата, то их прекультивирование в ВП-культуре и последующий перенос в НП-культуру, содержащую пиру-ват, никак не сказывались на их выживании, которое сохранялось на уровне не ниже 95%.
Заключение. Полученные результаты указывают на то, что аутокринные факторы способны контролировать выживание клеток СТЬЬ-2, причем после прекультиви-рования клеток в условиях высокой концентрации АФ (ВП-культура) они адаптируются к этим условиям и при попадании в культуру с низким содержанием АФ (НП-культура со свежей средой) погибают по механизму некроза. Кроме того, представленные данные свидетельствуют в пользу того, что АФ осуществляют свое действие через контроль транспорта глюкозы и/или гликолиза, в то время как пируват, переключая энергетический метаболизм с гликолиза на окислительное фосфо-рилирование, выводит клетки из под контроля АФ.
Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (фанг 99-04-49620).
Изучение антимикробных пептидов животных
Матукова А.Д., Алешина Г.М., Кокряков В.Н.
НИИ экспериментальной медицины РАМН Санкт-Петербург, Россия
Введение. Антимикробные пептиды животных являются ведущими компонентами системы врожденного иммунитета, который обеспечивает защиту от патогенных микроорганизмов сразу же после заражения и помогает поддерживать определенный состав естественной микрофлоры.
В настоящее время охарактеризовано около 100 полипепетидов и белков с антимикробными свойствами выделенных из различных видов позвоночных и беспозвоночных животных, среди которых имеются пептиды —как локализованные в лизосомах фагоцитарных клеток, так и присутствующие в виде гуморальных фак-
1999, Г. 1, № 3-4
Иммунорегуляция
торов в жидкостях организма. Для многих из них общими свойствами являются положительный заряд и амфи-фильность структуры (наличие заряженной и гидрофобной поверхностей, важную роль в формировании подобной структуры играют внутримолекулярные дисуль-фидные связи).Эти свойства лежат в основе механизма действия антимикробных пептидов на клетки патогенов, они взаимодействуют с клеточной мембраной и нарушают ее целостность, что ведет к гибели клетки. Катионные антимикробные пептиды обладают высокой активностью против грам-положительных и грам-отрицатель-ных бактерий, грибов и некоторых оболочечных вирусов, а также широким спектром других биологических свойств. Изучение этих веществ способствует не только дальнейшему пониманию молекулярных механизмов в системе неспецифической защиты, но может предоставить проверенные временем молекулярные матрицы, которые могут быть использованы как новые терапевтические средства (антибиотики нового поколения). В поисках новых антимикробных пептидов, гомологичных уже ранее известным веществам, мы обратились к изучению целомоцитов пескожила (Arenicola marina). Пескожил принадлежит к сем. Arenicolidae, сем. Drylomorpha, класс Polychaeta, тип Annelida. Целомоциты Polychaeta проявляют способность к фагоцитозу и принимают участие в реакциях неспецифической защиты. Это дает основания ожидать наличия у них антимикробных факторов пептидной природы.
Цели и задачи работы. Задачей данной работы являлось выделение и очистка катионных пептидов из целомоцитов пескожила, изучение антимикробной активности и физико-химических характеристик фракций, проявляющих антимикробную активность.
Материалы и методы. Работа проводилась на материале, собранном на базе биостанции С.-ПбГУ на Белом море. Из пойманных животных выделялась целомическая жидкость с целомоцитами, которые отделялись центрифугированием. Выделение катионных пептидов осуществлялось с помощью набора препаративных (экстракция, ультрафильтрация, препаративный электрофорез в Г1ААГ, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, HPLC) и аналитических (электрофорез в ПААГ в присутствии SDS, электрофорез в ПААГ в кислой среде) биохимических методов, антимикробное тестирование проводилось in vitro, методом диффузии в агарозном геле, с использованием культур Е. coli и Listeria monocytogenes.
Основные результаты. В результате проведенной работы из целомоцитов пескожила выделены чистые фракции двух не известных ранее катионных полипептидов с молекулярной массой около 3 кДа. Показано, что пептиды содержит дисульфидные связи. В тест-системе по определению антимикробной активности выявлено, что они проявляют высокую (сравнимую с дефенсином кролика), активность по отношению к грам-положитель-ной бактерии Listeria monocytogenes и грам-отрицатель-ной бактерии E.coli.
Изучение антиростового и иммуносупрессорного действия синтетического декапептида, соответствующего адренокортикотропин-подобной последовательности IgGI человека
Наволоцкая Б.В., Лепихова Т.Н., Заргарова 'Г.А., Нуриева Р.И., Малкова Н.В., Липким В.М.
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. ШемякииаиЮ.А. Овчинникова РАН Пущино, Россия
В начале 80-х годов сотрудники калифорнийского Института биологических исследований, пытаясь выделить из экстракта плаценты человека адренокортикотроп-ный гормон (АКТГ) и [3-эндорфин, использовали для этой цели, в качестве аффинных сорбентов, иммобилизованные антитела к данным гормонам. При этом ими был выделен полипептиде молекулярной массой 50 кДа, который при детальном анализе оказался тяжелой (Н) цепью IgG. Выяснение причин такого эффекта привело к обнаружению в Н-цепи последовательностей, гомологичных АКТГ и Р-эндорфину. Оказалось, что фрагмент 364-377 константной части Н-цепи IgG (SLTCLVKGFYPSD) имеет 40% гомологии с антигенной детерминантой Р-эндорфина (KSQTPLVTLFKNALKN), а фрагмент 9-22 вариабельной части Н-цепи IgG 1 (AEVK.K.PCSSVKVSC) на 36% гомологичен АКТГ(11-24) (KPVGKKRRPVKVYP). Американские исследователи синтезировали четыриад-цатичленный пептид, соответствующий р-эндорфин-по-добной последовательности IgG, и установили способность этого пептида взаимодействовать с опиоидными рецепторами головного мозга крысы.
Нами был синтезирован АКТГ-подобный декапептид (H-VKKPGSSVKV-OH), соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части Н-цепи IgGI человека (авторское название пептида- им-мунокортин). Проведенные эксперименты показали, что этот пептид способен с высоким сродством связываться с рецепторами к АКТГ и активировать аденилатциклазу синаптических мембран головного мозга мыши.
Цель данной работы: изучение влияния иммунокор-тина на акгивность клеток человеческой лимфобластной линии МТ-4 и мышиных тимоцитов и макрофагов in vitro.
Задача исследования: 1) изучение антиростового действия пептида на клетки МТ-4; 2) изучение рецепции пептида клетками МТ-4; 2) изучение влияния пептида на митоген-индуцированную пролиферацию тимоцитов; 3) изучение рецепции пептида тимоцитами; 4) изучение влияния пептида на фагоцитоз бактерий вирулентного штамма Salmonella typhimurium перитонеальными макрофагами 415; 5) изучение влияния пептида на активность аденилатциклазы тимоцитов и макрофагов.
Методы исследования: радиолигандный анализ; культивирование клеток МТ-4 in vitro\ выделение и
